与植物产量提高和品质改良相关的蛋白及编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种与植物产量提高和品质改良相关的蛋白及编码基因与应用。本发明所提供的蛋白是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将（a）所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与提高植物产量和改良植物品质相关的蛋白质。实验证明，本发明所提供的蛋白可以提高种子单株产量、百粒重、种子大小、脂肪含量，以及株高。本发明在培育高产和高油植物新品种方面具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种与植物产量提高和品质改良相关的蛋白及编 码基因与应用。

背景技术

随着人口的不断增长，全球粮食消费量一直高于产量，据预测到2030年粮食需求 将会提高30%至40%，因此只有不断提高粮食作物的产量，才能满足不断增长的粮食 需求。随着经济水平的不断提高，人们对粮食品质的要求也在提高，需要食用品质更 好，营养更丰富的食物。

大豆是一种重要的粮食作物和油料作物，也是人类的主要食用蛋白、工业原料和 保健药品的来源。大豆种子含有40%的蛋白和20%的油脂。此外也富含大量的生理活 性物质如异黄酮、卵磷脂、维生素E、皂苷类等。近年来，人们对富含蛋白、油及其 他保健成分的大豆的消费在不断增加，使得增加大豆的供应迫在眉睫。尽管大豆产量 在不断提高，但相比其他主要作物，大豆产量还有很大的增长潜力，油脂和蛋白的成 分也有很大的提升空间。现代生物工程技术可以打破生物之间的界限来实现遗传物质 的重新组合，按照人类预先设计改造生物，使之符合人类的需要。将生物工程技术与 传统育种技术相结合，可以提高大豆产量和改良大豆品质。因此，寻找能够提高大豆 产量和改良大豆品质的基因，用于大豆遗传改良和品种培育，对增加大豆的供给具有 重要的现实意义。

核因子-Y（NF-Y）是一种通过调控因子相互作用来调控下游基因表达的转录因子。 NF-Y转录因子含有保守专一性的序列，该序列和真核生物启动子区域的CCAAT框相 结合。在多物种中，数目上，CCAAT盒都是高度保守的同源基因序列。在所有真核生 物中，CCAAT盒转录调节组件是一个顺式调控元件，并且存在于约30%的基因的启 动子区域。基因表达模式也可以是组织或阶段特异性的，也可以由其他顺式和反式作 用因子决定，而由包含CCAAT盒的启动子来控制基因的表达可能是无处不在的。多 个反式作用因子与CCAAT盒相联系，但只有核因子NF-Y是和CCAAT这5个核苷 酸相结合。在拟南芥中，NF-Y转录因子LEC1调控种子储藏蛋白基因和其他一些下游 的靶基因的表达，过量表达LEC1导致脂肪酸合成基因的全面上调表达。在油菜中过 表达BnLEC1和BnL1L基因能提高种子含油量2%-20%。在玉米中过表达ZmLEC1 基因能提高种子含油量48%。NF-YB6为类LEC1基因，在拟南芥中可以互补LEC1 的突变，与LEC1功能重叠。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物产量提高和品质改良相关的蛋白及编码基因与应 用。

本发明所提供的蛋白质，名称为GmNFYB6L，来源于大豆（Glycine max(L.)Merr.） 品种中豆29，是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将（a）所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加，且与提高植物产量和改良植物品质相关的蛋白质。

为了便于GmNFYB6L蛋白的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列 组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL

上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一 个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

编码所述GmNFYB6L蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子 也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述GmNFYB6L蛋白的基 因（命名为GmNFYB6L）；所述GmNFYB6L基因是如下1）至4）中任一所述的DNA 分子：

1）编码序列为序列表中序列2的第41-721位所示的DNA分子；

2）序列为序列表中序列2所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码所述GmNFYB6L蛋白 的DNA分子；

4）与1）-3）中任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述GmNFYB6L 蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC， 0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，序列2由851个核苷酸组成，第41-721位为ORF，编码序列表中序列1 所示的GmNFYB6L蛋白。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的 保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农 杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、 pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生 植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺 苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可 引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转 录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如 花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子（pUbi）、胁迫诱 导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用 本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子， 这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列 的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源 是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或 结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载 体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、 具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因， 直接以逆境筛选转化植株。

在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述GmNFYB6L基因转录的启动 子具体为35S启动子。

更为具体的，所述重组表达载体为在pB2GW7载体的attR1和attR2位点间插入 所述GmNFYB6L基因得到的重组质粒。

所述表达盒由能够启动所述GmNFYB6L基因表达的启动子，所述GmNFYB6L基 因，以及转录终止序列组成。

所述GmNFYB6L蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒、转基 因细胞系或重组菌在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

（1）调控植物产量；

（2）调控植物品质；

（3）调控植物株高；

（4）选育产量提高的植物品种；

（5）选育品质提高的植物品种；

（6）选育株高增高的植物品种。

在所述应用中，所述产量具体可体现在如下（b1）-（b3）中的至少一种；所述品 质具体可体现在如下（b4）：

（b1）植物种子的单株产量；

（b2）植物种子的百粒重；

（b3）植物种子的体积；

（b4）植物种子的脂肪含量。

在本发明中，所述调控植物产量体现在：在所述植物体内，若所述GmNFYB6L 蛋白或其编码基因的表达量越高，则所述植物种子的单株产量、百粒重和体积越大。 所述调控植物品质体现在：在所述植物体内，若所述GmNFYB6L蛋白或其编码基因 的表达量越高，则所述植物的种子中脂肪的含量越高。所述调控植物株高体现在：在 所述植物体内，若所述GmNFYB6L蛋白或其编码基因的表达量越高，则所述植物的 株高越高。

在本发明中，所述选育产量提高的植物品种的方法、所述选育品质提高的植物品 种的方法，以及所述选育株高增高的植物品种的方法，均具体可包括将所述 GmNFYB6L蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：

a）向目的植物中导入所述GmNFYB6L蛋白的编码基因，得到表达所述编码基因 的转基因植物；

b）从步骤a）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，具有如下a1）-a3） 目的性状中至少一种的转基因植物：

a1）植物产量提高；

a2）植物品质提高；

a3）植物株高增高。

在所述方法中，所述产量体现在如下（b1）-（b3）中的至少一种；所述品质体现 在如下（b4）：

（b1）植物种子的单株产量；

（b2）植物种子的百粒重；

（b3）植物种子的体积；

（b4）植物种子的脂肪含量。

所述GmNFYB6L蛋白在所述转基因植物中的表达量高于所述目的植物；编码所 述GmNFYB6L蛋白的基因（即GmNFYB6L基因）是所述基因是如下1）至4）中任 一所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列2的第41-721位所示的DNA分子；

2）序列为序列表中序列2所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码所述GmNFYB6L蛋白 的DNA分子；

4）与1）-3）中任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述GmNFYB6L 蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC， 0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

所述GmNFYB6L基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物 中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接 DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达 载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。农杆菌介导等生物学方 法转化到植物细胞或组织中。

在上述应用或方法中，所述植物可为双子叶植物，也可为单子叶植物。在本发明 中，所述植物为大豆，具体为大豆品种东农50。

实验证明，将含有序列表序列2所示DNA分子的重组表达载体 pB2GW7-GmNFYB6L转化大豆得到的T2代纯合转基因植株的种子单株产量、百粒重、 种子大小、脂肪含量，以及株高均明显高于相同条件下的野生型大豆。本发明在培育 高产和高油植物新品种方面具有重要意义。

附图说明

图1为T2代纯合GmNFYB6L转基因的大豆株系（TL1-TL5）植株的PCR检测结果。 其中，M为分子量标准，从上至下的条带大小依次为5000、3000、2000、1000、750、 500bp、250bp；泳道1-5分别为TL1-TL5株系；泳道6为未转基因的大豆（Glycine max(L.) Merr.）品种东农50（WT）；泳道7为以水做模板的空白对照。泳道8为重组载体 pB2GW7-GmNFYB6L阳性对照。

图2为T2代纯合转pB2GW7空载体的大豆株系（CK1-CK5）植株的PCR检测结果。 其中，M为分子量标准，从上至下的片段大小依次为2000、1000、750、500、250、 100bp；泳道1-5分别为CK1-CK5株系植株；泳道6为未转基因的大豆（Glycine max(L.) Merr.）品种东农50（WT）；泳道7为以水做模板的空白对照。泳道8为重组载体 pB2GW7-GmNFYB6L阳性对照。

图3为各大豆遗传材料中目的基因GmNFYB6L的相对表达量测定结果。其中，A 为T2代纯合GmNFYB6L转基因大豆株系（TL1-TL5）的叶片中目的基因GmNFYB6L的 相对表达量测定结果（以内参基因β-actin的表达量为1）。WT表示未转基因的大豆 （Glycine max(L.)Merr.）品种东农50。B为未转基因的大豆（Glycine max(L.)Merr.） 品种东农50的种子和叶片中内源GmNFYB6L的相对表达量测定结果（以内参基因 β-actin的表达量为1）。

图4为T2代纯合GmNFYB6L转基因大豆株系的表型鉴定结果。其中，CK表示T2代 纯合转pB2GW7空载体的大豆株系CK1；GmNYFB6L表示T2代纯合GmNFYB6L转基因 大豆株系TL3。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，T0代表示转化当代的植株；T1代表示T0代自交产生的种子及 由它所长成的植株；T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株。

大豆（Glycine max(L.)Merr.）品种东农50：记载于“Paz MM,Martinez JC,Kalvig  AB,Fonger TM,Wang K.Improved cotyledonary node method using an alternative explant  derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation. Plant Cell Rep.2006;25:206–213”一文，公众可从中国农业科学院油料作物研究所获得。

pB2GW7载体：在载体pB2GW7的T-DNA片段上含有致死基因ccdB，其两侧含 LR反应的识别序列。该载体购自VIB（网址：http://www.psb.ugent.be/gateway)。

根癌农杆菌GV3101：记载于“Amanda M Davis,Anthony Hall,Andrew J Millar, ChiarinaDarrah and SethJ Davis,Protocol:Streamlined sub-protocols for floral-dip transformationand selection of transformants in Arabidopsis thaliana,2009,5:310.1186/ 1746-4811-5-3”一文，公众可从中国农业科学院油料作物研究所获得。

Gateway试剂盒：为invitrogen公司产品，其产品目录号为11789-100。试剂盒中 有BP反应酶混合物（BP Clonase^TMenzyme mixture）和LR反应酶混合物（LR Clonase^TMenzyme mixture）。

pDONR-Amp载体：作为供载体（donor vector）。记载于“Ming Li,Bo Ding,Junbin  Wang,Wenli Yang,Rui Wang,Shuguang Bao,Silin Zhong,Xiaodong Xie.Wheat  TaWRKY10-1is involved in biological responses to the salinity and osmostresses in  transgenic Arabidopsis plants.Australian Journal of Crop Science.AJCS7(6):723-729 (2013)”一文中的“the pDONR(Amp')vector”一文，公众可从中国农业科学院油料作 物研究所获得。

实施例1、大豆蛋白GmNFYB6L及其编码基因的获得

取田间生长的大豆（Glycine max(L.)Merr.）品种中豆29开花后15d的幼嫩种子 提取总RNA，并反转录获得cDNA，以该cDNA为模板，在引物PF和引物PR的引 导下，用常规PCR法进行扩增。

PF：5’-CGAGGCTCTTATAATCACACACAC-3’（序列2的第1-24位）；

PR：5’-ACTCCCTTCCCAGCCCTT-3’（序列2的第834-851位的反向互补序列）。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。回收并纯化约850bp 的DNA片段，进行序列测定。

测序结果显示，所得PCR产物的序列为序列表中序列2，将该基因命名为 GmNFYB6L。序列2的第41-721位为其开放阅读框，编码序列表中序列1所示的蛋白 质（命名为GmNFYB6L）。

实施例2、GmNFYB6L转基因大豆的获得及鉴定

一、重组表达载体pB2GW7-GmNFYB6L的获得及鉴定

采用LR反应将实施例1获得的GmNFYB6L基因（序列2）连接到pB2GW7载体， 获得重组载体pB2GW7-GmNFYB6L。具体操作如下：

1、attB-PCR产物的获得

（1）以实施例1获得的GmNFYB6L基因（序列2）为模板，用引物attB-GmNFYB6L-F 与引物attB-GmNFYB6L-R进行PCR扩增，反应结束后对其产物（记为attB-1-PCR产 物）进行纯化。

（2）以步骤（1）所得attB-1-PCR产物为模板，用引物attB-adapter-F与引物 attB-adapter-R进行PCR扩增，反应结束后对其产物（记为attB-PCR产物）进行纯化。

attB-GmNFYB6L-F：5’-GCAGGCTTC CGAGGCTCTTATAATCACACACAC-3’（下 划线部分为中间载体pDONR-Amp序列，其后的序列为序列2的第1-24）；

attB-GmNFYB6L-R：5’-AGCTGGGTC ACTCCCTTCCCAGCCCTT-3’（下划线部分 为中间载体pDONR-Amp序列，其后的序列为序列2的第834-851位的反向互补序列）；

attB-adapter-F：5’-GGGGACAAGT TTGTACAAA AAAGCAGGCTTC-3’（下划线 部分为中间载体pDONR-Amp序列，其后的序列与attB-GmNFYB6L-F引物中下划线部 分一致）；

attB-adapter-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3’（下划线部 分为中间载体pDONR-Amp序列，其后的序列与attB-GmNFYB6L-R引物中下划线部 分一致）；

2、BP反应

BP反应体系：

25℃温浴反应16h。

BP反应目的基因克隆的筛选及鉴定，如下：

1）取BP反应产物5μl转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，37℃倒置培养12-16h （培养基为Amp抗性）；

2）挑取单克隆，37℃180-200rpm摇菌培养（附加50μg/ml Amp）；

3）提取质粒，用M13引物（M13F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’；M13R： 5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’）或基因特异引物（PF：5’- CGAGGCTCTTATAATCACACACAC-3’；PR：5’-ACTCCCTTCCCAGCCCTT-3’）检 验阳性克隆。

4）通过对测序后的克隆与原始序列（序列2）进行比对，将经测序表明在 pDONR-Amp载体的attP1和attP2之间插入序列表中序列2所示DNA片段的重组质 粒命名为pDONR-Amp-GmNFYB6L，重组质粒pDONR-Amp-GmNFYB6L即为 GmNFYB6L基因的入门载体。

3、LR反应

将步骤2获得的大豆GmNFYB6L基因的入门载体pDONR-Amp-GmNFYB6L进行 LR反应，反应体系如下：

25℃温浴16h。

LR反应目的基因克隆的筛选及鉴定，如下：

1）取LR反应产物5μl转化大肠杆菌DH5a的感受态细胞，37℃倒置培养12-16h （培养基为壮观霉素抗性）；

2）挑取单克隆，37℃180-200rpm摇菌培养（附加50μg/ml壮观霉素）；

3）提取质粒，用基因特异引物（PF：5’-CGAGGCTCTTATAATCACACACAC-3’； PR：5’-ACTCCCTTCCCAGCCCTT-3’）检测阳性克隆。

4）通过对测序后的克隆与原始序列（序列2）进行比对，将经测序表明在pB2GW7 载体的attR1和attR2位点间插入了序列表序列2所示DNA片段的重组质粒命名为 pB2GW7-GmNFYB6L。在重组表达载体pB2GW7-GmNFYB6L中，启动所述 GmNFYB6L基因转录的启动子为35S启动子。

二、GmNFYB6L转基因大豆的获得及鉴定

1、重组根癌农杆菌的获得

将步骤一获得的重组表达载体pB2GW7-GmNFYB6L通过冻融法转化根癌农杆菌 GV3101，对转化后的重组农杆菌用由引物PF和PR（序列同上）组成的引物对进行PCR 鉴定。将经鉴定表明含有GmNFYB6L基因（PCR目的条带大小约为851bp）的农杆菌 GV3101命名为GV3101/pB2GW7-GmNFYB6L。

同时设置转入pB2GW7空载体的对照。将转入pB2GW7空载体的农杆菌GV3101 命名为GV3101/pB2GW7。

2、GmNFYB6L转基因大豆的获得

利用步骤1获得的两种重组农杆菌GV3101/pB2GW7-GmNFYB6L和 GV3101/pB2GW7，分别用农杆菌介导的子叶节再生法转化大豆（Glycine max(L.) Merr.）品种东农50，获得T2代纯合转基因Gm GmNFYB6L的大豆株系5个，T2代纯合 转空载体的大豆系5个。具体方法如下：

（1）取重组农杆菌GV3101/pB2GW7-GmNFYB6L或GV3101/pB2GW7，在含利福 平30μg/ml、庆大霉素（50μg/ml）和壮观霉素（100μg/ml）的YEP固体培养基平板上 划线，挑取单克隆接种于2ml含有相应抗生素的YEP液体培养基中28℃培养24-28小时 后按1：1000的比例（体积比）加入新鲜YEP液体培养基，28℃摇床中培养至OD600 约1.2-1.5，离心去上清后沉淀用等体积液体培养基（配方：1/10B5盐+B5有机+MES 5.9g/L+蔗糖30g/L+乙酰丁香酮30mg/L+6-BA1.67mg/L+GA₃0.25mg/L，pH5.4。各物 质的浓度均为相应物质在培养基中的终浓度）重悬，于28℃，140rpm培养30分钟待用。

（2）将大豆（Glycine max(L.)Merr.）品种东农50的种子消毒后除去种皮，去除 下胚轴约3mm，纵切子叶节，去除连接子叶节的顶芽，得到外植体。将外植体置入步 骤（1）的农杆菌中悬浮浸染30分钟，沥干农杆菌后转入固体共培养基中，平面向上， 24℃，18小时光照/6小时黑暗培养3-5天，转入诱导培养基中，平面向上，每皿8-10个 外植体，25℃，18小时光照/6小时黑暗培养14天，转入新鲜诱导培养基中，培养14天。 去除子叶，下胚轴去除一层，留出新鲜伤口，置于伸长培养基中，每2周更换一次培养 基，培养条件同诱导。将伸长2-3厘米的枝条基部浸入无菌IBA（1mg/ml）溶液数秒， 转移入生根培养基中。待生根后转移花盆中。待小苗长出2-3片新生叶后，用浓度为 100mg/ml的草丁膦溶液涂抹于叶表，筛选抗性苗（T0代）。

其中，固体共培养基的配方：1/10B5盐（大量元素+微量元素）+B5维生素+2-吗 啉代乙磺酸(MES)5.9g/L+蔗糖30g/L+乙酰丁香酮30mg/L+二硫巯基苏糖醇(DTT) 150mg/L+L-半胱氨酸150mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.67mg/L+赤霉素(GA₃) 0.25mg/L+真菌抑制剂（菌抑）100mg/L，琼脂4.5g/L，pH5.4。各物质的浓度均为相 应物质在培养基中的终浓度。

诱导培养基的配方：B5培养基3.2g/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+MES0.59g/L， pH5.8，灭菌后，加入头孢霉素200mg/L，特美汀（tim）100mg/L，万古霉素（van） 50mg/L，菌抑200mg/L，草丁膦（PPT）5mg/L，6-苄氨基嘌呤（BA）1.1mg/L。

伸长培养基的配方：MS盐（大量元素+微量元素）+B5维生素+琼脂8g/L+蔗糖 30g/L+MES0.59g/L，pH5.8，灭菌后，加入头孢霉素200mg/L，特美汀100mg/L，万 古霉素50mg/L，天冬氨酸50mg/L，L-焦谷氨酸50mg/L，菌抑200mg/L，草丁膦5mg/L， 反玉米素核苷0.5mg/L，赤霉素0.5mg/L。

生根培养基的配方：MS盐（大量元素+微量元素）+B5维生素+琼脂8g/L+蔗糖 20g/L+MES0.59g/L，pH5.7。

3、GmNFYB6L转基因大豆的鉴定

（1）PCR鉴定

A.GmNFYB6L转基因大豆的鉴定

从步骤2获得的抗性苗（T0代）—GmNFYB6L转基因大豆的叶片中提取DNA，用 引物Bar-F和Bar-R对Bar基因进行PCR扩增，目的产物大小为450bp，将扩增产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳，将获得450bp条带的植株记为阳性。

Bar-F：5’-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3’；

Bar-R：5’-AAGCACGGTCAACTTCCGTA-3’。

将经以上PCR鉴定为阳性的T0代种子播种于温室中，待长出第一片三出复叶后提 取叶片中DNA进行PCR鉴定（方法同上），筛选阳性株系后收获T1代种子。按照同样 的方法种植筛选T1代种子并单株收获T1代株系内各单株上所结T2代种子。选取自交后 代全部具有草甘膦抗性的T2代植株，即为T2代纯合的GmNFYB6L转基因大豆株系。

共获得5个T2代纯合GmNFYB6L转基因大豆株系，分别记为TL1-TL5。

进一步，对所得的5个T2代纯合GmNFYB6L转基因大豆株系（TL1-TL5）采用如 上方法进行PCR分子鉴定。同时设置以上三个对照：以未转基因的大豆（Glycine max(L.) Merr.）品种东农50作为野生型（WT）对照；以水作为空白对照；以质粒 pB2GW7-GmNFYB6L作为阳性对照。

结果显示：TL1-TL5株系植株全部扩增出大小约为450bp的目的条带，与阳性对照 一致；而作为野生型对照的未转基因的大豆（Glycine max(L.)Merr.）品种东农50的植 株为与空白对照均为扩增出相应的目的条带，如图1所示。

B.转pB2GW7空载体大豆的鉴定

从步骤2获得的抗性苗（T0代）—转pB2GW7空载体大豆的叶片中提取DNA，用 引物35S-F和35S-R对35S启动子进行PCR扩增，目的产物大小为250bp，将扩增产物 进行1%琼脂糖凝胶电泳，将获得250bp条带的植株记为阳性。

35S-F：5’-ACTAGAGCCAAGCTGATCTC-3’；

35S-R：5’-TGTCGTGCTCCACCATGTTG-3’。

将经以上PCR鉴定为阳性的T0代种子播种于温室中，待长出第一片三出复叶后提 取叶片中DNA进行PCR鉴定（方法同上），筛选阳性株系后收获T1代种子。按照同样 的方法种植筛选T1代种子并单株收获T1代株系内各单株上所结T2代种子。选取自交后 代全部具有草甘膦抗性的T2代植株，即为T2代纯合的转pB2GW7空载体大豆株系。共 获得5个T2代纯合转pB2GW7空载体大豆株系，分别记为CK1-CK5。

进一步，对所得的5个T2代纯合转pB2GW7空载体大豆株系（CK1-CK5）采用如 上方法进行PCR分子鉴定。同时设置以上三个对照：以未转基因的大豆（Glycine max(L.) Merr.）品种东农50作为野生型（WT）对照；以水作为空白对照；以质粒 pB2GW7-GmNFYB6L作为阳性对照。

结果显示：CK1-CK5株系植株全部扩增出大小约为250bp的目的条带，与阳性对 照一致；而作为野生型对照的未转基因的大豆（Glycine max(L.)Merr.）品种东农50的 植株为与空白对照均为扩增出相应的目的条带，如图2所示。

（2）实时荧光定量PCR检测

取步骤（1）获得的T2代纯合GmNFYB6L转基因大豆株系（TL1-TL5），T2代纯合 转pB2GW7空载体的大豆株系（CK1-CK5）和未转基因的大豆（Glycine max(L.)Merr.） 品种东农50（WT）植株，分别从叶片中提取总RNA，反转录获得cDNA，以该cDNA 为模板，用特异引物F1和R1对基因GmNFYB6L的cDNA进行实时荧光定量PCR扩 增，以大豆β-actin为内参，引物为FC和RC。

实时荧光定量PCR反应体系：2×SuperReal PreMix(天根公司)10μL，正向引物 (10uM）0.6μL，反向引物(10uM)0.6μL，cDNA2μL，RNase-free ddH₂O至20μL。

实时荧光定量PCR反应程序：95℃15min；95℃10sec，60℃20sec，72℃20sec， 40个循环；融解曲线分析从50℃上升到90℃，每一步上升1℃，第一步的预溶解条件等 待90sec，以后每一步等待5sec。

实时荧光定量PCR在StepOnePlus^TM实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设 3次重复。利用LivakKJ和Schmittgen TD（Livak K J Schmittgen TD.Analysis of Relative  Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the22DDCT Method. METHODS,2001:25,402–408）报道的方法，即2-^ΔΔCT计算相对表达量。ΔΔCT= （CT_GmNFYB6L-CT_β-actin）Time x-（CT_GmNFYB6L-CT_β-actin）Time0；Time x表示任意时间点， Time0表示经β-actin校正后1倍量的目标基因表达。

上述引物的序列如下：

F1：5’-GCTTAACTCTCAGTAATTGGTGCT-3’（序列2的第770-793位）；

R1：5’-ACTCCCTTCCCAGCCCTTT-3’（序列2的第833-851位的反向互补序列）；

FC：5’-ATTGGACTCTGGTGATGGTG-3’；

RC：5’-TCAGCAGAGGTGGTGAACAT-3’。

实验重复三次，结果取平均值。

结果如图3中A所示，未转基因的大豆（Glycine max(L.)Merr.）品种东农50（WT） 植株的叶片中基本上检测不到目的基因GmNFYB6L的表达（在未转基因的野生型大豆 中，GmNFYB6L只在发育的种子中特异性表达，在叶片中基本不表达，在GmNFYB6L 转基因植物中，因为用的35S启动子为组成型启动子，所以在叶片中可以检测到 GmNFYB6L的表达。详见下文）；而步骤（1）获得的T2代纯合GmNFYB6L转基因的 大豆株系TL1-TL5的叶片中目的基因GmNFYB6L的表达量都很高。T2代纯合转 pB2GW7空载体的大豆株系（CK1-CK5）的结果与WT基本相同，无统计学差异。

大豆（Glycine max(L.)Merr.）品种东农50（WT）的种子和叶片中GmNFYB6L基 因的实时荧光定量PCR检测，具体如下：

取大豆（Glycine max(L.)Merr.）品种东农50（WT），分别从种子和叶片中提取 总RNA，反转录获得cDNA，以该cDNA为模板，按照同上的方法进行实时荧光定量PCR 检测。结果如图3中B所示，从图中可以看出，在大豆（Glycine max(L.)Merr.）品种东 农50（WT）中，内源的GmNFYB6L基因特异性表达于种子，而在叶片中基本不表达。

实施例3、GmNFYB6L转基因大豆的表型鉴定

以实施例2获得的T2代纯合GmNFYB6L转基因的大豆株系（TL1-TL5），T2代纯合 转pB2GW7空载体的大豆株系（CK1-Ck5）和未转基因的大豆（Glycine max(L.)Merr.） 品种东农50（WT）植株为实验材料。将各材料的种子（每种材料的种子各取20粒）播 种于温室，相同的管理栽培条件下观察各植株的表型，成熟后收获种子测各植株种子 的单株产量、百粒重，用谷物近红外分析仪（丹麦福斯公司，仪器型号1241）测定种 子中脂肪含量和蛋白含量（具体操作参见仪器使用说明书）。实验重复三次，对于定 量数据结果取三次重复的平均值。

结果显示：与T2代纯合转pB2GW7空载体的大豆株系（CK1-CK5）相比，T2代纯 合GmNFYB6L转基因的大豆株系（TL1-TL5）的株高增高、种子体积增大（图4）。另 外，与未转基因的大豆（Glycine max(L.)Merr.）品种东农50（WT）相比，T2代纯合 GmNFYB6L转基因的大豆株系（TL1-TL5）的种子单株产量、百粒重、脂肪含量显著 提高（表1）。以上所观察统计分析的各参数，T2代纯合转pB2GW7空载体的大豆株系 （CK1-CK5）均与未转基因的大豆（Glycine max(L.)Merr.）品种东农50（WT）基本 一致，无统计学差异。

表1各株系种子百粒重、单株产量、脂肪含量及蛋白含量的测定结果

株系编号 百粒重（克） 单株产量（克） 脂肪含量（%） 蛋白含量（%） WT 9.4±1.3 3.1±0.8 17.3±0.6 44.2±0.7 TL1 16.4±1.5** 3.44±0.3 19.7±0.5* 42.8±0.5* TL2 17.3±1.1** 5.37±0.6** 23.8±0.8** 37.7±0.3** TL3 14.6±1.0** 5.55±0.8** 22.7±0.4** 35.9±0.3** TL4 18.7±1.3** 7.31±0.4** 22.07±0.3** 41.9±0.7* TL5 15.9±1.2** 4.14±0.3* 23.6±0.5** 39.4±0.6**

注：*表示与WT相比，P<0.05显著；**表示与WT相比，P<0.001显著。