荧光寿命表观遗传学测定

摘要

本发明涉及基于测量荧光寿命(FLT)来测定酶活性的方法。特别地，本发明涉及对能够修饰肽底物结构之酶的测定，所述酶包括例如催化肽底物之甲基化、脱甲基化、乙酰化、脱乙酰化或脱亚氨化的酶。

说明书

技术领域

本发明涉及基于测量荧光寿命(flurescence lifetime，FLT)来测定酶 活性的方法。特别地，本发明涉及对能够修饰肽底物结构之酶的测定，所 述酶包括例如催化肽底物之甲基化、脱甲基化、乙酰化、脱乙酰化或脱亚 氨化(deimination)的酶。

背景技术

催化其他生物分子之结构修饰的酶是药物发现的重要靶标。例如，催 化蛋白质之翻译后修饰的酶(特别是修饰组蛋白结构的酶)，由于其与人 类疾病(例如神经变性和癌症)相关而成为有前景的药物靶标。

构成组蛋白之氨基酸的翻译后修饰在“表观遗传学(epigenetics)” 领域中特别重要，“表观遗传学”是由除基本DNA序列改变之外的机制 引起的表型(外观)或基因表达之可遗传性改变的研究。遗传物质需要保 护、包装以及用于调节过程(例如转录、复制和修复)的方法。在真核生 物中，这些作用在很大程度上通过将基因组DNA装配成核小体的组蛋白 来实施。核小体与许多相关蛋白质包装在一起以形成染色质纤维。每个核 小体由几乎缠绕圆柱形蛋白质核心两次的DNA组成，所述蛋白质核心含 有每种组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)的两个拷贝。组蛋白的N端尾 区从其中存在结构性球状结构域的核小体核心中伸出。

为了使组蛋白能够调节多种过程，通过多种翻译后修饰来改变组蛋 白。虽然组蛋白修饰在整个序列中均发生，但是组蛋白的非结构性N端 (组蛋白尾区)被特别高度地修饰。这些修饰包括乙酰化、甲基化、脱亚 氨化、泛素化、磷酸化和苏素化(sumoylation)。乙酰化是这些修饰中研 究得最深入的。例如，通过组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase， HAT)乙酰化组蛋白H3尾区的K14和K9赖氨酸通常与转录能力相关。

组蛋白乙酰化调节多个细胞过程，并且特定的乙酰化模式产生不同的 结果，例如，新合成的组蛋白上的乙酰化模式对于其通过组蛋白分子伴侣 装配成核小体来说是非常重要的。另外，染色质压缩和折叠的程度可受组 蛋白H4第16位赖氨酸之乙酰化的调节。最后，组蛋白乙酰化对于基因 转录来说是至关重要的。组蛋白的赖氨酸乙酰化通常涉及以较高的转录速 率打开染色质结构。

组蛋白乙酰化受组蛋白乙酰转移酶(HAT)活性和脱乙酰酶活性的 调节，这对于多种组蛋白以及对于单个组蛋白上的特定位点具有不同偏好 (参见Shahbazian和Grunstein(2007)Annual review of Biochemistry，第 76卷：75-100)。

除乙酰化之外，组蛋白(特别是H3和H4)的甲基化对于染色质功 能(例如基因表达、DNA复制和染色体分离)的调节也很重要。组蛋白 H3的甲基化通常与染色质凝聚相关，从而导致转录抑制。

组蛋白仅在精氨酸和赖氨酸残基上被甲基化。精氨酸可以被单甲基化 或二甲基化，其中后者为对称或不对称构型。催化该过程的酶分为两种类 型，其中I型酶催化N^G-单甲基精氨酸残基和不对称N^G，N^G-二甲基精氨酸 残基的形成，而II型酶催化N^G-单甲基精氨酸残基和对称N^G，N^G-二甲基 精氨酸残基的形成。与精氨酸甲基化类似，ε-氮上的赖氨酸甲基化也可作 为单甲基化、二甲基化或三甲基化形式而发生。

组蛋白赖氨酸甲基转移酶(PKMT)负责组蛋白H3和H4的甲基化 并且利用称为SET(Supressor of variegation，Enhancer of zeste， Trithorax)结构域的催化活性位点。SET结构域是参与调节基因活性的 130个氨基酸的序列。已证明该结构域与组蛋白尾区结合并引起组蛋白的 甲基化。也可通过使用组蛋白赖氨酸脱甲基酶(PKDM)脱甲基化来操纵 组蛋白H3和H4。这种最近鉴定的酶类中的一个家族具有称为Jumonji 结构域(JmjC)的催化活性位点。当JmjC利用多个辅因子使甲基水解 时，发生脱甲基化，从而移除甲基。JmjC能够使单甲基化、二甲基化和 三甲基化底物脱甲基化。

有越来越多的证据将组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferase， HMT)和乙酰转移酶(HAT)与不同病理状况(从恶性肿瘤到神经病) 联系起来。因此，鉴定这些酶的抑制剂可提供药物发现的出发点。

肽基精氨酸脱亚氨酶(peptidyl arginine deiminase，PAD)是将底物 蛋白质上的精氨酸残基在翻译后转化为非标准氨基酸瓜氨酸的钙依赖性 酶的家族。PAD催化的瓜氨酸化(伴随有带正电亚氨基的丧失)将强碱 性精氨酸残基转化为中性氨基酸。认为由瓜氨酸化引起的碱性电荷丧失破 坏了底物蛋白质内的电荷分布并改变了所述蛋白质与其他分子相互作用 的能力。通过PAD类酶使组蛋白H2A、H3和H4脱亚氨化抵消了精氨酸 甲基化。特别地，PAD4同工型能够催化组蛋白H2A、H3和H4上精氨 酸残基的瓜氨酸化(Thompson，P.R.和Fast，W.，ACS Chem Biol.2006，1， 433-441)。因此，PAD组的酶可在“组蛋白密码(histone code)”的修饰 中发挥关键作用并因而影响基因转录。

PAD酶和瓜氨酸化蛋白质还与多种人类疾病(包括类风湿性关节炎、 多发性硬化、阿尔兹海默病)相关并且(更最近地)与癌症相关(Vossaar， E.R.等，Citrullination of synovial proteins in mouse models of rheumatoid  arthritis(2003).Arthritis Rheum，第48卷：2489-2500；Musse，A.A.等， Peptidyl arginine deiminase2(PAD2)over expression in transgenic mice  leads to myelin loss in the central nervous system(2008)，Dis Model Mech. 第1卷：229-240；Ishigami，A.等，Abnormal accumulation of citrullinated  proteins catalysed by peptidyl arginine deiminase in hippocampal extracts  from patients with Alzheimer′s disease(2005)J Neurosci Res.第80卷； 120-128和Chang X.等.Expression of peptidyl arginine deiminase type4 (PAD4)in various tumours(2006)Mol Carinog.第45卷：183-196)。

因此，持续需要用于修饰其他生物分子之结构的这类酶(特别是以上 所总结的催化组蛋白修饰的酶类)的稳健(robust)且灵敏的测定。特别 地，持续需要用于此类酶的稳健、灵敏的测定，其可容易地应用于高通量 筛选形式，能够高效地筛选酶抑制剂。

已报道了用于鉴定调节组蛋白修饰酶之活性的化合物的多种基于放 射性的酶测定。例如，已开发了用于通过测量甲基从常规标记的辅因子 S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)向组蛋白衍生肽底物上赖氨酸之ε-氨基残基 的转移来监测组蛋白甲基转移酶之活性的测定。然而，因为组蛋白甲基转 移酶可进行赖氨酸的单、二或三甲基化，所以测量放射性甲基的并入不提 供最终反应产物之性质的信息。关于使用放射性测定和后续的放射性核素 处理也具有重大危害。

已采用了质谱(MS)来研究组蛋白甲基转移酶和组蛋白乙酰转移酶 的活性。使用MS允许同时表征由某些组蛋白甲基转移酶产生的不同甲基 -赖氨酸形式，即单、二或三甲基化赖氨酸。然而，该技术不适合于高通 量筛选应用。

基于组蛋白H3衍生底物的体外酶修饰已开发了用于组蛋白乙酰化或 甲基化的非放射性测定。在这样的测定中，使用标记抗体进行甲基化反应 产物的检测。此类测定的实例是由Perkin Elmer^TM开发的Lance Ultra^TM测定和AlphaLISA^TM测定。

WO2007/076302描述了用于肽基精氨酸脱亚氨酶活性的调节剂的高 通量筛选。所述测定基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance  energy transfer，FRET)。

发明概述

本发明提供了基于测量荧光寿命(FLT)的酶(特别是能够修饰肽底 物结构的酶)活性测定，所述酶包括例如催化肽底物甲基化、脱甲基化、 乙酰化、脱乙酰化或脱亚氨化的酶。

在本发明的第一方面中，提供了测定受试样品中修饰酶(modifying  enzyme)之活性的方法，其包括：

(a)使受试样品与荧光受调节之酶底物(fluorescent-modulated  enzyme substrate)相接触，所述酶底物包含与荧光部分和配置成调节荧 光部分之荧光寿命的荧光寿命调节剂部分相缀合的接头分子，其中底物通 过修饰酶的作用来修饰以形成经修饰底物，由于修饰而使得所述经修饰底 物的接头分子对第二种酶的切割敏感或者保护其免于被第二种酶切割，其 中通过第二种酶切割底物或经修饰底物将含有荧光寿命调节剂部分之底 物的一部分与含有荧光部分之底物的一部分分开；以及

(b)通过检测由第二种酶作用于经修饰底物和/或底物上引起的荧光 部分之荧光寿命的变化来检测经修饰底物的形成，其中经修饰底物的形成 为修饰酶的活性提供了指示。

在一些具体的实施方案中，所述方法可用于测定选自以下的修饰酶的 活性：蛋白质甲基转移酶、蛋白质乙酰转移酶、脱亚氨酶、蛋白质脱甲基 酶和蛋白质脱乙酰酶。更特别地，提供了用于以下酶类中每一种的测定： 组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶(PKMT)、组蛋白-精氨酸N-甲基转移酶 (PRMT)、组蛋白乙酰转移酶(HAT)、组蛋白脱甲基酶(特别是组蛋白 -赖氨酸脱甲基酶(KDM)和组蛋白-精氨酸脱甲基酶)、组蛋白脱乙酰酶 (HDAC)和肽基精氨酸脱亚氨酶(PAD)。

在本发明的第二方面中，提供了筛选修饰酶之抑制剂的方法，所述方 法包括在受试化合物存在下使用根据本发明第一方面的方法测定所述修 饰酶的活性，其中在受试化合物存在下酶活性的降低将受试化合物鉴定为 所述修饰酶的抑制剂。

在一些具体实施方案中，所述方法可用于筛选选自以下的修饰酶的抑 制剂：蛋白质甲基转移酶、蛋白质乙酰转移酶、脱亚氨酶、蛋白质脱甲基 酶和蛋白质脱乙酰酶。更特别地，本文中提供了用于筛选以下酶类的抑制 剂的方法：组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶(PKMT)、组蛋白-精氨酸N-甲 基转移酶(PRMT)、组蛋白乙酰转移酶(HAT)、组蛋白脱甲基酶(特别 是组蛋白-赖氨酸脱甲基酶(KDM)和组蛋白-精氨酸脱甲基酶)、组蛋白 脱乙酰酶(HDAC)和肽基精氨酸脱亚氨酶(PAD)。

在本发明的第三方面中，提供了荧光受调节之酶底物，其包含与荧光 部分和配置成调节荧光部分之荧光寿命的荧光寿命调节剂部分相缀合的 接头分子，其中所述底物通过修饰酶的作用来修饰以形成经修饰底物，由 于修饰使得所述经修饰底物的接头分子对第二种酶的切割敏感或者保护 其免于被第二种酶切割，其中通过第二种酶切割底物或经修饰底物将含有 荧光寿命调节剂部分之底物的一部分与含有荧光部分之底物的一部分分 开。

在本发明的第四方面中，提供了这样的试剂盒，其包含根据本发明第 三方面的荧光受调节之酶底物和蛋白酶，所述蛋白酶能够切割荧光受调节 之酶底物或通过修饰酶作用于底物而形成的底物之经修饰形式，其中切割 底物或经修饰底物将含有荧光寿命调节剂部分之底物的一部分与含有荧 光部分之底物的一部分分开。

附图简述

图1.示意性地举例说明了用于测定脱亚氨酶类之酶的荧光寿命方法 的一个实例。所述方法的这个具体实例基于使用9-氨基吖啶作为荧光部分 并且使用色氨酸残基的吲哚基侧链作为荧光寿命调节剂。

图2.示出为了测定PAD4脱亚氨酶活性而合成的荧光受调节之肽底 物。

图3.示出在PAD4测定缓冲液中肽1～3随时间的荧光寿命测量数据。

图4.举例说明了肽1～3及其瓜氨酸化类似物的胰蛋白酶切割。将每 种肽与不同浓度的胰蛋白酶(图例中示出)一起孵育并随时间监测荧光寿 命：(A)肽1；(B)肽2；(C)肽3。(D)在与5nM胰蛋白酶孵育后瓜 氨酸化形式的肽1～3的荧光寿命。瓜氨酸化类似物包括以瓜氨酸替换精氨 酸的肽序列1～3。

图5.测定缓冲液中PAD4肽底物与相应瓜氨酸化产物的1∶1混合物 的RP-HPLC谱：(A)肽1；(B)肽2；(C)肽3。注意：Arg＝包含精氨 酸的肽；Cit＝包含瓜氨酸的肽。

图6.以规律的间隔从包含肽1作为底物的PAD4测定混合物中取出 的样品的RP-HPLC谱：(A)t＝0分钟；(B)t＝30分钟；(C)t＝60分钟。

图7.以规律的间隔从包含肽2作为底物的PAD4测定混合物中取出 的样品的RP-HPLC谱：(A)t＝0分钟；(B)t＝30分钟；(C)t＝60分钟。

图8.以规律的间隔从包含肽3作为底物的PAD4测定混合物中取出 的样品的RP-HPLC谱：(A)t＝0分钟；(B)t＝30分钟；(C)t＝60分钟。

图9.肽1作为底物之PAD4测定的RP-HPLC分析中的9AA标记肽 主峰的电喷雾质谱。(A)t＝0分钟，t_R＝14.3分钟；(B)t＝60分钟，t_R＝14.6 分钟。

图10.肽3作为底物之PAD4测定的RP-HPLC分析中的9AA标记 肽主峰的电喷雾质谱。(A)t＝0分钟，t_R＝13.8分钟；(B)t＝60分钟，t_R＝13.9 分钟。

图11.在与胰蛋白酶孵育之前和之后PAD4测定混合物荧光寿命的比 较。包括无酶对照(减去PAD4)用于比较。

图12.肽1作为底物的PAD4测定时间过程。(A)添加10nM胰蛋 白酶之前的荧光寿命；(B)与10nM胰蛋白酶在室温下孵育10分钟之后 的荧光寿命。

图13.示意性地举例说明了用于测定蛋白质赖氨酸甲基转移酶 (PKMT)和蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)的荧光寿命方法的实例。 所述方法的这些实例基于使用9-氨基吖啶作为荧光部分并且使用色氨酸 残基的吲哚基侧链作为荧光寿命调节剂。

图14.示出为了测定G9a甲基转移酶活性所合成的荧光受调节之肽 底物。

图15.评价了基于G9a荧光寿命的蛋白酶保护测定中作为底物的肽 4～9。

图16.肽4和9作为底物的G9a荧光寿命(FLT)蛋白酶保护测定。 (A)在添加Endo-LysC蛋白酶之前作为G9a浓度之函数的FLT。(B) 在与Endo-LysC孵育10分钟后作为G9a浓度之函数的FLT。(C)在与 Endo-LysC孵育60分钟后作为G9a浓度之函数的FLT。(D)和(E)如 同(B)和(C)，但是为了清楚起见扩展X轴并且包括未切割肽对照以证 明蛋白酶保护的程度。

图17.在以下间隔从包含肽4作为底物的G9a测定混合物中取出的 样品的RP-HPLC谱：(A)t＝0分钟；(B)t＝6小时。

图18.在以下间隔从包含肽9作为底物的G9a测定混合物中取出的 样品的RP-HPLC谱：(A)t＝0分钟；(B)t＝6小时。

图19.肽4作为底物之G9a测定的RP-HPLC分析中的9AA标记肽 峰的电喷雾质谱。(A)t＝0分钟，t_R＝21.4分钟；(B)t＝6小时，t_R＝24.3 分钟。

图20.肽9作为底物之G9a测定的RP-HPLC分析中的9AA标记肽 峰的电喷雾质谱。(A)t＝0分钟，t_R＝19.6分钟；(B)t＝6小时，t_R＝19.5 分钟。

图21.使用作为底物之肽4和不同浓度之G9a的测定时间过程。(A) 在用2nM Endo-LysC切割之前；(B)在用2nM Endo-LysC切割之后。

图22.使用作为底物之肽9和不同浓度之G9a的测定时间过程。(A) 在用2nM Endo-LysC切割之前；(B)在用2nM Endo-LysC切割之后。

图23.对于使用肽4和9作为底物进行的FLT G9a蛋白酶保护测定 的作为SAM浓度之函数的平均寿命。

图24.对于使用肽4和9作为底物进行的FLT G9a蛋白酶保护测定 的作为抑制剂浓度之函数的平均寿命。

图25.示意性地举例说明了用于测定蛋白质赖氨酸脱甲基酶 (PKDM)和蛋白质精氨酸脱甲基酶(PRDM)的荧光寿命方法的实例。 所述方法的这些具体实例基于使用9-氨基吖啶作为荧光部分并且使用色 氨酸残基的吲哚基侧链作为荧光寿命调节剂。

图26.示出了用于测定作用于赖氨酸-36的JHDM1A赖氨酸脱甲基 酶的基于H3N端尾区序列的荧光寿命底物。

图27.示意性地举例说明了用于测定组蛋白乙酰转移酶的荧光寿命 方法的实例。所述方法的这一具体实例基于使用9-氨基吖啶作为荧光部分 并且使用色氨酸残基的吲哚基侧链作为荧光寿命调节剂。

图28.示出了用于测定使赖氨酸-14乙酰化之HAT酶的基于H3N端 尾区序列的建议的荧光受调节之肽底物。

图29.示意性地举例说明了用于测定组蛋白脱乙酰酶的荧光寿命方 法的实例。所述方法的这一具体实例基于使用9-氨基吖啶作为荧光部分并 且使用色氨酸残基的吲哚基侧链作为荧光寿命调节剂。

图30.示出了用于通过FLT蛋白酶保护法(FLT protease protection  approach)测定HDAC的所建议的荧光受调节之肽底物。Xaa＝任意氨基 酸。

图31.以规律的间隔从包含肽1作为底物的PAD2测定混合物中取出 的样品的RP-HPLC谱：(A)t＝0分钟；(B)t＝30分钟；(C)t＝120分钟。

图32.肽1作为底物之PAD2测定的RP-HPLC分析中的9AA标记 肽主峰的电喷雾质谱。(A)t＝0分钟，t_R＝14.4分钟；(B)t＝120分钟，t_R＝14.7 分钟。

图33.在与胰蛋白酶孵育之后PAD2测定混合物的荧光寿命测量。包 括仅有肽的对照用于比较。

图34.肽1作为底物的PAD2测定时间过程。

图35.在与Endo-LysC孵育后肽10作为底物的JHDM1A测定混合 物的荧光寿命测量。包括仅有肽的对照用于比较。

图36.以规律的间隔从包含肽12作为底物之Set7/9测定混合物中取 出的样品的RP-HPLC谱的叠加。(a)t＝0小时；(b)t＝2小时；(c)t＝6 小时。

图37.肽12作为底物之Set7/9测定的RP-HPLC分析中的9AA标记 肽主峰的电喷雾质谱。(A)t＝0小时，t_R＝18.3分钟；(B)t＝6小时，t_R＝18.4 分钟。

图38.在与Endo-LysC孵育后Set7/9测定混合物的荧光寿命测量。 包括仅有肽的对照用于比较。

图39.使用作为底物之肽12和不同浓度之Set7/9的测定时间过程。 (A)在用2nM Endo-LysC切割之前；(B)在用2nM Endo-LysC切割 之后。

图40.使用作为底物之肽13和不同浓度之Set7/9的测定时间过程。 (A)在用2nM Endo-LysC切割之前；(B)在用2nM Endo-LysC切割 之后。

图41.对于使用肽13作为底物进行的FLT Set7/9蛋白酶保护测定的 作为SAM浓度之函数的平均寿命。

图42.对于使用肽13作为底物进行的FLT Set7/9蛋白酶保护测定的 作为SAH抑制剂浓度之函数的平均寿命。

图43.对于使用肽13作为底物进行的FLT Set7/9蛋白酶保护测定的 Z’-因子。

图44.示出了为了测定Set7/9甲基转移酶活性所合成的荧光受调节 之肽底物。

图45.通过不同浓度的Endo-ArgC切割肽15的相对于时间的平均寿 命。

图46.以规律的间隔从包含肽15作为底物之PRMT5测定混合物中 取出的样品的RP-HPLC谱的叠加。(a)t＝0小时；(b)t＝3.5小时；(c) t＝17.5小时。

图47.包含肽15作为底物之PRMT5测定的RP-HPLC分析中的9AA 标记肽主峰的电喷雾质谱。(A)t＝0小时，t_R＝20.0分钟；(B)t＝17.5小 时，t_R＝20.3分钟。

图48.在与Endo-ArgC孵育后PRMT5测定混合物的荧光寿命测量。 包括仅有肽的对照用于比较。

图49.使用作为底物之肽15和不同浓度之PRMT5的测定时间过程。 (A)在用1.25nM Endo-ArgC切割之前；(B)在用1.25nM Endo-ArgC 切割之后。

图50.示出了为了测定PRMT5甲基转移酶活性所合成的荧光受调节 之肽底物。

图51.对于使用肽15作为底物进行的PRMT5FLT蛋白酶保护测定 的作为西奈芬净(sinefungin)抑制剂浓度之函数的平均寿命。

图52.用Endo-LysC切割肽16的相对于时间的平均寿命。

图53.示出了为了测定PCAF乙酰转移酶活性所合成的荧光受调节 之肽底物。

图54.用Endo-LysC切割肽17的相对于时间的平均寿命。

图55.在(A)0分钟、(B)30分钟、(C)60分钟、(D)90分钟间 隔从包含肽17作为底物的pCAF测定混合物中取出的样品的RP-HPLC 谱。

图56.肽17作为底物之pCAF测定的RP-HPLC分析中的峰的电喷 雾质谱。(A)t_R＝16.1分钟；(B)t_R＝16.7分钟。

图57.使用作为底物之肽17和不同浓度之PCAF的测定时间过程。 (A)在用25nM Endo-LysC切割之前；(B)在用25nM Endo-LysC切 割之后。

图58.测定用于使用肽17作为底物的PCAF FLT蛋白酶保护测定的 AcCoA的K_M(app)。

图59.示出了为了测定HDAC1脱乙酰酶活性所合成的荧光受调节之 肽底物。

图60.脱乙酰化的产物肽。

图61.用不同浓度的胰蛋白酶切割肽18(A)和肽19(B)的相对于 时间的平均寿命。

图62.以规律的间隔从包含肽18作为底物之HDAC1测定混合物中 取出的样品的RP-HPLC谱的叠加。

图63.在室温下孵育2小时后肽18之HDAC1测定的RP-HPLC分 析中的峰的电喷雾质谱。(A)t_R＝19.1分钟；(B)t_R＝21.2分钟。

图64.使用作为底物之肽18和不同浓度之HDAC1的测定时间过程。 (A)在用10nM胰蛋白酶切割之前；(B)在用10nM胰蛋白酶切割之 后。

图65.确定使用肽18作为底物的HDAC1FLT蛋白酶保护测定的底 物K_M。

图66.使用肽18作为底物进行的HDAC1FLT蛋白酶保护测定的作 为TSA抑制剂浓度之函数的平均寿命。

图67.对于使用肽18作为底物进行的HDAC1FLT蛋白酶保护测定 的Z’-因子。

图68.示出了为了测定EZH2甲基转移酶活性所合成的荧光受调节 之肽底物。

图69.用不同浓度的Endo-LysC切割肽20的相对于时间的平均寿 命。

图70.使用作为底物之肽20和不同浓度之EZH2复合体的测定时间 过程。

图71.确定用于使用肽20作为底物的EZH2FLT蛋白酶保护测定的 SAM的K_M(app)。

图72.使用肽20作为底物进行的EZH2FLT蛋白酶保护测定的作为 SAH抑制剂浓度之函数的平均寿命。

图73.确定PAD4FLT蛋白酶保护测定中肽1的底物K_M。

图74.对于使用肽1作为底物进行的PAD4FLT蛋白酶保护测定的 Z’-因子。

图75.对于使用肽9作为底物进行的G9a FLT蛋白酶保护测定的Z’- 因子。

发明详述

本文中提供了用于测定酶(本文中是指修饰酶)活性的方法，其基于 检测与修饰酶底物相连接之荧光部分的荧光寿命的变化。

所述方法包括：首先使已知包含或怀疑包含修饰酶的受试样品与底物 相接触，所述底物通过修饰酶的作用来修饰以形成经修饰底物。底物和通 过修饰酶作用于底物而形成的经修饰底物的结构不同，使得底物和经修饰 底物的一种或另一种(但不是两种)在位于荧光部分与寿命调节剂部分之 间的切割位点上可被第二种酶切割，而另一种在荧光部分与荧光寿命调节 剂部分之间的任何位置处都被保护而免于被第二种酶切割。因此可通过测 定第二种酶对经修饰底物和/或形成经修饰底物之底物的作用来确定通过 修饰酶作用于底物而形成经修饰底物形成。

本文使用的术语“受试样品”简单地指待测试修饰酶之活性的任何样 品。这可以例如是合适液体介质中酶的纯样品或半纯样品，例如酶缓冲液； 或者它可以指待测试酶活性的生物样品，例如，患者材料的临床样品。

使底物和通过修饰酶作用于底物而形成的经修饰底物与荧光部分和 配置成调节荧光部分之荧光寿命的荧光寿命调节剂部分相缀合。在荧光部 分连接位点与荧光寿命调节剂部分连接位点之间的切割位点上通过第二 种酶切割底物或经修饰底物将底物分成至少两部分；包括包含荧光部分的 第一部分和包含荧光寿命调节剂部分的第二部分，使得调节剂部分不再调 节荧光部分的荧光寿命。因此，测定的最终示值读数(read out)是基于 测量荧光部分的荧光寿命，其为第二种酶对经修饰底物(或底物)的作用 提供了指示，进而为通过修饰酶作用于底物而形成经修饰底物提供指示。

术语“修饰酶”指能够修饰底物以形成经修饰底物的任何酶，所述经 修饰底物的结构不同使得底物和经修饰底物的一种或另一种(但不是两 种)在位于荧光部分与寿命调节剂部分之间的切割位点上可通过第二种酶 的作用而被切割，而另一种在荧光部分与荧光寿命调节剂部分之间的任何 位置处都被保护而免于被第二种酶切割。修饰酶通常是能够修饰肽或蛋白 质结构的酶，例如催化蛋白质或肽翻译后修饰的酶。在本文中详细描述的 一些具体实施方案中，修饰酶可选自蛋白质甲基转移酶、蛋白质乙酰转移 酶、脱亚氨酶、蛋白质脱甲基酶和蛋白质脱乙酰酶。更具体地，本文中所 述的测定方法在一般情况下可用于测定催化组蛋白翻译后修饰之酶的活 性，这样的酶是表观遗传学领域中的重要靶标。因此，在一些具体实施方 案中，修饰酶可属于以下酶类之一：组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶 (PKMT)、组蛋白-精氨酸N-甲基转移酶(PRMT)、组蛋白乙酰转移酶 (HAT)、组蛋白脱甲基酶(特别是组蛋白-赖氨酸脱甲基酶(KDM)和 组蛋白-精氨酸脱甲基酶)、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)和肽基精氨酸脱亚 氨酶(PAD)。

底物包含与荧光部分和荧光寿命调节剂部分二者缀合的接头分子。配 置荧光部分和荧光寿命调节剂部分使得荧光寿命调节剂部分可调节荧光 部分的荧光寿命。因此，底物在本文中可称为“荧光受调节之底物”或“荧 光受调节之酶底物”，这些术语可互换使用。

本文使用的术语“荧光部分”是指与荧光受调节之酶底物缀合的荧光 标记。

因为本文中所述的测定使用基于荧光部分之荧光寿命变化的示值读 数，所以为了提高测定的动态范围，选择表现出长荧光寿命(在不存在任 何寿命调节的情况下)的荧光部分可以是有利的，所述长荧光寿命通常大 于10ns并且优选在10ns至25ns的范围内。在本文的上下文中，“荧光 寿命”定义为荧光团从激发态衰减至基态所耗费的平均时间。但是，使用 表现出较短荧光寿命的荧光部分也明确地涵盖在本发明的范围之内。

优选的荧光部分包括但不限于：9-氨基吖啶及其衍生物，如WO 2007/049057所述(通过引用并入本文)；吖啶酮衍生物和喹吖啶酮衍生物， 包括吖啶酮和喹吖啶酮化合物；以及使有技能的读者导向的US7,727,739 B2、WO02/099432和WO03/089663(通过引用并入本文)中所述的另一 些荧光部分；吖啶和吖啶(acridinium)部分；得自于AssayMetrics  Limited的Puretime^TM系列染料；如WO02/081509(通过引用并入本文) 所述的嗪(例如MR121、JA242、JA243)和罗丹明衍生物(例如JA 165、JA167、JA169)。另一些实例(如WO02/056670所述)包括但不 限于Cy5、Cy5.5和Cy7(Amersham)；IRD41和IRD700(Licor)；NIR-1 和IC5-OSu(Dojindo)；Alexa fluor660&Alexa fluor680(Molecular  Probes)；LaJolla Blue(Diatron)；FAR-Blue、FAR-Green One& FAR-Green Two(Innosense)；ADS790-NS和ADS821-NS(American Dye  Source)；靛青绿(indocyanine green)(ICG)及其类似物(美国专利No. 5,968,479)；吲哚三碳菁(indotricarbocyanine)(ITC，WO98/47538)； 荧光量子点(硫化锌包裹的硒化镉纳米晶体-QuantumDot Corp.)和螯合镧 系化合物(荧光镧系金属包括铕和铽)。该列表旨在举例说明而不是限制。

本文使用的术语“荧光寿命调节剂”意指当与荧光部分一起存在于荧 光受调节之酶底物中时能够改变荧光部分之荧光寿命的化合物、缀合物或 部分。这种荧光调节的机制可以是但不限于：能量转移、电子转移或分子 相互作用或其组合。优选的荧光寿命调节剂包括但不限于：吲哚基部分及 其衍生物，包括氨基酸色氨酸侧链中存在的吲哚基部分；酚部分及其衍生 物，包括氨基酸酪氨酸侧链中存在的酚部分；咪唑部分及其衍生物，包括 氨基酸组氨酸侧链中存在的咪唑部分；苄基部分及其衍生物，包括氨基酸 苯丙氨酸的苄基侧链；苯氧基部分；萘基部分及其衍生物；萘基丙氨酸部 分；咔唑部分和吩噻嗪部分。该列表旨在举例说明而不是限制。

选择荧光部分和荧光寿命调节部分使得与荧光寿命调节剂不存在时 相比，在荧光寿命调节剂存在下荧光部分的荧光寿命降低。与荧光寿命调 节剂不存在时相比，优选在荧光寿命调节剂存在下荧光部分的荧光寿命改 变，并且更优选降低至少0.1ns，至少0.5ns，更优选至少2ns，更更优 选至少5ns，或至少10ns。调节作用取决于荧光受调节之酶底物中荧光 部分与调节剂的邻近和空间定向。没有明确需要荧光寿命调节剂的吸收光 谱与荧光部分的发射光谱重叠。相比之下，荧光共振能量转移(FRET) 过程不仅需要供体部分与受体部分之间邻近，还需要受体部分的吸收光谱 与供体部分的发射光谱之间的光谱重叠。

显著的调节作用(例如，荧光部分的荧光寿命改变5ns或更大)是 酶测定动态范围的重要决定因素。在这一点上，调节程度(即当调节剂存 在时荧光部分荧光寿命改变的幅度)可比荧光部分荧光寿命的绝对长度更 为重要。因此，如果选择荧光部分/调节剂的组合使得调节剂部分使荧光 部分的荧光寿命缩短非常大的程度，(例如，由于调节而产生至少2ns的 差异)，则荧光部分之荧光寿命的绝对长度可能不是至关重要的。因此， 如果当调节不存在下表现出相对“短的”荧光寿命的荧光部分(例如，小 于10ns，或小于5ns)和调节剂二者均与接头缀合时所选择的调节剂引 起荧光寿命显著降低(例如，2ns或更多)，则所述荧光部分仍然可被用 于荧光受调节之底物。

但是，因为由荧光化合物文库、自发荧光或内滤效应产生的荧光测定 中的背景干扰通常具有约5ns或更小的短寿命，所以使用荧光寿命长(＞ 10ns)的荧光团可具有优点。的确，与基于荧光强度的方法(例如但不 限于FRET和荧光偏振)相比，基于荧光部分之寿命来区分这种背景干 扰与化合物干扰的能力在该领域中可看作是该技术的一个关键优点。与通 常不可能区分的荧光寿命短的荧光团相比，荧光寿命长的荧光团有助于背 景荧光与化合物干扰的这种区分。

选择用于包含在荧光受调节之底物中的荧光部分与荧光寿命调节部 分的合适组合使得荧光部分的荧光寿命在荧光寿命调节剂存在下降低。当 选择适当组合时，强调对于荧光寿命调节剂的吸收光谱与荧光部分的发射 光谱重叠没有明确需要。如果对于具体的酶测定合适，则荧光受调节之底 物可包含多于一种的荧光部分和/或多于一种的荧光寿命调节剂部分。

用于包含在荧光受调节之酶底物中的荧光部分与荧光寿命调节剂部 分的优选组合包括但不限于：荧光部分9-氨基吖啶(9-AA)和调节剂部 分吲哚基部分(特别是色氨酸残基的吲哚基侧链)、荧光部分9-氨基吖啶 (9-AA)和调节剂部分萘基丙氨酸或其衍生物、荧光部分9-氨基吖啶 (9-AA)和调节剂部分咔唑部分或其衍生物、以及荧光部分9-氨基吖啶 (9-AA)和调节剂部分吩噻嗪或其衍生物。另一些合适的组合包括荧光 部分吖啶酮或其衍生物和调节剂部分吲哚基部分(特别是色氨酸残基的吲 哚基侧链)，并且还包括荧光部分喹吖啶酮或其衍生物和调节剂部分吲哚 基部分(特别是色氨酸残基的吲哚基侧链)。已表明基于吖啶酮的荧光团 的荧光寿命受色氨酸残基之吲哚基侧链的调节(WO03/089663； Hassiepien，U等.Screening.第4卷，2009，11；Doering，K.等.J Biomol. Screen.，2009，14，1)。所列组合中的任何一种可包含在本文中所述的荧光 受调节之酶底物(包括以下定义的基于结构的特定底物)中的任何一种中。 为了避免疑问，明确地指出前述章节中所述的荧光部分/调节剂部分的组 合可对应于下文中使用的结构定义中的部分Fl和M。

荧光受调节之酶底物的接头分子组分用来使荧光部分和荧光寿命调 节剂部分以适当构造定位以实现荧光部分之荧光寿命的有效调节。接头分 子也可以是修饰酶修饰荧光受调节之酶底物以形成经修饰底物的位点。

在一些优选实施方案中，底物的接头分子组分是可通过修饰酶作用进 行修饰以形成经修饰肽的肽接头。在其中底物的接头分子组分是肽接头的 一些实施方案中，由修饰酶作用产生的经修饰形式可称为“经修饰肽接 头”。肽接头可包含通过修饰酶之作用而修饰的至少一个氨基酸残基。如 以下详细描述的，可通过修饰酶催化的肽修饰类型包括但不限于甲基化、 脱甲基化、乙酰化、脱乙酰化和脱亚氨化。

通过修饰酶之作用而修饰的肽接头内的氨基酸残基一般存在于形成 第二种酶(通常是蛋白酶)之识别位点的氨基酸序列环境中。定位第二种 酶的识别位点使得切割发生在荧光部分和肽接头之连接位点与荧光寿命 调节剂部分和肽接头之连接位点之间，使得在(底物或经修饰底物中的) 切割位点处肽接头的切割将荧光受调节之酶底物(或经修饰底物)分成包 含荧光部分的第一部分和包含荧光寿命调节剂部分的第二部分。该分离的 结果是，荧光寿命调节剂部分不再调节荧光部分的荧光寿命，从而可观察 到荧光部分的荧光寿命提高。

包含肽接头的荧光受调节之酶底物通常符合以下一般结构：

Fl-X_n1-N-X_n2-M或结构M-X_n1-N-X_n2-Fl，其中Fl和M的定向相反。

其中X_n1表示一个或更多个第一氨基酸序列，Fl表示与X_n1(或与X_n2， 如果Fl和M的定向相反)缀合的荧光部分，N表示通过修饰酶之作用而 修饰的氨基酸残基，X_n2表示一个或更多个第二氨基酸序列，并且M表示 与X_n2(或与X_n1，如果Fl和M的定向相反)缀合的荧光寿命调节剂。在 用修饰酶处理之后，底物被转化为由以下一般结构表示的经修饰底物：

Fl-X_n1-N_mod-X_n2-M或M-X_n1-N_mod-X_n2-Fl

其中N_mod表示残基N的经修饰衍生物。

荧光部分Fl与X_n1“缀合”，同时荧光寿命调节剂部分M与X_n2“缀 合”，或者如果Fl与M相对于残基N的位置相反则反之亦然。基本要求 是Fl和M在底物切割后被分开。因此，术语“缀合”意指Fl可在由X_n1表示的氨基酸序列的任何部分内与底物的肽接头相连接，并且M可在由 X_n2表示的氨基酸序列的任何部分内与底物的肽接头相连接，或者反之亦 然。虽然包括这样的结构，但是并不旨在将底物结构限制于其中Fl和M 与肽接头的C端和N端残基相连接的实施方案。Fl和M也可与X_n1或 X_n2内的内部氨基酸残基相连接。也可通过X_n2(当位置相反时为X_n1)中 的氨基酸残基侧链提供荧光寿命调节剂M，其可以是肽接头的内部残基 或C端残基或N端残基。例如，可通过合并到X_n1或X_n2中的色氨酸、酪 氨酸、组氨酸或苯丙氨酸残基的吲哚基、酚、咪唑和苄基侧链来提供M。 这种Fl和M定位的定义/解释应适用于以下详细描述的底物的所有具体实 施方案。

选择X_n1和X_n2使得最终结构X_n1-N-X_n2为修饰酶修饰残基N提供适 当的序列环境。如果修饰酶的活性具有高度序列依赖性，则其可适用于 X_n1-N-X_n2的整个氨基酸序列，从而模拟修饰酶之天然底物的一部分的氨 基酸序列。例如，如果修饰酶的天然底物是组蛋白，则X_n1-N-X_n2可模拟 通过修饰酶之作用而修饰的氨基酸残基周围的组蛋白的短肽片段的序列。

另外，重要的是，序列X_n1-N-X_n2或经修饰形式X_n1-N_mod-X_n2(但不 是二者)形成底物以在荧光部分与荧光寿命调节剂部分之间被第二种酶切 割。在基于使用肽接头的一些实施方案中，所述第二种酶通常是蛋白酶。 本领域中可使用底物特异性不同的多种蛋白酶。因此，可选择蛋白酶以匹 配修饰酶催化的修饰的性质。对于正确操作测定至关重要的是，接头由不 被第二种酶切割的形式转化为被第二种酶切割的形式(或反之亦然)仅取 决于修饰酶的活性。因此，必须确保接头在荧光部分与荧光寿命调节剂部 分之间不包含允许第二种酶以不依赖于对残基N之修饰的方式切割接头 的任何位点，以确保Fl与M通过接头切割的分开关键取决于残基N的修 饰。不排除第二种酶可在底物或经修饰底物中其他地方的第二切割位点切 割，其中在第二位点处的底物切割不依赖于底物的修饰。如果该第二位点 处的切割不导致荧光部分与荧光寿命调节剂部分分开，则可允许在不依赖 于底物修饰的第二位点处切割。例如，图2所示的底物在位于发挥荧光寿 命调节剂部分作用的色氨酸残基(色氨酸的吲哚基侧链)与肽C端之间 的赖氨酸残基处对胰蛋白酶的切割敏感。

由X_n1-N-X_n2表示的氨基酸残基一起构成底物的肽接头组分。肽接头 首先可由通过常规肽键连接的氨基酸残基形成。氨基酸残基自身可以是天 然氨基酸残基或非天然氨基酸残基或其混合物。显而易见地，要求是由N 表示的氨基酸残基可通过修饰酶的作用而修饰，但是也允许另一些氨基酸 残基的修饰，前提是底物仍然对残基N处的修饰敏感。还可允许包含一 个或更多个非肽键，前提是底物或经修饰底物中的肽接头仍然可被第二种 酶(例如，蛋白酶)切割。

另一个重要的要求是，在荧光受调节之酶底物的整体结构中使荧光部 分Fl和荧光寿命调节剂部分M维持为适当的空间构型以实现部分M对 部分Fl之荧光寿命的有效调节。通常，Fl和M二者通过直接共价连接与 肽接头(X_n1-N-X_n2)相连接。WO2007/049057(通过引用并入本文)中 描述了用于使荧光部分与肽直接共价连接的合适方法。Bioconjugate  Techniques，G.T.Hermanson，Academic Press(1996)(其通过引用并入本 文)中描述了将荧光部分与蛋白质和肽相连接的另一些方法。

在其中通过合并到X_n1或X_n2中的色氨酸、酪氨酸、组氨酸或苯丙氨 酸残基的吲哚基、酚、咪唑和苄基侧链提供荧光寿命调节剂M的实施方 案中，发挥充当调节剂M之侧链作用的氨基酸残基自身可形成由X_n2(或 X_n1，在其中Fl与M的位置相反的实施方案中)表示的氨基酸序列的一 部分。因此充当荧光寿命调节剂M的氨基酸残基可通过共价肽键与肽接 头的其余部分相连接。

本文中所述测定平台的具体优点在于，由X_n1-N-X_n2表示的肽接头的 氨基酸序列可适合于多种不同的目的修饰酶，而基于FLT检测之测定的 一般原则仍然为所有测定所共用。

可采用常规检测方法来测量荧光寿命和荧光强度。这些方法包括使用 光电倍增管(photomultiplier tube)作为检测装置的仪器。使用这些方法 可以有数种途径；例如：

i)基于时间相关单光子计数的方法(参见Principles of Fluorescence  Spectroscopy，(第4章)J R Lakowicz编，第二版，1999，Kluwer/ Academic Press)；

ii)基于频域/相位调制的方法(参见Principles of Fluorescence  Spectroscopy，(第5章)J R Lakowicz编，第二版，1999，Kluwer/ Academic Press)；以及

iii)基于时闸(time gating)的方法(参见Sanders等，(1995)Analytical  Biochemistry，227(2)，302-308)。

用于测量荧光寿命的合适装置是Edinburgh Instruments FLS920荧 光计和采用时间相关单光子计数法的Edinburgh Instruments  NanoTaurus^TM荧光寿命读板器(Edinburgh Instruments，UK)，以及还有 利用时闸的IOM Nanoscan。

可通过电荷耦合装置(charge coupled device，CCD)成像仪(例如 扫描成像仪或面积型成像仪)进行荧光密度/荧光寿命的测量，以使多孔 板中的所有孔成像。

通过荧光部分荧光寿命的变化来报道测定方法的示值读数。在某些实 施方案中，测定可基于测量平均荧光寿命，它是存在的所有荧光物质(即 荧光受调节之底物，和通过修饰酶作用于底物而形成的经修饰底物，加上 当荧光受调节之底物或经修饰底物被第二种酶(例如，蛋白酶)切割后所 产生的荧光产物)的荧光寿命的组合。

应理解，经修饰底物(通过荧光受调节之底物的修饰酶作用形成)中 荧光部分的荧光寿命长度与衍生其的荧光受调节之底物中荧光部分的荧 光寿命长度基本上相同，原因是由修饰酶催化的修饰(例如，甲基化、乙 酰化、脱甲基化、脱乙酰化、脱亚氨化)一般不显著改变荧光部分和荧光 寿命调节剂部分的定向，并因此不显著改变荧光寿命调节的程度。在荧光 受调节之底物和经修饰底物二者中的荧光部分的荧光寿命都受调节。仅当 荧光受调节之底物或经修饰底物发生切割，使与荧光部分缀合的底物部分 与与荧光寿命调节剂缀合的底物部分分开，破坏调节后，才可检测到荧光 寿命的变化。与荧光部分缀合的底物的切割部分表现出的荧光寿命比荧光 受调节之底物更长。

因此，平均荧光寿命测量根据由于调节而表现出“缩短”荧光寿命的 荧光物质(荧光受调节之底物加上经修饰底物)与表现出较长(未经调节) 荧光寿命的荧光物质(与荧光部分缀合的被切割的底物部分)的相对比例 改变而改变。用第二种酶处理后存在的“短”与“长”寿命荧光物质的相 对比例与添加第二种酶时存在的“可切割的”荧光受调节之底物(或经修 饰底物)直接相关。因此，它也与修饰酶的活性直接相关。当提及荧光寿 命测量时，术语“长”和“短”是相对术语，指在不调节时和在荧光寿命 调节剂存在下受调节时相同荧光部分的荧光寿命，并且不表示具体的绝对 值。

在时间过程测定中，可观察到与未经修饰底物相比，平均荧光寿命对 应于100％未经修饰底物的t＝0测量值随时间提高或降低，这取决于经修 饰底物对第二种酶(例如，蛋白酶)的切割敏感还是受到保护而免于被其 切割。在终点测定中，与未经修饰底物相比，终点的平均寿命测量值可高 于或低于对应于100％未经修饰底物的基线测量值，这取决于经修饰底物 对第二种酶(例如，蛋白酶)的切割敏感还是受到保护而免于被其切割。

作为测量平均寿命的替代方法，测定也可基于对特定组分之特征性荧 光寿命的测量。例如，可选择仅测量存在的“长”荧光寿命组分的量。因 为长荧光寿命是其中荧光部分与荧光寿命调节剂部分分开之切割产物的 特征，所以该测量可以与存在的经切割底物的量(以浓度为单位)直接相 关。在时间过程测定中，可观察到存在的长寿命特征性组分(即与荧光部 分缀合的切割产物)的绝对量相对于100％未经修饰底物的t＝0测量值随 时间提高或降低，这取决于经修饰底物对第二种酶(例如，蛋白酶)的切 割敏感还是受到保护而免于被其切割。在终点测定中，存在的长寿命特征 性组分(即与荧光部分缀合的切割产物)的绝对量可高于或低于对应于 100％未经修饰底物的基线测量值，这取决于与未经修饰底物相比经修饰 底物对第二种酶(例如，蛋白酶)的切割敏感还是受到保护而免于被其切 割。

荧光寿命测量提供了超越仅基于定量荧光强度之常规荧光技术的显 著优势。荧光寿命由相同光谱解析的强度信号确定，但是也另外地在时间 域(temporal domain)中解析。该固有的荧光性质不取决于探针浓度和 体积，并且不受自发荧光、光散射和内滤效应以及光漂白所影响。因此， 该方法的固有性质应导致灵敏度更好的、更稳健的测定并且使来自荧光化 合物库的背景干扰能够尽可能小，导致药物筛选应用中的假阳性更少。

现在经更详细地描述测定的一些非限制性实施方案：

(A)基于蛋白酶保护的测定

测定的第一组实施方案基于使用这样的底物，其包含与荧光部分和配 置成调节荧光部分之荧光寿命的荧光寿命调节剂部分相缀合的肽接头分 子，所述肽通过修饰酶的作用而修饰形成经修饰肽，其中底物中的肽能够 被第二种酶(即，蛋白酶)切割，并且修饰酶对肽的修饰保护经修饰肽在 荧光部分与荧光寿命调节剂部分之间免于被第二种酶(例如，蛋白酶)切割。在这样的实施方案中，底物在荧光部分与荧光寿命调节剂部分之间对 第二种酶(蛋白酶)的切割敏感，底物的切割使得荧光部分的荧光寿命提 高，但是通过修饰酶作用于底物而形成的经修饰底物在荧光部分与荧光寿 命调节剂部分之间免于被第二种酶(蛋白酶)切割。因此，与未经修饰肽 相比，蛋白酶处理后荧光部分之荧光寿命的时间依赖性降低表明形成了经 修饰肽(通过修饰酶作用于底物而形成)。

该测定的一些非限制性实施方案如下：

(1)甲基转移酶测定

在一个实施方案中，本文中所述测定方法可适用于测定甲基转移酶的 活性。

用于甲基转移酶测定的底物包含肽接头，并且可具有一般结构：

Fl-X1-N1-X2-M  (I)

其中X1表示第一氨基酸序列，Fl表示与X1缀合的荧光部分，N1 表示通过甲基转移酶之作用而甲基化的氨基酸残基，X2表示第二氨基酸 序列并且M表示与X2缀合的荧光寿命调节剂。在用甲基转移酶处理之 后，底物转化为由以下一般结构表示的经修饰(甲基化)底物：

Fl-X1-N1(Me)-X2-M  (II)

其中N1(Me)表示残基N上的甲基化。

应理解，Fl和M实际上可以以任一定向存在。残基N1通常是赖氨 酸(在用于赖氨酸甲基转移酶的测定的情况下)或精氨酸(在用于精氨酸 甲基转移酶的测定的情况下)。

选择氨基酸序列X1和X2二者以将残基N1放置在甲基化的适当序 列环境中，并且为蛋白酶切割提供识别位点(未甲基化结构(I)中)，而且 还提供荧光部分(Fl)和荧光寿命调节剂(M)的最佳定向以实现Fl荧 光寿命的有效调节。X1和X2的序列可基于用于待测定甲基转移酶之天 然底物的序列。

应理解，虽然为了有效调节荧光寿命，需要将荧光部分(Fl)和荧光 寿命调节剂(M)以适当间隔定位，但是没有必要使荧光部分(Fl)或荧 光寿命调节剂(M)存在于肽接头的末端(N端或C端)。因此，Fl可与 X1中的氨基酸残基相连接并且M可与X2中的氨基酸残基相连接，或反 之亦然。如果荧光寿命调节剂M自身由氨基酸残基(例如，色氨酸、酪 氨酸、苯丙氨酸、萘基丙氨酸或组氨酸或其衍生物)的侧链提供，则充当 调节剂M的氨基酸残基自身可形成由X2表示的氨基酸序列的一部分。 氨基酸序列X1和X2可包含天然或非天然氨基酸残基，以及其他修饰(例 如非肽键)。

在基于精氨酸甲基化之测定的情况下，由N表示的精氨酸残基根据 所讨论精氨酸甲基转移酶的活性可被单甲基化或二甲基化，后者为对称构 型或不对称构型。甲基化的精确程度和二甲基化形式的构型对于测定的性 能并不重要，因此在精氨酸甲基化的情况下，残基N(Me)可代表单甲基化、 二甲基化形式中的任何一种。

在基于赖氨酸甲基化之测定的情况下，由N表示的赖氨酸残基根据 所讨论赖氨酸甲基转移酶的活性可被单、二或三甲基化。甲基化的精确程 度和二甲基化或三甲基化形式的构型对于测定的性能并不重要，因此在赖 氨酸甲基化的情况下，残基N(Me)可代表单、二或三甲基化形式中的任何 一种。

在结构(I)的底物中，荧光部分Fl(其优选是9-氨基吖啶(9AA)，但 是可以是任何其他合适的荧光部分)的荧光寿命受底物中荧光寿命调节剂 M(M优选是色氨酸，但是可以是任何其他已知的荧光寿命调节剂)之 存在的调节。用在邻近残基N1(例如，赖氨酸或精氨酸)处切割的蛋白 酶处理结构(I)的底物将引起蛋白质水解并且移除调节剂M对荧光寿命的 调节。残基N1(例如，赖氨酸或精氨酸)被适当的甲基转移酶甲基化后， 用蛋白酶处理结构(II)的经修饰肽不引起残基N1后的切割并且荧光部分 (Fl)的寿命仍受调节。在底物(I)持续转化为经修饰底物(II)的情况下， 如在时间过程测定中，荧光部分(Fl)的荧光寿命将作为时间(以及甲基 转移酶的浓度)的函数而降低。荧光寿命相对于100％未经修饰底物(I) 的基线测量值的变化(降低)表明发生了底物(I)向经修饰底物(II)的一些 转化。该变化的幅度可因此用于评价由甲基转移酶之作用引起的底物(I) 向经修饰底物(II)的转化。

因此，本文中提供了一种测定蛋白质甲基转移酶之活性的方法，其包 括：

(a)在允许荧光受调节之酶底物酶促转化为通式(II)的经修饰底物的 条件下使受试样品与通式(I)的荧光受调节之酶底物相接触

Fl-X1-N1-X2-M  (I)

其中X1表示第一氨基酸序列，Fl表示与X1缀合的荧光部分，N1 表示通过甲基转移酶之作用而甲基化的氨基酸残基，X2表示第二氨基酸 序列，并且M表示与X2缀合的荧光寿命调节剂

Fl-X1-N1(Me)-X2-M  (II)

其中N(Me)表示通过蛋白质甲基转移酶之作用而对残基N的甲基化；

(b)使步骤(a)的产物与蛋白酶相接触，所述蛋白酶能够在邻近残基 N1处切割通式(I)的荧光受调节之酶底物，但是不能在Fl与M之间切割 通式(II)的经修饰底物；以及

(c)检测荧光部分Fl之荧光寿命的变化，从而测定蛋白质甲基转移酶 的活性。

通过在步骤(a)中添加待测试抑制剂活性的候选化合物，该方法可容 易地用于筛选蛋白质甲基转移酶的抑制剂。

附图13中示意性地示出了通过荧光寿命蛋白质保护途径测定蛋白质 甲基转移酶(PMT)的方法的一个具体实施例，所述蛋白质甲基转移酶 将一个或更多个甲基转移至肽/蛋白质底物中的赖氨酸或精氨酸残基。该 实施例基于使用9-氨基吖啶作为荧光部分并且使用色氨酸残基的吲哚基 侧链作为荧光寿命调节剂。然而，应理解，这些具体的荧光部分和荧光寿 命调节剂部分仅通过示例示出，并且可替换为本文中所述的替代性荧光部 分和荧光寿命调节剂部分。

上述的一般方法可适用于任何目的甲基转移酶，包括在赖氨酸上甲基 化的甲基转移酶(统称为PKMT)和在精氨酸上甲基化的甲基转移酶(统 称为PRMT)二者。在一些具体的实施方案中，测定可用于确定在赖氨 酸或精氨酸上甲基化组蛋白之组蛋白甲基转移酶的活性。所述方法可用于 任何组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶，包括属于酶类EC2.1.1.43的所有组蛋 白-赖氨酸N-甲基转移酶。可使用该方法进行测定的具体PKMT酶包括 例如G9a、Set7/9、GLP和EZH2。

蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)催化S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM) 中的甲基转移到精氨酸残基的胍基氮。PRMT基于它们催化对称二甲基 化还是非对称二甲基化可划分为两种类型。H3特异性精氨酸甲基转移酶 CARM1/PRMT4属于1型蛋白质N-甲基转移酶家族。合适的PRMT酶 还包括例如PRMT1、PRMT3和PRMT5。所述测定方法可用于确定任何 组蛋白-精氨酸N-甲基转移酶(包括属于酶类EC2.1.1.125的任何组蛋白- 精氨酸N-甲基转移酶)的活性。

基于使用9-氨基吖啶(9AA)作为荧光部分和色氨酸(W)作为荧光 寿命调节剂部分的用于代表性PKMT酶G9a的示例性底物包括以下：

肽4：9AA-TARK⁹STGW-CONH₂

肽5：K(9AA)QTARK⁹STGW-CONH₂

肽6：ARTK(9AA)QTARK⁹STGGW-CONH₂

肽7：ARTWQTARK⁹STGGK(9AA)-CONH₂

肽8：WQTARK⁹STGGK(9AA)-CONH₂

肽9：K(9AA)ARTK(Me)QTARK⁹STGGW-CONH₂。

K⁹表示PKMT酶G9a作用的甲基化位点赖氨酸残基并且模拟组蛋白 H3内发生赖氨酸甲基化形成G9a之天然底物的序列环境。

基于使用9-氨基吖啶(9AA)作为荧光部分和色氨酸(W)作为荧光 寿命调节剂部分的用于代表性PKMT酶Set7/9的示例性底物包括以下：

肽12：WARTK⁴QTARK(9AA)STGGKAPRKQLAK-CONH₂

肽13：WRTK⁴QTARK(9AA)STGGKAPRKQLAK-CONH₂

K⁴表示PKMT酶Set7/9作用之甲基化位点的赖氨酸残基并且模拟组 蛋白H3内发生赖氨酸甲基化形成Set7/9之天然底物的序列环境。

基于使用9-氨基吖啶(9AA)作为荧光部分和色氨酸(W)作为荧光 寿命调节剂部分的用于代表性PRMT酶PRMT5的示例性底物包括以下：

肽14：WSGR³GKGGK(9AA)GLGKGGAKRHRK-CONH₂

肽15：Ac-WSGR³GKGGK(9AA)GLGKGGAKRHRK-CONH₂

R³表示PRMT酶PRMT5作用之甲基化位点的精氨酸残基并且模拟 组蛋白H4内发生精氨酸甲基化形成PRMT5之天然底物的序列环境。肽 15是在N端被乙酰化(Ac)。

基于使用9-氨基吖啶(9AA)作为荧光部分和色氨酸(W)作为荧光 寿命调节剂部分的用于代表性PRMT酶EZH2的示例性底物包括以下：

肽20：PRKQLATK(9AA)AARK²⁷SAPATGGW-CONH₂

K²⁷表示PRMT酶EZH2作用之甲基化位点的赖氨酸残基并且模拟 组蛋白H3内发生赖氨酸甲基化形成EZH2之天然底物的序列环境。

可根据所附实施例举例说明的一般原则制备适用于测定其他PKMT 和PRMT酶的肽底物。

适用于上述一般方法的蛋白酶包括但不限于在赖氨酸之后切割的 Endo-LysC(用于基于赖氨酸甲基化的测定)和在精氨酸之后切割的 Endo-ArgC(用于基于精氨酸甲基化的测定)。

(2)乙酰转移酶测定

在一个实施方案中，本文中所述测定方法可适用于测定乙酰转移酶的 活性。

用于该测定的底物包含肽接头，并且具有一般结构(III)：

Fl-X3-N2-X4-M  (III)

其中X3表示第一氨基酸序列，Fl表示与X3缀合的荧光部分，N2 表示通过乙酰转移酶之作用而乙酰化的氨基酸残基，X4表示第二氨基酸 序列并且M表示与X4缀合的荧光寿命调节剂。在用乙酰转移酶处理之 后，底物转化为由以下一般结构表示的经修饰(乙酰化)底物：

Fl-X3-N2(Ac)-X4-M  (IV)

其中N2(Ac)表示残基N2的乙酰化。

应理解，Fl和M实际上可以以任一定向存在。残基N2通常是赖氨 酸(在用于赖氨酸乙酰化酶之测定的情况下)。

选择氨基酸序列X3和X4二者以使残基N2放置在乙酰化的适当序 列环境中，并且通过蛋白酶进行切割(未乙酰化的结构(III))，而且还提 供荧光部分(Fl)和荧光寿命调节剂(M)的最佳定向以实现Fl荧光寿 命的有效调节。X3和X4的序列可基于待测定乙酰转移酶的天然底物的 序列。应理解，虽然为了有效调节荧光寿命，需要将荧光部分(Fl)和荧 光寿命调节剂(M)以适当间隔定位，但是没有必要使荧光部分(Fl)或 荧光寿命调节剂(M)存在于肽接头的末端(N端或C端)。因此，Fl可 与X3中的氨基酸残基相连接并且M可与X4中的氨基酸残基相连接，或 者反之亦然。如果荧光寿命调节剂M自身由氨基酸残基(例如，色氨酸、 酪氨酸、苯丙氨酸、萘基丙氨酸或组氨酸或其衍生物)的侧链提供，则充 当调节剂M的氨基酸残基自身可形成由X4表示的氨基酸序列的一部分。 氨基酸序列X3和X4可包含天然或非天然氨基酸残基，以及其他修饰(例 如非肽键)。

在结构(III)的底物中，荧光部分Fl(优选是9-氨基吖啶(9AA)，但 是可以是任何其他合适的荧光部分)的荧光寿命受底物中荧光寿命调节剂 M(M优选是色氨酸，但是可以是任何其他已知的荧光寿命调节剂)之 存在的调节。用在残基N2(例如，赖氨酸)之后切割的蛋白酶处理结构 (III)的底物将引起蛋白质水解并且移除调节剂M对荧光寿命的调节。残 基N2(例如，赖氨酸)被适当的乙酰转移酶乙酰化后，用蛋白酶处理结 构(IV)的经修饰肽不引起残基N2之后的切割并且荧光部分(Fl)的寿命 仍受调节。在底物(III)持续转化为经修饰底物(IV)的情况下，如在时间过 程测定中，荧光部分(Fl)的荧光寿命将作为时间(以及乙酰转移酶的浓 度)的函数而降低。荧光寿命相对于100％未经修饰底物(III)的基线测量 值的变化(降低)表明发生了底物(III)向经修饰底物(IV)的一些转化。该 变化的幅度可因此用于评价由乙酰转移酶之作用而引起的底物(III)向经 修饰底物(IV)的转化。

因此，本文中提供了一种测定蛋白质乙酰转移酶之活性的方法，其包 括：

(a)在允许荧光受调节之酶底物酶促转化为通式(IV)的经修饰底物的 条件下使受试样品与通式(III)的荧光受调节之酶底物相接触，

Fl-X3-N2-X4-M  (III)

其中X3表示第一氨基酸序列，Fl表示与X3缀合的荧光部分，N2表

示通过乙酰转移酶之作用而乙酰化的氨基酸残基，X4表示第二氨基酸

序列并且M表示与X4缀合的荧光寿命调节剂

Fl-X3-N2(Ac)-X4-M  (IV)

其中N2(Ac)表示通过蛋白质乙酰转移酶之作用而对残基N2的乙酰化；

(b)使步骤(a)的产物与蛋白酶相接触，所述蛋白酶能够在邻近残基 N2处切割通式(III)的荧光受调节之酶底物，但是不能在Fl与M之间切 割通式(IV)的经修饰底物；以及

(c)检测荧光部分Fl荧光寿命的变化，从而测定蛋白质乙酰转移酶的 活性。

通过在步骤(a)中添加待测试抑制剂活性的候选化合物，该方法可容 易地用于筛选蛋白质乙酰转移酶的抑制剂。

附图27中示意性地示出了通过FLT蛋白酶保护法测定组蛋白乙酰转 移酶(HAT)的方法的一个具体实施例，所述组蛋白乙酰转移酶使肽/蛋 白质底物中的赖氨酸残基乙酰化。该实施例基于使用9-氨基吖啶作为荧光 部分并且使用色氨酸残基的吲哚基侧链作为荧光寿命调节剂。然而，应理 解，这些具体的荧光部分和荧光寿命调节剂部分仅通过示例示出，并且可 替换为本文中所述的替代性荧光部分和荧光寿命调节剂部分。

上述的一般方法可用于确定任何目的乙酰转移酶(包括但不限于任何 已知的组蛋白乙酰转移酶，包括属于酶类EC2.3.1.48的任何组蛋白乙酰 转移酶)的活性。特别地，所述测定方法可用于组蛋白乙酰转移酶Gcn5、 PCAF、Hat1和p300(作为非限制性实例而给出)。

基于在赖氨酸残基(特定HAT之乙酰化的位点)侧翼并入荧光团(Fl) 和调节剂部分(M)的组蛋白N端序列的肽底物可形成该类酶FLT蛋白 酶保护测定的基础。在以下以及图28和53中示出了这种底物的序列，其 基于使用9-氨基吖啶(9-AA)作为荧光部分并且使用色氨酸(W)作为 荧光寿命调节剂部分，以及使用具有HAT(例如，PCAF)乙酰化位点 K¹⁴的组蛋白H3序列。

肽16：WQTARK(Me)STGGK¹⁴APRK(9AA)QLATK-CONH₂

肽17：9AA-STGGK¹⁴APRWQLATK-CONH₂

可根据所附实施例说明的一般原则制备适用于测定其他乙酰转移酶 的肽底物。

适用于上述一般方法的蛋白酶包括但不限于在赖氨酸之后切割的 Endo-LysC(用于基于赖氨酸乙酰化的测定)。

(3)脱亚氨酶测定

在一个实施方案中，本文中所述测定方法可适用于测定脱亚氨酶的活 性。

用于该测定的底物包含肽接头，并且具有一般结构：

Fl-X5-R-X6-M  (V)

其中X5表示第一氨基酸序列，Fl表示与X5缀合的荧光部分，R表示 通过脱亚氨酶之作用而转化为瓜氨酸的精氨酸残基，X6表示第二氨基 酸序列并且M表示与X6缀合的荧光寿命调节剂。在用脱亚氨酶处理 之后，底物转化为由以下一般结构表示的修饰(脱亚氨化)底物：

Fl-X5-R(Cit)-X6-M  (VI)

其中R(Cit)表示残基R通过脱亚氨化转化为瓜氨酸。

应理解，Fl和M实际上可以以任一定向存在。选择氨基酸序列X5 和X6二者以使残基R放置在脱亚氨化为瓜氨酸的适当序列环境中，并且 通过蛋白酶进行切割(在结构(V)中)，而且还提供荧光部分(Fl)和荧光 寿命调节剂(M)的最佳定向以实现有效调节。X5和X6的序列可基于 待测定脱亚氨酶之天然底物的序列。应理解，虽然为了有效调节荧光寿命， 需要将荧光部分(Fl)和荧光寿命调节剂(M)以适当间隔定位，但是没 有必要使荧光部分(Fl)或荧光寿命调节剂(M)存在于肽接头的末端(N 端或C端)。因此，Fl可与X5中的氨基酸残基相连接并且M可与X6中 的氨基酸残基相连接，或者反之亦然。如果荧光寿命调节剂M自身由氨 基酸残基(例如，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、萘基丙氨酸或组氨酸或其 衍生物)的侧链提供，则充当调节剂M的氨基酸残基自身可形成由X6 表示的氨基酸序列的一部分。氨基酸序列X5和X6可包含天然或非天然 氨基酸残基，以及其他修饰(例如非肽键)。

在结构(V)的底物中，荧光部分Fl(优选是9-氨基吖啶(9AA)，但是 可以是任何其他合适的荧光部分)的荧光寿命受底物中荧光寿命调节剂M (M优选是色氨酸，但是可以是任何其他已知的荧光寿命调节剂)之存 在的调节。用在残基R之后切割的蛋白酶处理结构(V)的底物将引起蛋白 质水解并且移除调节剂M对荧光寿命的调节。在残基R通过适当的脱亚 氨酶转化为瓜氨酸后，用蛋白酶处理结构(VI)的经修饰肽不引起残基R之 后的切割并且荧光部分(Fl)的寿命仍受调节。在底物(V)持续转化为经 修饰底物(VI)的情况下，如在时间过程测定中，荧光部分(Fl)的荧光寿 命将作为时间(以及脱亚氨酶的浓度)的函数而降低。荧光寿命相对于 100％未经修饰底物(V)的基线测量值的变化(降低)表明发生了底物(V) 向经修饰底物(VI)的一些转化。该变化的幅度可因此用于评价由脱亚氨酶 之作用引起的底物(V)向经修饰底物(VI)的转化。

因此，本文中提供了一种测定蛋白质脱亚氨酶之活性的方法，其包括：

(a)在允许荧光受调节之酶底物酶促转化为通式(VI)的经修饰底物的 条件下使受试样品与通式(V)的荧光受调节之酶底物相接触

Fl-X5-R-X6-M  (V)

其中X5表示第一氨基酸序列，Fl表示与X5缀合的荧光部分，R表示 通过脱亚氨酶之作用而转化为瓜氨酸的精氨酸残基，X6表示第二氨基 酸序列并且M表示与X6缀合的荧光寿命调节剂

Fl-X5-R(Cit)-X6-M  (VI)

其中R(Cit)表示通过脱亚氨酶之作用而形成的瓜氨酸；

(b)使步骤(a)的产物与蛋白酶相接触，所述蛋白酶能够在邻近残基R 处切割通式(V)的荧光受调节之酶底物，但是不能在Fl与M之间切割通 式(VI)的经修饰底物；以及

(c)检测荧光部分Fl荧光寿命的变化，从而测定蛋白质脱亚氨酶的活 性。

通过在步骤(a)中添加待测试抑制剂活性的候选化合物，该方法可容 易地用于筛选蛋白质脱亚氨酶的抑制剂。

图1中示意性地示出了通过FLT蛋白酶保护法测定脱亚氨酶类酶(具 体是将肽/蛋白质底物中的精氨酸残基转化为瓜氨酸的肽基精氨酸脱亚氨 酶)的方法的一个具体实例。该实例基于使用9-氨基吖啶作为荧光部分和 使用色氨酸残基的吲哚基侧链作为荧光寿命调节剂。然而，应理解，这些 具体的荧光部分和荧光寿命调节剂部分仅通过示例示出，并且可替换为本 文中所述的替代性荧光部分和荧光寿命调节剂部分。

上述的一般方法可适用于任何目的脱亚氨酶，包括但不限于肽基精氨 酸脱亚氨酶(PAD)，例如PAD1、PAD2、PAD3、PAD4和PAD6。特别 地，所述方法可用于属于酶类EC3.5.1.15的任何肽基精氨酸脱亚氨酶 (PAD)。PAD酶可被替代性地称为蛋白质-精氨酸脱亚氨酶。

以下示出了用于测定PAD2或PAD4活性的合适底物的实例，其基于 使用9-氨基吖啶(9-AA)作为荧光部分和色氨酸(W)作为荧光寿命调 节剂部分：

肽1：9AA-QSTRGSGHWKK-CONH₂

肽3：K(9AA)-HQSTRGSGHWKK-CONH₂

可根据以上所述和所附实施例说明的一般原则制备适用于测定其他 脱亚氨酶(特别是其他肽基精氨酸脱亚氨酶)的肽底物。

适用于上述一般方法的蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶和在精氨酸之 后切割的Endo-ArgC。

(B)基于移除蛋白酶保护之修饰的测定

测定的第二组实施方案基于使用这样的底物，其包含与荧光部分和配 置成调节荧光部分之荧光寿命的荧光寿命调节剂部分相缀合的肽接头分 子，所述肽通过修饰酶之作用而修饰形成经修饰肽，其中底物中的肽在荧 光部分与荧光寿命调节剂部分之间不能被第二种酶(即，蛋白酶)切割， 并且修饰酶对肽的修饰将肽转化为经修饰肽，所述经修饰肽在荧光部分与 荧光寿命调节剂部分之间被第二种酶(即，蛋白酶)切割。在这样的一些 实施方案中，底物在荧光部分与荧光寿命调节剂部分之间对第二种酶(蛋 白酶)的切割不敏感，但是通过修饰酶作用于底物形成的经修饰底物在荧 光部分与荧光寿命调节剂部分之间被第二种酶(即，蛋白酶)切割，从而 使得荧光部分的荧光寿命提高。因此，与未经修饰肽相比，蛋白酶处理后 荧光部分的荧光寿命的时间依赖性提高表明形成了经修饰肽(通过修饰酶 作用于底物而形成)。

该测定的一些非限制性实施方案如下：

(4)脱甲基酶测定

在一个实施方案中，本文中所述测定方法可适用于测定脱甲基酶的活 性。

用于该测定的底物包含肽接头，并且具有一般结构(VII)：

Fl-X7-N3(Me)-X8-M  (VII)

其中X7表示第一氨基酸序列，Fl表示与X7缀合的荧光部分，N3(Me) 表示通过脱甲基酶之作用而脱甲基化的甲基化氨基酸残基(例如，甲 基化赖氨酸或甲基化精氨酸)，X8表示第二氨基酸序列并且M表示与 X8缀合的荧光寿命调节剂。在用脱甲基酶处理之后，底物转化为由以 下一般结构表示的经修饰(脱甲基化)底物：

Fl-X7-N3-X8-M  (VIII)

其中N3表示脱甲基化氨基酸(例如赖氨酸或精氨酸)。

应理解，Fl和M实际上可以以任一定向存在。选择氨基酸序列X7 和X8二者以使残基N3(Me)放置在甲基化的适当序列环境中并且被蛋白 酶切割(在结构(VIII)的经修饰底物中)，而且还提供荧光部分(Fl)和荧 光寿命调节剂(M)的最佳定向以实现Fl荧光寿命的有效调节。X7和 X8的序列可基于待测定脱甲基酶之天然底物的序列。应理解，虽然为了 有效调节荧光寿命，需要将荧光部分(Fl)和荧光寿命调节剂(M)以适 当间隔定位，但是没有必要使荧光部分(Fl)或荧光寿命调节剂(M)存 在于肽接头的末端(N端或C端)。因此，Fl可与X7中的氨基酸残基相 连接并且M可与X8中的氨基酸残基相连接，或者反之亦然。如果荧光 寿命调节剂M自身由氨基酸残基(例如，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、 萘基丙氨酸或组氨酸或其衍生物)的侧链提供，则充当调节剂M的氨基 酸残基自身可形成由X8表示的氨基酸序列的一部分。氨基酸序列X7和 X8可包含天然或非天然氨基酸残基，以及其他修饰(例如非肽键)。

在基于精氨酸脱甲基化之测定的情况下，由N(Me)表示的精氨酸残基 根据待测定其活性的脱甲基酶的底物特异性可以被单甲基化或二甲基化， 后者为对称构型或不对称构型。初始底物甲基化的精确程度和二甲基化形 式的构型对于测定的性能并不重要，前提是待测定脱甲基酶能够使底物脱 甲基化为可被蛋白酶切割的完全脱甲基化形式。因此，在精氨酸甲基化的 情况下，残基N(Me)视测定的环境可代表单甲基化或二甲基化形式中的任 何一种。

在基于赖氨酸脱甲基化之测定的情况下，由N(Me)表示的赖氨酸残基 根据待测定其活性的脱甲基酶的底物特异性可以被单、二或三甲基化。初 始底物甲基化的精确程度和二甲基化形式的构型对于测定的性能并不重 要，前提是待测定脱甲基酶能够使底物脱甲基化为可被蛋白酶切割的完全 脱甲基化形式。因此，在赖氨酸甲基化的情况下，残基N(Me)视测定的环 境可代表单、二或三甲基化形式中的任何一种。

在结构(VII)的底物中，荧光部分Fl(优选是9-氨基吖啶(9AA)，但 是可以是任何其他合适的荧光部分)的荧光寿命受底物中荧光寿命调节剂 M(M优选是色氨酸，但是可以是任何其他已知的荧光寿命调节剂)之 存在的调节。在不存在任何脱甲基酶的情况下，用在残基N3(例如，赖 氨酸或精氨酸)之后切割的蛋白酶处理结构(VII)的底物在Fl与M之间不引起蛋白质水解，原因是结构(VII)的底物包含N3的甲基化形式并因此对 蛋白质水解具有抗性。因此保留荧光寿命调节剂M(例如，色氨酸)对 荧光部分Fl(例如，9AA)的荧光寿命调节。在脱甲基酶存在下，残基 N3(Me)脱甲基化形成结构(VIII)的经修饰底物中的残基N3。用蛋白酶处 理结构(VIII)的经修饰底物引起残基N3(例如，赖氨酸或精氨酸)之后的 切割并且荧光团(例如，9AA)的荧光寿命不再受调节。在底物(VII)持续 转化为经修饰底物(VIII)的情况下，如在时间过程测定中，荧光部分(Fl) 的荧光寿命将作为时间(以及脱甲基酶的浓度)的函数而提高，原因是形 成了更多的经修饰底物并且其通过蛋白酶的作用而被切割。荧光寿命相对 于100％未经修饰底物(VII)的基线测量值的变化(提高)表明发生了底物 (VII)向经修饰底物(VIII)的一些转化。该变化的幅度可因此用于评价由脱 甲基酶引起的底物(VII)向经修饰底物(VIII)的转化。

因此，本文中提供了测定蛋白质脱甲基酶之活性的方法，其包括：

(a)在允许荧光受调节之酶底物酶促转化为通式(VIII)的经修饰底物 的条件下使受试样品与通式(VII)的荧光受调节之酶底物相接触

Fl-X7-N3(Me)-X8-M  (VII)

其中X7表示第一氨基酸序列，Fl表示与X7缀合的荧光部分，N3(Me) 表示通过脱甲基酶之作用而脱甲基化的甲基化氨基酸残基(例如，甲 基化赖氨酸或甲基化精氨酸)，X8表示第二氨基酸序列并且M表示与 X8缀合的荧光寿命调节剂

Fl-X7-N3-X8-M  (VIII)

其中N3表示通过脱甲基酶之作用的脱甲基化氨基酸；

(b)使步骤(a)的产物与蛋白酶相接触，所述蛋白酶能够在邻近残基 N3处切割通式(VIII)的经修饰底物，但是不能在Fl与M之间切割通式(VII) 的荧光受调节之酶底物；以及

(c)检测荧光部分Fl荧光寿命的变化，从而测定蛋白质脱甲基酶的活 性。

通过在步骤(a)中添加待测试抑制剂活性的候选化合物，该方法可容 易地用于筛选蛋白质脱甲基酶的抑制剂。

图25中示意性地示出了通过FLT蛋白酶保护法测定蛋白质脱甲基酶 (PDM)之方法的一个具体实施例，所述蛋白质脱甲基酶将肽/蛋白质底 物中赖氨酸或精氨酸残基的一个或更多个甲基移除。该实施例基于使用 9-氨基吖啶作为荧光部分并且使用色氨酸残基的吲哚基侧链作为荧光寿 命调节剂。然而，应理解，这些具体的荧光部分和荧光寿命调节剂部分仅 通过示例示出，并且可替换为本文中所述的替代性荧光部分和荧光寿命调 节剂部分。

上述的一般方法可适用于任何目的脱甲基酶。特别优选的是使在赖氨 酸上甲基化的肽底物脱甲基化的PKDM酶。特别地，所述测定方法可用 于组蛋白-赖氨酸脱甲基酶。组蛋白-赖氨酸脱甲基酶可根据底物特异性进 行分类。使赖氨酸残基组蛋白H3脱甲基化的组蛋白-赖氨酸脱甲基酶可使 赖氨酸4(称为[组蛋白-H3]-赖氨酸-4脱甲基酶；EC1.14.11.B2)、赖氨酸 9(称为[组蛋白-H3]-赖氨酸-9脱甲基酶；EC1.14.11.B1)、赖氨酸36(称 为[组蛋白-H3]-赖氨酸-36脱甲基酶；EC1.14.11.27)或赖氨酸27(称为[组 蛋白-H3]-赖氨酸-27脱甲基酶)脱甲基化。使组氨酸H4中赖氨酸残基脱 甲基化的组蛋白-赖氨酸脱甲基酶可使赖氨酸20脱甲基化。上述测定方法 可用于属于组蛋白-赖氨酸脱甲基酶这些类中的任何一种，其包括但不限 于LSD1、JHDM1A、JMJD1A、JMJD2A、JMJD2B、JMJD2C、JMJD3 (KDM6)、FBXL(KDM2)和KDM5，仅通过示例给出)。

所述测定还可用于使在精氨酸上甲基化的肽底物脱甲基化的精氨酸 脱甲基酶(PRDM酶)，例如JMJD6。

以下示出了用于代表性PKDM酶JHDM1A的FLT测定的合适底物。 JHDM1A优先使组蛋白H3的赖氨酸36脱甲基化，将其由二甲基化或单 甲基化状态转化为天然的未甲基化残基。因此，所述底物基于适当序列环 境中的残基赖氨酸36。

肽10：9AA-ATGGVK³⁶(Me)K(Me)PHRYW-CONH₂

在该示例性底物中，荧光部分9AA(或其他合适的荧光部分)的荧 光寿命受在C端附近并入的色氨酸氨基(或其他合适的荧光寿命调节剂) 之存在的调节。JHDM1A对赖氨酸-36的脱甲基化允许在该残基处的蛋白 酶诱导切割，从而减轻调节并导致9AA的荧光寿命提高。相比之下， JHDM1A抑制剂的存在将阻止赖氨酸脱甲基化，从而使肽在赖氨酸-36处 保留对蛋白酶诱导切割的抗性。因此，9AA的荧光寿命仍受调节并且调 节程度与脱甲基化的程度相关。用于该测定的合适蛋白酶是不切割甲基化 赖氨酸(赖氨酸-37作为单甲基衍生物而被保护以防止在该残基处发生非 特异性切割)的Endo-LysC。

以下示出了用于代表性PKDM酶JHDM1A之FLT测定的第二种合 适底物。

肽11：9AA-ATGGVK³⁶(Me)KPHW-CONH₂

在该示例性底物中，荧光部分9AA(或其他合适的荧光部分)的荧 光寿命受在C端附近并入的色氨酸氨基残基(或其他合适的荧光寿命调 节剂)之存在的调节。JHDM1A对赖氨酸-36的脱甲基化允许在该残基处 的蛋白酶诱导切割，从而减轻调节并导致9AA的荧光寿命提高。相比之 下，JHDM1A抑制剂的存在将阻止赖氨酸脱甲基化，从而使肽在赖氨酸 -36处保留对蛋白酶诱导切割的抗性。因此，9AA的荧光寿命将仍受调节 并且调节程度与脱甲基化的程度相关。用于该测定的合适蛋白酶是报道为 不切割相邻C端残基是脯氨酸之赖氨酸的胰蛋白酶(例如，Keil，B. Specificity of Proteolyis)或切割活性严重受损的胰蛋白酶(Rodriguez，J.， 等，J.Prot.Research，2008，7，300-305)，从而确保防止赖氨酸-37处的非 特异性切割，或使其降低至很小的水平。

可根据上述的一般原则制备适用于测定其他脱甲基酶的肽底物。

(5)脱乙酰酶测定

在一个实施方案中，本文中所述测定方法可适用于测定脱乙酰酶的活 性。

用于该测定的底物包含肽接头，并且具有以下一般结构：

Fl-X9-N4(Ac)-X10-M  (IX)

其中X9表示第一氨基酸序列，Fl表示与X9缀合的荧光部分，N4(Ac) 表示通过脱乙酰酶之作用脱而乙酰化的乙酰化氨基酸残基(例如，乙 酰化赖氨酸)，X10表示第二氨基酸序列并且M表示与X10缀合的荧 光寿命调节剂。在用脱乙酰酶处理之后，底物转化为由以下一般结构 表示的经修饰(脱乙酰化)底物：

Fl-X9-N4-X10-M  (X)

其中N4表示脱乙酰化氨基酸，例如赖氨酸。

应理解，Fl和M实际上可以以任一定向存在。选择氨基酸序列X9 和X10二者以使残基N4(Ac)放置在脱乙酰化的适当序列环境中并且被蛋 白酶切割(在结构(X)的经修饰底物中)，而且还提供荧光部分(Fl)和荧 光寿命调节剂(M)的最佳定向以实现有效调节。X9和X10的序列可基 于待测定脱乙酰酶之天然底物的序列。应理解，虽然为了有效调节荧光寿 命，需要将荧光部分(Fl)和荧光寿命调节剂(M)以适当间隔定位，但 是没有必要使荧光部分(Fl)或荧光寿命调节剂(M)存在于肽接头的末 端(N端或C端)。因此，Fl可与X9中的氨基酸残基相连接并且M可与 X10中的氨基酸残基相连接，或者反之亦然。如果荧光寿命调节剂M自 身由氨基酸残基(例如，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、萘基丙氨酸或组氨 酸或其衍生物)的侧链提供，则充当调节剂M的氨基酸残基自身可形成 由X10表示的氨基酸序列的一部分。氨基酸序列X9和X10可包含天然 或非天然氨基酸残基，以及其他修饰(例如非肽键)。

在结构(IX)的底物中，荧光部分Fl(优选是9-氨基吖啶(9AA)，但 是可以是任何其他合适的荧光部分)的荧光寿命受底物中荧光寿命调节剂 M(M优选是色氨酸，但是可以是任何其他已知的荧光寿命调节剂)之 存在的调节。在不存在任何脱乙酰酶的情况下，用在残基N4(例如，赖 氨酸)之后切割的蛋白酶处理不引起结构(IX)之底物在Fl与M之间的蛋 白质水解，原因是结构(IX)的底物包含N4的乙酰化形式并因此对蛋白质 水解具有抗性。因此使荧光寿命调节剂M(例如，色氨酸)对荧光部分 Fl(例如，9AA)的荧光寿命调节保持未受损。在脱乙酰酶存在下，残基 N4(Ac)脱乙酰化以形成结构(X)之经修饰底物中的残基N4。用蛋白酶处理 结构(X)的经修饰底物引起残基N4(例如，赖氨酸)之后的切割并且荧光 团(例如，9AA)的荧光寿命不再受调节。

在底物(IX)持续转化为经修饰底物(X)的情况下，如在时间过程测定 中，荧光部分(Fl)的荧光寿命将作为时间(以及脱乙酰酶的浓度)的函 数而提高，原因是形成了更多的经修饰底物并且其通过蛋白酶的作用而被 切割。荧光寿命相对于100％未经修饰底物(IX)的基线测量值的变化(提 高)表明发生了底物(IX)向经修饰底物(X)的一些转化。该变化的幅度可 因此用于评价由脱乙酰酶引起的底物(IX)向经修饰底物(X)的转化。

因此，本文中提供了测定蛋白质脱乙酰酶之活性的方法，其包括：

(a)在允许荧光受调节之酶底物酶促转化为通式(X)之经修饰底物的 条件下使受试样品与通式(IX)的荧光受调节之酶底物相接触

Fl-X9-N4(Ac)-X10-M  (IX)

其中X9表示第一氨基酸序列，Fl表示与X9缀合的荧光部分，N4(Ac) 表示通过脱乙酰酶之作用脱而乙酰化的乙酰化氨基酸残基(例如，乙 酰化赖氨酸)，X10表示第二氨基酸序列并且M表示与X10缀合的荧 光寿命调节剂，

Fl-X9-N4-X10-M  (X)

其中N4表示通过脱乙酰酶之作用的脱乙酰化氨基酸；

(b)使步骤(a)的产物与蛋白酶相接触，所述蛋白酶能够在邻近残基 N4处切割通式(X)的经修饰底物，但是不能在Fl与M之间切割通式(IX) 的荧光受调节之酶底物；以及

(c)检测荧光部分Fl之荧光寿命的变化，从而测定蛋白质脱乙酰酶的 活性。

通过在步骤(a)中添加待测试抑制剂活性的候选化合物，该方法可容 易地用于筛选蛋白质脱乙酰酶的抑制剂。

图29中示意性地示出了通过FLT蛋白酶保护法测定蛋白质脱乙酰酶 (例如组蛋白脱乙酰酶(HDAC))之方法的一个具体实施例，所述脱乙 酰酶从肽/蛋白质底物的赖氨酸残基中移除一个或更多个乙酰基。该实施 例基于使用9-氨基吖啶作为荧光部分并且使用色氨酸残基的吲哚基侧链 作为荧光寿命调节剂。然而，应理解，这些具体的荧光部分和荧光寿命调 节剂部分仅通过示例示出，并且可替换为本文中所述的替代性荧光部分和 荧光寿命调节剂部分。

上述的一般方法可适用于任何目的脱乙酰酶。特别优选的是组蛋白脱 乙酰酶(HDAC)酶，包括但不限于HDAC1-11和SIRT1-5。特别地，上 述测定方法可用于酶类EC3.5.1.98中的任何属于组蛋白脱乙酰酶，其包 括属于HDAC1、HDAC2和HDAC3三种亚类之一的酶。

以下说明了一种示例性HDAC底物：

Ac-Trp-Xaa-Lys(Ac)-Lys(9AA)

Xaa＝任意氨基酸。

以下说明了一种示例性HDAC1底物：

肽18：Ac-IWK(Ac)K(9AA)-CONH₂

在这些底物中，荧光部分(9AA或其他合适的荧光部分)在邻近脱 乙酰化赖氨酸的C端并入，并且色氨酸(或其他合适的荧光寿命调节剂) 位于上述赖氨酸N端侧。HDAC1催化脱乙酰化后的蛋白酶诱导切割导致 荧光寿命提高，原因是9AA与色氨酸残基被分开。因此，荧光寿命的提 高与HDAC的活性可直接相关。当然，考虑可根据所讨论HDAC的序列 特异性设计其他类似地设计的底物。

测定的实践应用

本文中所述测定方法都可以以高通量筛选测定形式进行，其增强了用 于筛选和鉴定修饰酶抑制剂之测定的效用。

当将本文中所述测定用于筛选环境时，上述测定在待测定抑制剂活性 的化合物存在下进行。这样的高通量筛选测定的一般形式为本领域技术普 通人员所熟知。通常，化合物与合适的测定对照(例如，无抑制剂、无修 饰酶、高浓度的已知抑制剂)进行平行测试。化合物可在数个不同浓度下 进行平行测试。如通过测定的荧光寿命示值读数的变化所表明的，在受试 化合物存在下修饰酶活性的降低将所述受试化合物鉴定为所述修饰酶的 抑制剂。

本发明的测定通常可在多孔板的板中进行，例如具有24孔、96孔、 384孔或更高密度的孔(例如864孔或1536孔)的微滴定板。

用于鉴定酶抑制剂的高通量筛选测定通常利用高纯形式的修饰酶，例 如重组酶。将支持修饰酶活性之合适酶反应缓冲液中的修饰酶和相应的荧 光受调节之底物与受试化合物(可能的酶抑制剂)一起添加到多孔板的孔 中。考虑到测试的酶的动力学，通常在合适的浓度范围(例如，10nM至 10μM)中在连续稀释下测试化合物。添加到孔中的修饰酶的量和底物的 量维持不变(除了不包含酶的对照孔之外)。还可以制备包含高浓度已知 酶抑制剂的对照孔以及不包含化合物的孔。然后将所制备的包含酶、荧光 受调节之酶底物和受试化合物的板以及适当的对照在不存在任何抑制剂 时修饰酶具有活性的条件下孵育。在该孵育期间发生通过修饰酶作用的底 物向经修饰底物的转化。如果受试化合物是修饰酶的抑制剂，则通过酶的 荧光受调节之底物向经修饰底物的转化将被抑制，抑制程度取决于抑制剂 的浓度及其作为抑制剂的效力。当然，除了作为修饰酶活性的结果，不发 生底物转化为经修饰底物对于测定性能来说是至关重要的。

可对添加到测定中的修饰酶量和允许底物转化为修饰酶的孵育时长 进行选择以优化测定的动态范围。例如，可选择添加的酶量和孵育时间以 实现在不存在任何抑制剂的情况下底物向经修饰底物的转化小于100％。

酶、底物和抑制剂的孵育完成后，就添加第二种酶(例如，蛋白酶) 并使用适当仪器(例如，NanoTaurus^TM读板器)监测荧光寿命。如本文 其他地方所解释的，所述测定可基于测量平均荧光寿命，或者基于测量对 应于底物或产物的具有特异性寿命的具体荧光物质的量，即特异性测量表 现出“长”荧光寿命(调节不存在)的切割底物/经修饰底物或特异性测 量未切割底物/经修饰底物(调节仍存在)。在任一情况下，对于所使用的 每一种浓度的受试化合物，荧光寿命测量都为受试化合物存在下修饰酶的 活性提供了指示。可由相对于受试化合物浓度的％剩余修饰酶活性的作图 来确定受试化合物的IC₅₀值。

肽底物

本发明的另一方面提供了用于实施本文中所述酶测定的肽底物。特别 地，提供了以下底物：

(1)用于甲基转移酶测定的底物

Fl-X1-N1-X2-M  (I)，或

M-X1-N1-X2-Fl  (I’)

其中X1表示第一氨基酸序列，Fl表示与X1(或在I’中与X2)缀合 的荧光部分，N1表示通过甲基转移酶之作用而甲基化的氨基酸残基，X2 表示第二氨基酸序列并且M表示与X2(或在I’中与X1)缀合的荧光寿 命调节剂。

在一些非限制性实施方案中，所述底物可以是以下荧光受调节之肽中 的一种：

肽4：9AA-TARK⁹STGW-CONH₂

肽5：K(9AA)QTARK⁹STGW-CONH₂

肽6：ARTK(9AA)QTARK⁹STGGW-CONH₂

肽7：ARTWQTARK⁹STGGK(9AA)-CONH₂

肽8：WQTARK⁹STGGK(9AA)-CONH₂

肽9：K(9AA)ARTK(Me)QTARK⁹STGGW-CONH₂

肽12：WARTK⁴QTARK(9AA)STGGKAPRKQLAK-CONH₂

肽13：WRTK⁴QTARK(9AA)STGGKAPRKQLAK-CONH₂

肽14：WSGR³GKGGK(9AA)GLGKGGAKRHRK-CONH₂

肽15：Ac-WSGR³GKGGK(9AA)GLGKGGAKRHRK-CONH₂

肽20：PRKQLATK(9AA)AARK²⁷SAPATGGW-CONH₂

(2)用于乙酰转移酶测定的底物

Fl-X3-N2-X4-M  (III)，或

M-X3-N2-X4-Fl  (III’)

其中X3表示第一氨基酸序列，Fl表示与X3(或在III’中与X4)缀 合的荧光部分，N2表示通过乙酰转移酶之作用而乙酰化的氨基酸残基， X4表示第二氨基酸序列并且M表示与X4(或在III’中与X3)缀合的荧 光寿命调节剂。

在一些非限制性实施方案中，所述底物可以是以下荧光受调节之肽中 的一种：

肽16：WQTARK(Me)STGGK¹⁴APRK(9AA)QLATK-CONH₂

肽17：9AA-STGGK¹⁴APRWQLATK-CONH₂

(3)用于脱亚氨酶测定的底物

Fl-X5-R-X6-M  (V)，或

M-X5-R-X6-Fl  (V’)

其中X5表示第一氨基酸序列，Fl表示与X5(或在V’中与X6)缀合 的荧光部分，R表示通过脱亚氨酶作用转化为瓜氨酸的精氨酸残基，X6 表示第二氨基酸序列并且M表示与X6(或在V’中与X5)缀合的荧光寿 命调节剂。

在一些非限制性实施方案中，所述底物可以是以下荧光受调节之肽中 的一种：

肽1：9AA-QSTRGSGHWKK-CONH₂

肽3：K(9AA)-HQSTRGSGHWKK-CONH₂

(4)用于脱甲基酶的底物

Fl-X7-N3(Me)-X8-M  (VII)，或

M-X7-N3(Me)-X8-Fl  (VII’)

其中X7表示第一氨基酸序列，Fl表示与X7(或在VII’中与X8)缀 合的荧光部分，N3(Me)表示通过脱甲基酶之作用而脱甲基化的甲基化氨 基酸残基(例如，甲基化赖氨酸或甲基化精氨酸)，X8表示第二氨基酸序 列并且M表示与X8(或在VII’中与X7)缀合的荧光寿命调节剂。

在一些非限制性实施方案中，所述底物可以是以下荧光受调节之肽中 的一种：

肽10：9AA-ATGGVK³⁶(Me)K(Me)PHRYW-CONH₂或

肽11：9AA-ATGGVK³⁶(Me)KPHW-CONH₂

(5)用于脱乙酰酶的底物

Fl-X9-N4(Ac)-X10-M  (IX)，或

M-X9-N4(Ac)-X10-Fl  (IX’)

其中X9表示第一氨基酸序列，Fl表示与X9(或在IX’中与X10)缀 合的荧光部分，N4(Ac)表示通过脱乙酰酶之作用而脱乙酰化的乙酰化氨基 酸残基(例如，乙酰化赖氨酸)，X10表示第二氨基酸序列并且M表示与 X10(或在IX’中与X9)缀合的荧光寿命调节剂。

在一个非限制性实施方案中，所述底物可以是以下荧光受调节之肽：

Ac-Trp-Xaa-Lys(Ac)-Lys(9AA)

Xaa＝任意氨基酸

或肽，例如

肽18：Ac-IWK(Ac)K(9AA)-CONH₂

在上述荧光受调节之底物中，部分Fl与M可形成以下非限制性组合 之一：

荧光部分9-氨基吖啶(9-AA)与调节剂部分吲哚基部分，特别是色氨酸 残基的吲哚基侧链；

荧光部分9-氨基吖啶(9-AA)与调节剂部分萘基丙氨酸或其衍生物；

荧光部分9-氨基吖啶(9-AA)与调节剂部分咔唑部分或其衍生物；

荧光部分9-氨基吖啶(9-AA)与调节剂部分吩噻嗪或其衍生物；

荧光部分吖啶酮或其衍生物与调节剂部分吲哚基部分，特别是色氨酸残基 的吲哚基侧链；

荧光部分喹吖啶酮或其衍生物与调节剂部分吲哚基部分，特别是色氨酸残 基的吲哚基侧链。

试剂盒

本发明的另一方面涉及用于实施本文中所述测定方法的试剂盒。所述 试剂盒通常包含如本文定义的酶底物和第二种酶(例如，蛋白酶)供应， 所述第二种酶在荧光部分与荧光寿命调节剂部分之间切割底物或通过修 饰酶作用于底物而形成的底物的经修饰形式，从而将与荧光部分缀合之底 物的一部分与与荧光寿命调节剂部分相缀合之底物的一部分分开。所述试 剂盒还可包含对于修饰酶与底物之反应和蛋白酶与底物(或底物的经修饰 形式)之反应二者都合适的酶反应缓冲液等。

特别地，提供了以下试剂盒：

(1)用于甲基转移酶测定的试剂盒

所述试剂盒包含具有以下一般结构的荧光受调节之底物和蛋白酶：

Fl-X1-N1-X2-M  (I)，或

M-X1-N1-X2-Fl  (I’)

其中X1表示第一氨基酸序列，Fl表示与X1(或在I’中与X2)缀合 的荧光部分，N1表示通过甲基转移酶之作用而甲基化的氨基酸残基，X2 表示第二氨基酸序列，并且M表示与X2(或在I’中与X2)缀合的荧光 寿命调节剂；并且所述蛋白酶能够将所述底物至少切割成包含荧光部分 Fl的第一部分和包含荧光寿命调节剂M的第二部分。

在一些非限制性实施方案中，所述试剂盒可包含以下荧光受调节之肽 之一和蛋白酶Endo-LysC或Endo-ArgC的供应：

肽4：9AA-TARK⁹STGW-CONH₂

肽5：K(9AA)QTARK⁹STGW-CONH₂

肽6：ARTK(9AA)QTARK⁹STGGW-CONH₂

肽7：ARTWQTARK⁹STGGK(9AA)-CONH₂

肽8：WQTARK⁹STGGK(9AA)-CONH₂

肽9：K(9AA)ARTK(Me)QTARK⁹STGGW-CONH₂

肽12：WARTK⁴QTARK(9AA)STGGKAPRKQLAK-CONH₂

肽13：WRTK⁴QTARK(9AA)STGGKAPRKQLAK-CONH₂

肽14：WSGR³GKGGK(9AA)GLGKGGAKRHRK-CONH₂

肽15：Ac-WSGR³GKGGK(9AA)GLGKGGAKRHRK-CONH₂

肽20：PRKQLATK(9AA)AARK²⁷SAPATGGW-CONH₂。

(2)用于乙酰转移酶测定的试剂盒

所述试剂盒包含具有以下一般结构的荧光受调节之底物和蛋白酶：

Fl-X3-N2-X4-M  (III)，或

M-X3-N2-X4-Fl  (III’)

其中X3表示第一氨基酸序列，Fl表示与X3(或在III’中与X4)缀 合的荧光部分，N2表示通过乙酰转移酶之作用而乙酰化的氨基酸残基， X4表示第二氨基酸序列，并且M表示与X4(或在III’中与X3)缀合的 荧光寿命调节剂；并且所述蛋白酶能够将所述底物至少切割成包含荧光部 分Fl的第一部分和包含荧光寿命调节剂M的第二部分。

在一个非限制性实施方案中，所述试剂盒可包含以下荧光受调节之肽 底物之一和蛋白酶Endo-LysC的供应：

肽16：WQTARK(Me)STGGK¹⁴APRK(9AA)QLATK-CONH₂

肽17：9AA-STGGK¹⁴APRWQLATK-CONH₂。

(3)用于脱亚氨酶测定的试剂盒

所述试剂盒包含具有以下一般结构的荧光受调节之底物和蛋白酶：

Fl-X5-R-X6-M  (V)，或

M-X5-R-X6-Fl  (V’)

其中X5表示第一氨基酸序列，Fl表示与X5(或在V’中与X6)缀合 的荧光部分，R表示通过脱亚氨酶作用转化为瓜氨酸的精氨酸残基，X6 表示第二氨基酸序列，并且M表示与X6(或在V’中与X5)缀合的荧光 寿命调节剂；并且所述蛋白酶能够将所述底物至少切割成包含荧光部分 Fl的第一部分和包含荧光寿命调节剂M的第二部分。

在一些非限制性实施方案中，所述试剂盒可包含以下荧光受调节之肽 底物之一和蛋白酶胰蛋白酶的供应：

肽1：9AA-QSTRGSGHWKK-CONH₂

肽3：K(9AA)-HQSTRGSGHWKK-CONH₂。

(4)用于脱甲基酶的试剂盒

所述试剂盒包含具有以下一般结构的荧光受调节之底物和蛋白酶：

Fl-X7-N3(Me)-X8-M  (VII)，或

M-X7-N3(Me)-X8-Fl  (VII’)

其中X7表示第一氨基酸序列，Fl表示与X7(或在VII’中与X8)缀 合的荧光部分，N3(Me)表示通过脱甲基酶之作用而脱甲基化的甲基化氨 基酸残基(例如，甲基化赖氨酸或甲基化精氨酸)，X8表示第二氨基酸序 列，并且M表示与X8(或在VII’中与X7)缀合的荧光寿命调节剂；并 且所述蛋白酶能够将所述底物的经修饰形式至少切割成包含荧光部分Fl 的第一部分和包含荧光寿命调节剂M的第二部分。

在一个非限制性实施方案中，所述试剂盒可包含以下荧光受调节之肽 底物之一和蛋白酶Endo-LysC的供应：

肽10：9AA-ATGGVK³⁶(Me)K(Me)PHRYW-CONH₂。

在另一个非限制性实施方案中，所述试剂盒可包含以下荧光受调节之 肽底物之一和蛋白酶胰蛋白酶的供应：

肽11：9AA-ATGGVK³⁶(Me)KPHW-CONH₂。

(5)用于脱乙酰酶的试剂盒

所述试剂盒包含具有以下一般结构的荧光受调节之底物和蛋白酶：

Fl-X9-N4(Ac)-X10-M  (IX)，或

M-X9-N4(Ac)-X10-Fl  (IX’)

其中X9表示第一氨基酸序列，Fl表示与X9(或在IX’中与X10)缀 合的荧光部分，N4(Ac)表示通过脱乙酰酶之作用脱而乙酰化的乙酰化氨基 酸残基(例如，乙酰化赖氨酸)，X10表示第二氨基酸序列，并且M表示 与X10(或在IX’中与X9)缀合的荧光寿命调节剂；并且所述蛋白酶能 够将所述底物的经修饰形式至少切割成包含荧光部分Fl的第一部分和包 含荧光寿命调节剂M的第二部分。

在一个非限制性实施方案中，所述试剂盒可包含以下荧光受调节之肽 底物之一和胰蛋白酶的供应：

Ac-Trp-Xaa-Lys(Ac)-Lys(9AA)

Xaa＝任意氨基酸

或肽，例如

肽18：Ac-IWK(Ac)K(9AA)-CONH₂。

在上述试剂盒中，荧光受调节之底物中的部分Fl与M可形成以下非 限制性组合之一：

荧光部分9-氨基吖啶(9-AA)与调节剂部分吲哚基部分，特别是色氨酸 残基的吲哚基侧链；

荧光部分9-氨基吖啶(9-AA)与调节剂部分萘基丙氨酸或其衍生物；

荧光部分9-氨基吖啶(9-AA)与调节剂部分咔唑部分或其衍生物；

荧光部分9-氨基吖啶(9-AA)与调节剂部分吩噻嗪或其衍生物；

荧光部分吖啶酮或其衍生物与调节剂部分吲哚基部分，特别是色氨酸残基 的吲哚基侧链；

荧光部分喹吖啶酮或其衍生物与调节剂部分吲哚基部分，特别是色氨酸残 基的吲哚基侧链。

实施例

参照以下实验性实施例进一步理解本发明。

实施例1-用于脱亚氨酶的FLT蛋白酶保护测定

图1示出了通过FLT蛋白酶保护法测定脱亚氨酶类酶的方法，所述 脱亚氨酶类酶将肽/蛋白质底物中的精氨酸残基转化为瓜氨酸。在这里， 9-氨基吖啶(9AA)(或其他合适的报道分子)的底物寿命受序列中色氨 酸残基(或其他已知的荧光寿命调节剂)之存在的调节。用在精氨酸之之 后切割的蛋白酶处理底物将引起蛋白质水解并移除色氨酸残基对荧光寿 命的调节。在通过适当的脱亚氨酶将精氨酸转化为瓜氨酸后，然后用蛋白 酶处理产物肽不引起精氨酸之后的切割并且荧光团(9AA)的寿命仍受调 节。

(A)PAD4概念验证(Proof-of-Concept)FLT蛋白酶保护测定

重组人PAD4酶可商购自供应商例如origene、abnova或modiquest  research。

为了实现用于脱亚氨酶的FLT蛋白酶保护法，必须满足多个条件：

1)设计适当的肽底物，其包含脱亚氨酶的识别位点、合适地并入的色氨 酸残基(或其他FLT调节剂)和长寿命荧光团(例如，9-氨基吖啶)。

2)正确布置调节剂和荧光团，使得后者的FLT在完整肽中充分降低。调 节剂和荧光团在蛋白酶切割后必须位于相反的片段上，从而导致荧光团 FLT的切割依赖性提高。

3)使用选择性地切割肽(瓜氨酸化)精氨酸残基C端的合适蛋白酶。所 述蛋白酶必须不能切割瓜氨酸化产物。

为了满足要求1～3，设计并合成了图2所示肽序列用于通过FLT蛋 白酶保护法测定脱亚氨酶PAD4。

肽1：9AA-QSTRGSGHWKK-CONH₂

肽2：K(9AA)-QSTRGSGHWKK-CONH₂

肽3：K(9AA)-HQSTRGSGHWKK-CONH₂

为了提高得到合适FLT调节的可能性同时维持针对PAD4的活性， 合成了三种变体。

如实验章节所述通过标准Fmoc固相肽合成(solid phase peptide  synthesis，SPPS)合成所述肽。肽2和3在N端包含Boc-Lys(Fmoc)-OH， 从而能够得到正交的侧链脱保护。使用HOCt/DIC活化在树脂上用3-(9- 氨基吖啶-2-基)-丙酸标记肽，然后使用标准TFA切割混合物(cocktail) 进行切割。通过反相HPLC对肽进行纯化并参照9AA的摩尔消光系数进 行等分(在1∶1MeCN/水中在405nm处为8735M^-1cm^-1)。

肽1～3的FLT测量

在384孔黑色微孔板中将肽1～3以1μM的浓度溶解于PAD4测定缓 冲液(20mM Tris pH8.0，200μM CaCl₂，5mM DTT，0.01％CHAPS) 中(20μL/孔)。如实验章节所述使用NanoTaurus荧光寿命读板器 (Edinburgh Instruments Ltd.)测量FLT。一式三份地进行测量并在7 小时时间段中进行分析。

初始稳定后，肽1和3的FLT随时间保持稳定(图3)。相比之下， 肽2的FLT稳定地升高3小时后开始变平。相比于肽1和2，肽3初始寿 命的降低反映邻近9AA连接位点处存在组氨酸残基。与色氨酸一样，已 知组氨酸残基调节荧光团的FLT(Marme，N.，Knemeyer，J-P.，Sauer，M. 和Wolfrum，J.，Bioconjugate Chem.，2003，14，1133-1139)。

肽1～3的蛋白酶切割

胰蛋白酶是切割肽和蛋白质中精氨酸或赖氨酸残基C端的常用蛋白 酶。所设计的肽1～3(图2)在C端具有一个精氨酸残基和两个赖氨酸残 基。预计精氨酸处的切割将由于其与调节色氨酸残基的分开而导致9AA  FLT提高。相比之下，并且对于测定的效用来说重要的是，赖氨酸处的切 割不导致染料和调节剂分开，因此应对前者的FLT无影响。

为了测试蛋白酶切割对肽1～3之FLT的影响，在384孔黑色微孔板 中将每种肽以1μM的浓度溶解于PAD4测定缓冲液(20μL)中。向每 个孔中添加10μL分别包含5nM、2.5nM、1.25nM或0.625nM酶的胰 蛋白酶溶液。在45分钟内以规律的间隔使用NanoTaurus读板器测量 FLT。作为对照，以类似方法测试包含瓜氨酸(替代精氨酸)的相应肽。

所有的三种肽的FLT作为胰蛋白酶浓度的函数而提高，这与9AA与 调节色氨酸残基的分开相一致(图4A～C)。FLT提高是肽依赖性的，使 得肽1(6ns)＞肽2(4.8ns)＞肽3(2.6ns)。应注意，对于肽2，无胰 蛋白酶对照中有一些漂移，这与该肽单独在缓冲液中所观察到的作用相一 致(图3)。肽3的降低的FLT范围可通过切割后邻近9AA的调节组氨酸 残基的持续存在来部分地解释。

与在胰蛋白酶处理之后对于肽1～3所观察到的FLT显著提高相比， 对于瓜氨酸化类似物没有观察到FLT提高，甚至在孵育45分钟后也是如 此(图4D)。该发现与预计的胰蛋白酶不能在邻近瓜氨酸残基处切割相一 致。

根据经验证测定的蛋白酶保护方面，将注意力转向确定肽1～3是否是 PAD4的可行底物。

使用肽1～3进行PAD4测定

为了确定肽1～3是否被PAD4瓜氨酸化，开发了反相HPLC法以监 测底物的消耗和产物的形成。作为第一步，在PAD4测定缓冲液中以15μM 的浓度制备每种肽与其瓜氨酸化等价物的1∶1混合物，并使用Luna C18 柱和0～73％MeCN+0.1％TFA梯度通过RP-HPLC监测30分钟。使用该 梯度可将对应于底物和产物肽的峰分开，这二者的保留时间均比来自缓冲 液组分的峰晚，从而简化了分析(图5)。

通过可使用的合适HPLC方法，为每种肽底物建立PAD4测定，以 规律的时间间隔取出等量份并且通过RP-HPLC监测产物形成。每个测定 均在包含测定缓冲液(300μL)中的15μM肽和30nM PAD4(Origene) 的微型离心管中进行。测定在室温下进行并且在0分钟、30分钟和60分 钟的时间间隔取样。

通过图6～8中的HPLC谱示出了在1小时的时程内每个测定的进展。 对于使用肽1(图6)和肽3(图8)作为底物的测定，谱清楚地示出在 30分钟后形成了新峰，其保留时间比底物晚，并且明显地，1小时后底物 几乎完全消失。为了确定新形成的物质与瓜氨酸化产物相对应，收集峰并 通过ESI-MS分析。该方法确定了在每种情况下质量都比初始肽大1Rmu， 与精氨酸转化为瓜氨酸相一致(图9和图10)。

与使用肽1和3的成功相比，如通过在测定时间过程中HPLC谱中 出现多个峰的所证明的(图7)，使用肽2作为底物的测定导致了肽的分 解。对于分解的峰不能得到可辨别的质量，所以不可能确定瓜氨酸化是否 发生。该肽作为底物的明显失败与FLT研究(图3)期间和蛋白酶切割分 析(图4B)期间所观察到的稳定性缺乏相一致。不进行使用肽2的进一 步研究，而将注意力集中到在PAD4测定中已表现出活性的肽1和3上。

为了测试PAD4对肽1和3的瓜氨酸化是否赋予了针对胰蛋白酶的保 护，将这些肽的测定混合物(上述)用测定缓冲液稀释至1μM的浓度， 并且将20μL各自添加到384孔黑色微孔板的三个孔中。如前所述使用 NanoTaurus读板器测量FLT。然后将10μL胰蛋白酶(终浓度为10nM) 添加到每个孔中，并将板在室温下孵育10分钟，然后再次测量FLT。包 括仅包含相同浓度肽的对照用于比较。

在PAD4不存在下，在与10nM胰蛋白酶孵育后，肽1和3的FLT 分别提高6.1ns和3.3ns(图11)。相比之下，对于在与胰蛋白酶孵育之 前暴露于PAD4的那些肽没有观察到FLT提高。这些发现与PAD4催化 的底物瓜氨酸化提供对蛋白酶处理的保护相一致。

总之，可得出以下结论：

1)肽1和3是PAD4的可行底物。

2)在用合适的蛋白酶(即，胰蛋白酶)处理后可实现多至6ns的FLT提 高(在肽1的情况下)，从而得到优良的测定动态范围。

3)如缺乏FLT提高所反映的，PAD4对肽1和3的瓜氨酸化赋予了免于 蛋白酶诱导切割的保护。

用于PAD4的FLT蛋白酶保护测定

由于与肽3相比，肽1表现出的FLT显著更大的变化，所以选择该 肽作为微孔板测定的底物。测定在384孔黑色微孔板中以20μL体积进行 并且包含测定缓冲液中的肽1(1μM)和PAD4酶(500pM、250pM或 125pM)。以规律的间隔通过添加10μL胰蛋白酶(10nM)终止反应。 在添加胰蛋白酶之前立即测量FLT，并且在室温下孵育10分钟后再次测 量。所有测量使用NanoTaurus读板器一式三份地进行。

在添加胰蛋白酶之前，所有测定孔的FLT都类似(～10ns)，并且对 于不同测定时间点或PAD4浓度观察到没有显著变化(图12A)。相比之 下，与胰蛋白酶孵育后测量的FLT表现出时间和PAD4浓度依赖性降低 (图12B)，原因是进行性瓜氨酸化赋予了蛋白质保护，导致了固有的色 氨酸残基对肽1之FLT的持续调节。

底物滴定

研究了PAD4测定对肽底物浓度的依赖性。测定使用250pM PAD4 在测定缓冲液(20μL)中在室温下在384孔微孔板中进行1小时。肽1 的浓度在2.5μM至0.04μM之间变化。反应完成后，将胰蛋白酶(10nM) 添加到每个孔中并在10分钟的孵育期后测量FLT。参照标准曲线将数据 转化为产物形成的速率，然后在GraphPad Prism中使用 Michaelis-Menten模型进行拟合以确定底物K_M。由图73可以看出，底物 1的K_M被确定为180nM。

Z’-因子

为了证明PAD4FLT测定与高通量筛选(high-throughput screening， HTS)兼容，确定了Z’-因子的值。Z’-因子是特定测定之稳健性 (robustness)的度量，值＞0.7被认为是优良的(Zhang，J.H.；Chung，T. D.；Oldenburg，K.R.J.Biomol.Screen.1999，4，67-73)。

在384孔微孔板中建立测定，其中半个板包含测定缓冲液中的PAD4 (125pM)和肽1(200nM)，而另外半个板包含不含CaCl₂的测定缓冲 液中的PAD4(125pM)和肽1(200nM)。最终测定体积为20μL，将 板在室温下孵育1小时，此时将测定缓冲液(10μL)中的胰蛋白酶(10nM 终浓度)添加到每个孔中。在室温下再孵育10分钟后，测量FLT并计算 Z’因子为0.70(图74)。

这些结果证明用于脱亚氨酶的FLT蛋白酶保护测定可转为微孔板形 式，这有助于其用于药物筛选和HTS应用。

总之，已展示了采用PAD4作为代表性实例的用于脱亚氨酶类酶的 FLT蛋白酶保护测定。设计并入PAD4识别序列、9-氨基吖啶荧光团和调 节色氨酸序列的肽底物。FLT研究确定9AA的寿命降低而肽序列未受损， 但是在用蛋白酶胰蛋白酶处理后，FLT由于肽切割引起染料从调节剂中释 放而提高。肽中的两种表明使体外测定中PAD4的底物，其中序列中单个 精氨酸残基的瓜氨酸化导致了免于蛋白酶诱导切割的保护。通过与不包含 酶的对照相比暴露于PAD4的那些肽的FLT降低来对该保护进行定量。

考虑通过采用适当设计的底物可将该测定技术转用于其他脱亚氨酶。

(B)用于PAD2脱亚氨酶的FLT蛋白酶保护测定

在测定脱亚氨酶的FLT蛋白酶保护法的另一个示例中，肽基精氨酸 脱亚氨酶2(PAD2)被验证为合适的靶标。

PAD2的调节异常与自身免疫病多发性硬化和类风湿性关节炎以及 神经变性疾病(例如阿尔兹海默病和克雅氏症(creutzfeldt-Jakob  disease))相关(Jang，B.等，Acta Neuropathologica，2010，119，199至 210)。

重组人PAD2可商购自供应商例如Modiquest Research。

在使用PAD2的测定中测试先前被确定为PAD4底物的肽1(图1)， 并且通过RP-HPLC和ESI-MS监测向瓜氨酸化产物的转化。

肽1：9AA-QSTRGSGHWKK-CONH₂

因此，将肽1(15μM)与PAD2(30nM)在测定缓冲液(20mM Tris  pH8，200μM CaCl₂，5mM DTT，0.01％CHAPS)(300μL)中孵育， 以规律的时间间隔取出等量份并通过RP-HPLC分析。测定在室温下进行 并且在0分钟、30分钟和120分钟时间间隔取样。

通过图31中的HPLC谱示出2小时时间过程中的测定进展。在t＝0 时，存在对应于肽底物的唯一峰(t_R＝14.4分钟)。30分钟后在405nm吸 光度下存在新峰(t_R＝14.7分钟)，在2小时后该峰增长为主要的并且仅可 检测到很小的底物峰。为了确定新峰对应于瓜氨酸化产物，收集所述产物 并通过ESI-MS进行分析。发现质量(m/z1518.7)比底物质量大1amu， 这与精氨酸残基的胍基转化为尿素相一致(图32)。

为了测试PAD2对肽1的瓜氨酸化是否赋予了针对胰蛋白酶的保护， 用测定缓冲液将测定混合物稀释至1μM的浓度，并且将20μL添加到384 孔黑色微孔板的三个孔中。将10μL胰蛋白酶(终浓度为10nM)添加到 每个孔中，将板在室温下孵育10分钟后，如实验章节中所述使用 NanoTaurus读板器测量荧光寿命(FLT)。包括仅包含相同浓度肽的对照 用于比较。

在PAD2不存在下，在与10nM胰蛋白酶孵育后肽1的FLT提高6.9 ns(图33)。相比之下，对于在与胰蛋白酶孵育之前暴露于PAD2的肽1 没有观察到FLT提高。这些发现与PAD2催化的肽1瓜氨酸化提供对蛋 白酶处理的保护相一致。

总之，肽1是测定PAD2的有效底物，其通过由瓜氨酸化赋予对蛋白 酶诱导切割之保护导致的FLT降低来监测活性。

用于PAD2的FLT蛋白酶保护测定

接着，以微孔板形式证明了用于PAD2的FLT蛋白酶保护测定。测 定在384孔黑色微孔板中以20μL体积进行并且包含测定缓冲液中的肽1 (1μM)和PAD2酶(23.5nM、11.8nM、5.9nM、2.9nM或1.5nM)。 以规律的间隔通过添加10μL胰蛋白酶(10nM)终止反应。在室温下与 胰蛋白酶孵育10分钟后测量FLT。所有的测量使用NanoTaurus读板器 一式三份地进行。

与胰蛋白酶孵育后测量的FLT表现出时间和PAD2浓度依赖性降低 (图34)，原因是进行的瓜氨酸化提供了蛋白酶保护，导致固有色氨酸残 基对肽1之FLT的持续调节。因此通过测定的所测量荧光寿命降低报道 瓜氨酸化。

这些结果证明用于PAD2的FLT蛋白酶保护测定可转为微孔板形式， 从而有助于其用于药物筛选和HTS应用。

实施例2-用于蛋白质甲基转移酶的FLT蛋白酶保护测定

图13示出通过FLT蛋白酶保护法测定蛋白质甲基转移酶(PMT)的 方法，所述甲基转移酶将一个或更多个甲基转移到肽/蛋白质底物中的赖 氨酸或精氨酸残基上。在这里，9-氨基吖啶(9AA)(或其他合适的报道 分子)的底物寿命受序列中色氨酸残基(或其他已知的荧光寿命调节剂) 之存在的调节。用在赖氨酸或精氨酸之后切割的蛋白酶处理底物将引起蛋 白质水解并移除色氨酸残基对荧光寿命的调节。通过适当的PMT酶进行 赖氨酸或精氨酸甲基化后，用蛋白酶处理产物肽不引起赖氨酸或精氨酸后 的切割并且荧光团(9AA)的寿命仍受调节。

重组PKMT(例如G9a、Set7/9、GLP、EZH2)和PRMT(PRMT1、 PRMT3、PRMT4/CARM1、PRMT5)酶可商购自供应商例如BPS  Bioscience、Millipore、New England Biolabs或Sigma-Aldrich。

对于图13所列途径合适的蛋白酶为Endo-LysC(用于测定PKMT) 和Endo-ArgC(用于测定PRMT)。

(A)G9a概念验证性FLT蛋白酶保护测定

选择PKMT G9a作为概念验证性研究一个代表性实例，因为它是已 被很好表征的酶(Chin，H.G.，Pradhan，M.，Esteve，P-O.，Patnaik，D.， Evans Jr.，T.C和Pradhan，S.，Biochemistry，2005，44，12998-13006) (Patnaik，D.，Chin，H.G.，Esteve，P-0.，Benner，J.，Jacobsen，S.E.和 Pradhan，S.，J.Biol.Chem.，2004，279，53247-53258)。不同长度的组蛋白 肽被报道为底物(Rathert，P.，Dhayalan，A.，Murakami，M.，Zhang，X.， Tamas，R.，Jurkowska，R.，Komatsu，Y.，Shinkai，Y.，Cheng，X.，and  Jeltsch，A.，Nat.Chem.Biol.，2008，4，344-346)，并且其可商购自多个供应 商。G9a首先将甲基转移到组蛋白H3之N端尾区的残基上。延长暴露于 G9a可导致赖氨酸-9变为二甲基化或三甲基化。最近报道了使用Caliper 微流体转移技术(Caliper′s microfluidic shift technology)的用于G9a的 蛋白酶保护测定(Wigle，T.J.，Provencher，L.M.，Norris，J.L，Jin，J.， Brown，P.J.，Frye，S.V.，Janzen，W.P.，Chem.Biol.，2010，17，695-704)。

在第一种情况下，基于组蛋白H3N端序列合成了一系列肽作为G9a 的可能底物(图14)。如对于脱亚氨酶类酶所举例说明的，基于FLT的蛋 白酶保护法的可行性需要并入长寿命荧光团(例如，9AA)并且在靶残基 (在这种情况下为赖氨酸-9)的对侧上并入调节残基(例如，色氨酸)。 这些部分的并入必须对G9a的识别没有不利影响，但是，它们必须合适 地进行布置使得荧光团的FLT对于工作测定范围来说是足够的。

肽4：9AA-TARK⁹STGW-CONH₂

肽5：K(9AA)QTARK⁹STGW-CONH₂

肽6：ARTK(9AA)QTARK⁹STGGW-CONH₂

肽7：ARTWQTARK⁹STGGK(9AA)-CONH₂

肽8：WQTARK⁹STGGK(9AA)-CONH₂

肽9：K(9AA)ARTK(Me)QTARK⁹STGGW-CONH₂

如实验章节所述通过标准Fmoc固相肽合成(SPPS)合成肽。在染 料连接位点处肽5和9包含Boc-Lys(Fmoc)-OH，而肽6～8包含 Fmoc-Lys(ivDde)-OH，从而能够得到正交的侧链脱保护。使用HOCt/DIC 活化在树脂上用3-(9-氨基吖啶-2-基)-丙酸标记肽，然后使用标准TFA切 割混合物进行切割。经反相HPLC纯化肽并参照9AA的摩尔消光系数进 行等分(在1∶1MeCN/水中在405nm处为8735M^-1cm^-1)。

选择Endo-LysC作为蛋白酶，原因是已知它切割赖氨酸残基的C端， 但是当这样的残基被甲基化时不切割。

在384孔黑色微孔板(Greiner)中建立测定，其中每个孔包含20μL 测定缓冲液(20mM Tris.HCl pH8.0，25mM NaCl，1mM DTT，0.025％ 吐温-20)中的肽底物(1μM)、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(100μM)和 G9a(Millipore，500nM)。测定在室温下进行2小时，然后使用 NanoTaurus读板器(Edinburgh Instruments Ltd.)测量FLT。然后用2nM 蛋白酶(Endo-LysC)(10μL)处理每个孔并且将板在室温下孵育60分 钟。然后再次测量FLT。包括不包含G9a或不包含蛋白酶的对照。测定 的结果示于图15中。

在不存在G9a处理的情况下，对于肽4观察到FLT最大的蛋白酶依 赖性提高(5.8ns)，发现肽9提高最小(2.4ns)。该观察不出乎意料，原 因是9AA与色氨酸之间的分隔距离在肽4中最小并且在肽9中最大。比 较用G9a与不用G9a处理的孔在蛋白酶处理后FLT的提高，明显看出对 于所有的肽，暴露于G9a的那些提高较小，表明了蛋白酶保护的程度。 肽9在似乎提供完全蛋白酶保护从而指明高度赖氨酸甲基化的方面是独 一无二的(即，蛋白酶处理后的FLT与肽对照保持相同)。该肽具有预甲 基化的赖氨酸-4以防止在该残基处被切割并且它可以是在该位点的小修 饰，对G9a比残基缺失或替换更耐受。比较通过另外五种肽底物提供的 蛋白酶保护，似乎它们中的每一种之间差异很小(图15)。因此，决定推 动使用肽4和9，原因是前者提供了最大的动态范围，而后者似乎是G9a 的更好底物。

G9a滴定

在384孔黑色微孔板(Greiner)中将肽4和9与20μL测定缓冲液 中的SAM(100μM)和不同浓度的G9a(Abcam)一起孵育。测定在室 温下进行2小时，之后如先前所述测量FLT。然后添加2nM Endo-LysC (10μL/孔)并在与蛋白酶孵育10分钟和60分钟后再次测量FLT。

由图16A所示数据看出，直至添加蛋白酶后为止任一种肽的FLT都 没有明显变化，即赖氨酸甲基化不直接引起FLT的变化。因此，蛋白酶 切割后，与对照孔相比的测定孔的FLT差异是G9a活性的直接结果。

50nM G9a足以为肽4和9赋予完全的蛋白酶保护(图16B～E)。该 浓度比用于使用来自Millipore的G9a产生类似数据的浓度(图15)小十 倍，强调了Abcam酶更大的活性。数据还示出肽9是比肽4更活泼的底 物，如通过该肽在较低G9a浓度下发生蛋白酶保护所证明(图16B～E)。 该发现与肽9相比于肽4的较长序列提供G9a更大程度的选择性相一致。

比较图16B与16C和16D与16E，清楚地看出延长与Endo-LysC的 孵育(60分钟对10分钟)不引起FLT的可评估变化，表明在10分钟后 发生了完全切割。因此，在所有的后续实验中在与Endo-LysC孵育10分 钟后收集数据。

甲基化的证据

为了确定底物甲基化确实在G9a存在下发生，在微型离心管中使用 肽4和9进行测定，以规律的时间间隔取样并通过RP-HPLC和ESI-MS 进行分析。测定条件如下：测定缓冲液(150μL)中的肽底物(15μM)、 G9a(100nM)、SAM(100μM)。使用Luna C18柱和0～50％ MeCN+0.1％TFA的梯度进行30分钟的分析。相关谱示于图17和18中。

对于使用肽4作用底物的测定，在与G9a延长孵育后出现了保留时 间比底物晚的第二峰(图17B)。当使用肽9时，没有看到这样的第二峰， 但是这可能是因为使用当前的梯度方法不足以分离。收集相关峰并通过 ESI-MS分析以证明甲基化(图19～20)。

保留时间比肽4晚之峰的ESI-MS分析表明它对应于甲基化产物，并 且清晰可见单甲基化(m/z1166)和二甲基化(m/z1180)物质的正确质 量(图19B)。因为对于使用肽9的测定没有清晰可见的确定的第二峰， 所以收集包含405nm吸光度的整个峰并通过ESI-MS进行分析。不出乎 意料地，在t＝0时，该峰仅包含底物的质量(m/z1936)(图20A)。但是， 在与G9a孵育6小时后，虽然一些证据表明有底物残余，但是现已有单 甲基化(m/z1950)和二甲基化(m/z1964)产物的清晰信号(图20B)。 因此，这些结果为肽4和9在暴露于甲基转移酶G9a后转化为其甲基化 等价物提供了直接证据。

G9a测定时间过程

测定在不同G9a浓度下使用肽4和9(1μM)在384孔微孔板中进 行，反应用SAM(100μM)开始并且以规律的间隔通过添加Endo-LysC (2nM)终止。孵育10分钟后，测量FLT以证明通过G9a催化赖氨酸 甲基化引起的蛋白酶保护。

如由图21～22可看出的，在添加Endo-LysC之前任一种肽的FLT都 没有变化。但是，在添加蛋白酶并与其孵育后，FLT调节的程度作为G9a 浓度和测定时间的函数而改变，这与赋予蛋白酶保护的赖氨酸甲基化相一 致。在t＝0时，用Endo-LysC处理导致FLT由11.2ns提高至17.0ns(对 于肽4)以及由13.5ns提高至16.5ns(对于肽9)，这与无调节和蛋白酶 对底物的完全切割相一致。反应的线性对于多个时间过程是明显的。

对SAM的依赖性

使用肽4和9二者作为底物研究了G9a测定对SAM的依赖性。测定 在384孔微孔板中使用测定缓冲液(20μL)中的25nM或10nM G9a和 1μM底物进行。SAM浓度在200μM至0.4μM之间变化并且测定在室 温下孵育2小时。完成后，将Endo-LysC(2nM)添加到每个孔中并在 10分钟孵育期后测量FLT。图23中示出的数据确定了G9a活性对SAM 浓度的依赖性，K_m(app)＝3～11μM。

抑制剂滴定

为了证明用于G9a的FLT蛋白酶保护测定适用于抑制剂筛选，购买 了已知的非SAM竞争性G9a抑制剂BIX-01294(Merck Chemicals Ltd.) 并在测定中进行测试。条件如下：测定缓冲液(20μL)中的BIX-01294 (200μM-20nM)、G9a(25nM或10nM)、SAM(10μM)和肽底物(1 μM)。反应在384孔微孔板中在室温下进行2小时并通过添加Endo-LysC (2nM)终止。

将肽9作为底物，对于BIX-01294测定IC₅₀＝1.6μM，与1.9μM的 文献值相一致(Chang，Y.，Zhang，X.，Horton，J.R.，Upadhyay，A.K.， Spannhoff，A.，Liu，J.，Snyder，J.P.，Bedford，M.T.和Cheng，X.，Nat. Struct.Biol.，2009，16，312-317)。相比之下，使用肽4的测定恢复为IC₅₀≈28nM(在较低抑制剂浓度下不能变平)(图24)。值的差异可能是因为 抑制的机制不同，因为已知BIX-01294是组蛋白H3竞争性抑制剂并且肽 4和9的序列不同可影响抑制剂结合。

Z’-因子

为了证明G9a FLT测定与高通量筛选(HTS)兼容，确定了Z’-因子 的值。

在384孔微孔板中建立测定，其中半个板包含G9a(BPS Bioscience) (625pM)、肽9(1μM)和SAM(100μM)，而另外半个板包含G9a (625pM)、肽9(1μM)并且不含SAM。最终测定体积为20μL，将板 在室温下孵育1小时，此时将测定缓冲液(10μL)中的Endo-LysC(2nM 终浓度)添加到每个孔中。在室温下再孵育10分钟后，测量FLT并计算 Z’因子为0.71，证明了测定对于HTS筛选的适用性(图75)。

总之，设计了用于FLT蛋白酶保护测定的赖氨酸甲基转移酶G9a的 新型肽底物，其并入了长寿命荧光团(9AA)和芳族调节剂残基(色氨酸)。 已证明两种肽在与G9a孵育后的甲基化并且已表明该过程赋予了蛋白酶 保护，正如通过添加蛋白酶Endo-LysC后持续的FLT调节所确定的。通 过进行酶、SAM和抑制剂滴定验证了测定性能，并且测定所确定的Z’- 因子0.71适用于HTS应用。

考虑这样的途径不限于G9a，而是使用适当设计的肽底物可转用于其 他蛋白质甲基转移酶。也可采用另一些长寿命荧光团和/或调节剂。

(B)用于Set7/9赖氨酸甲基转移酶的FLT蛋白酶保护测定

在测定蛋白质甲基转移酶的FLT蛋白酶保护法的另一个实例中， Set7/9(赖氨酸甲基转移酶)被验证为合适的靶标。

Set7/9在另一些蛋白质靶标中使组蛋白H3的Lys4甲基化(Wilson 等，Cell2002，111，105-115)。重组Set7/9可商购自供应商例如BPS  Bioscience。

合成肽12作为Set7/9的底物，所述肽12由组蛋白H3N端序列组成 并且在N端并入色氨酸残基并且并入与赖氨酸-9残基相连接的9-氨基吖 啶荧光团。

肽12：WARTK⁴QTARK(9AA)STGGKAPRKQLAK-CONH₂

甲基化的证据

将肽12(15μM)与测定缓冲液(20mM Tris pH8，25mM NaCl， 1mM DTT，0.025％吐温-20)(200μL)中的Set7/9(172nM)和S-腺苷 甲硫氨酸(SAM)(100μM)孵育，以规律的时间间隔取出等量份并通过 RP-HPLC和ESI-MS进行分析以确定Set7/9对肽底物的甲基化程度。测 定在室温下进行并分别在0小时、2小时和6小时的时间间隔取样。

通过图36中的HPLC谱示出6小时时间过程中的测定进展。6小时 后，保留时间由t_R＝18.3分钟(在0小时)清楚地变化为t_R＝18.4分钟。 通过ESI-MS分析峰确定质量变化为14amu，这与添加一个甲基相一致 (图37)。6小时后，检测到非常少的底物质量(m/z2814)，并且对应于 单甲基化肽的m/z2828作为主要物质存在。还观察到对应于二甲基化肽 的小峰(m/z2842)(图37)。

为了测试Set7/9对肽12的甲基化是否提供了针对Endo-LysC催化切 割的保护，用测定缓冲液将测定混合物稀释至1μM的浓度并将20μL所 得溶液添加到384孔黑色微孔板的三个孔中。将10μL Endo-LysC(终浓 度2nM)添加到每个孔中并将板在室温下孵育15分钟后使用NanoTaurus 读板器测量FLT。包括仅有相同浓度肽的对照用于比较。

在Set7/9不存在下，在与2nM Endo-LysC孵育后肽12的FLT提高 2.4ns(图38)。相比之下，对于在与Endo-LysC孵育之前暴露于Set7/9 的肽12观察到FLT没有显著提高。这些发现与Set7/9催化的肽12甲基 化提供了对于蛋白酶诱导切割的保护相一致。

Set7/9测定时间过程

测定在384孔黑色微孔板中以20μL体积进行并且包含在测定缓冲液 中的肽12(1μM)和Set7/9酶(100nM、50nM、25nM或12.5nM) 中。以规律的间隔通过添加10μL Endo-LysC(终浓度2nM)终止反应。 在室温下与Endo-LysC孵育15分钟后测量FLT。使用NanoTaurus读板 器将所有测量一式两份地进行。

由图39A可以看出，在添加Endo-LysC之前肽12的FLT变化很小。 然后在添加蛋白酶并与其孵育后，FLT调节的程度作为Set7/9浓度和测 定时间的函数而改变，这与赖氨酸甲基化赋予蛋白酶保护相一致(图 39B)。底物与产物之间的总寿命变化为约2.4ns。总之，通过测定的所测 量荧光寿命降低来报道通过Set7/9的甲基化。

为了提高测定的总动态范围，合成了肽13。该肽由于缺失邻近N端 的丙氨酸残基而比肽12短一个氨基酸。预计该改变通过使色氨酸更接近 9AA荧光团使对底物FLT的调节提高。肽13所测量的FLT为13ns，比 肽12的短约1.5ns，因此肽13提供了提高Set7/9测定动态范围的机会。 然而，为了实现这样的提高，肽13必须被Set7/9成功甲基化。因此，为 了确定Set7/9测定中肽13的活性，使用用于肽12的相同条件重复上述时 间过程。

肽13：WRTK⁴QTARK(9AA)STGGKAPRKQLAK-CONH₂

肽13的FLT变化直至添加蛋白酶Endo-LysC之前都不明显(图 40A)。然而，在与Endo-LysC在室温下孵育15分钟后，测定孔的FLT 作为Set7/9浓度和测定时间的函数而改变，这与肽13的甲基化提供蛋白 酶保护相一致(图40B)。重要地，测定的最大范围现已提高至4ns，从 而使灵敏度提高。因此，使用肽13作为底物进行了Set7/9FLT测定的进 一步验证。

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)滴定

使用肽13作为底物研究了Set7/9测定对SAM辅因子的依赖性。测 定使用25nM Set7/9和1μM底物在测定缓冲液(20μL)中在室温下在 384孔微孔板中进行2小时。SAM浓度在100μM至1.7nM之间变化。 完成后，向每个孔中添加Endo-LysC(2nM)并且在20分钟孵育期后测 量FLT。图41所示数据确定了Set7/9活性对SAM浓度的依赖性， K_m(app)＝500nM。

S-腺苷高半胱氨酸抑制剂滴定

为了证明用于Set7/9的FLT蛋白酶保护测定适合于抑制剂筛选，购 买了已知的SAM竞争性抑制剂S-腺苷高半胱氨酸 (S-adenosylhomocysteine，SAH)(Sigma)并在测定中进行测试。条件 如下：测定缓冲液(20μL)中的SAH(1mM至1.3μM)、Set7/9(50nM)、 SAM(500nM)和肽13(1μM)。反应在384孔微孔板中在室温下进行 2小时并且通过添加Endo-LysC(2nM)终止。

对于SAH，确定了IC₅₀＝37μM(图42)，这比得上所报道的使用较 低浓度SAM得到的16μM的IC₅₀(Gauthier，N.；Caron，M.；Pedro，L.； Arcand，M.；Blouin，J.；Labonté，A.；Normand，C；Paquet，V.； Rodenbrock，A.；Roy，M.；Rouleau，N.；Beaudet，L.；Padr□s，J.； Rodriguez-Suarez，R.J.Biomol.Screen.，2012，17，49-58)。

Z’-因子

为了证明Set7/9FLT测定与高通量筛选(HTS)法兼容，确定了Z’- 因子的值。

在384孔微孔板中建立测定，其中半个板包含Set7/9(25nM)、肽 13(1μM)和SAM(100μM)，而另外半个板包含Set7/9(25nM)、肽 13(1μM)，但是将SAM替换为测定缓冲液。最终测定体积为20μL， 将板在室温下孵育2小时，此时将测定缓冲液(10μL)中的Endo-LysC (2nM终浓度)添加到每个孔中。在室温下再孵育15分钟后，测量FLT 并计算Z’因子为0.81(图43)。

总之，两种新型肽(肽12和13)已被验证为用于FLT蛋白酶保护 测定中赖氨酸甲基转移酶Set7/9的底物。测定的基础是使用9AA标记肽 底物，其并入了在通过在邻近赖氨酸残基处特异性切割的蛋白酶 Endo-LysC之作用而将调节剂与荧光团分开之前调节9AA之FLT的芳族 部分(例如色氨酸)。通过Set7/9进行的赖氨酸甲基化赋予了免于 Endo-LysC切割的保护，从而维持肽FLT的调节。因此，通过测定的所 测量FLT降低来报道赖氨酸甲基化。

通过进行酶、SAM和抑制剂滴定验证了FLT Set7/9测定的性能，并 且测定所确定的0.81的Z’-因子适合于HTS应用。

该研究为用于蛋白质赖氨酸甲基转移酶的FLT蛋白酶保护测定提供 了另外的示例，并且将该方法延伸到赖氨酸-4组蛋白甲基转移酶Set7/9。

(C)PRMT5概念验证FLT蛋白酶保护测定

PRMT5是PRMT的概念验证FLT蛋白酶保护测定的合适候选物。 该酶可商购自BPS Bioscience并且优先对称地甲基化组蛋白H4上的精氨 酸3和组蛋白H3上的精氨酸8(Branscombe等，J Biol.Chem2001，276， 32971-32976)。以下示出用于FLT测定的合适底物：

肽15：Ac-WSGR³GKGGK(9AA)GLGKGGAKRHRK-CONH₂

肽15基于组蛋白H4的N端序列，含有通过赖氨酸侧链连接的9AA 和在N端并入以调节未受损肽中9AA之FLT的色氨酸残基。预计用 Endo-ArgC处理在精氨酸-3处切割肽(由邻近N端的丝氨酸残基开始计 数)，从而将9AA与色氨酸分开，导致FLT提高。PRMT5对精氨酸-3 的甲基化可防止通过Endo-ArgC的切割，从而维持9AA之FLT的调节。 相比之下，PRMT5抑制剂的存在会防止精氨酸甲基化，从而使肽在精氨 酸-3处对蛋白酶诱导的切割敏感。由此，9AA的FLT会提高并且提高的 程度可与抑制程度相关。

Endo-ArgC切割

为了检查肽15的蛋白酶切割，在包含测定缓冲液(20mM Tris pH8， 25mM NaCl，1mM DTT，0.025％吐温-20)(30μL)中的肽15(1μM) 和不同浓度Endo-ArgC(Merck Chemicals Ltd.)(10nM至1.25nM)的 384孔微孔板中制备测定。在1小时中以规律的间隔测量FLT，并且测量 在NanoTaurus读板器上一式三份地进行。

经Endo-ArgC成功切割的肽15导致FLT由9.4ns提高至17.2ns(图 45)。FLT的这种大的改变提供了PRMT5之灵敏测定的可能性。

甲基化的证据

将肽15(15μM)与测定缓冲液(20mM Tris pH8，25mM NaCl， 1mM DTT，0.025％吐温-20)(200μL)中的PRMT5(150nM)和S- 腺苷甲硫氨酸(SAM)(100μM)孵育，以规律的时间间隔取出等量份并 通过RP-HPLC和ESI-MS进行分析以确定PRMT5对肽底物的甲基化程 度。测定在室温下进行并分别在0小时、3.5小时和17.5小时时间间隔取 样。

通过图46中的HPLC谱示出17.5小时时间过程中的测定进展。17.5 小时后，保留时间由t_R＝20.0分钟(在0小时)清楚地改变为t_R＝20.3分 钟。通过ESI-MS分析峰确定了由底物(m/z2466)向单甲基化产物(m/z 2480)的质量变化(图47)。此外，还观察到对应于二甲基化肽的小峰(m/z 2494)(图47)。

虽然由RP-HPLC看出反应仍然没有完成，但是通过以下过程来测试 用蛋白酶处理后对FLT的影响：用测定缓冲液将测定混合物稀释15倍并 且将20μL所得溶液添加到384孔微孔板的三个孔中。将10μL Endo-ArgC(终浓度为10nM)添加到每个孔中，并且将板在室温下孵育 60分钟后测量FLT。包括仅有相同浓度肽的对照用于比较。注意，这里 使用的Endo-ArgC来自于不同供应商(Sigma)并且证明活性小于用于 产生图45中数据的批次。因此，使用更高浓度和更长时间。

在PRMT5不存在下，在与10nM Endo-ArgC孵育后，肽15的FLT 提高了6.9ns(图48)。相比之下，对于在与Endo-ArgC孵育之前暴露于 PRMT5的肽15，FLT提高了4.7ns。该提高可归因于测定混合物中存在 的剩余底物，并且由于PRMT5催化的甲基化提供了蛋白酶保护而没有实 现完全提高。

PRMT5测定时间过程

在384孔黑色微孔板中以20μL体积进行测定并且在测定缓冲液中包 含肽15(1μM)和PRMT5酶(100nM、50nM、25nM或12.5nM)。 以规律的间隔通过添加10μL Endo-ArgC(终浓度1.25nM)终止反应。 在室温下与Endo-ArgC孵育15分钟后测量FLT。使用NanoTaurus读板 器将所有测量一式三份地进行。

由图49可以看出，在添加Endo-ArgC之前肽15的FLT没有变化。 但是，在添加蛋白酶并与其孵育后，FLT调节的程度作为PRMT5浓度和 测定时间的函数而改变，这与精氨酸甲基化赋予蛋白酶保护相一致。因此， 通过测定的所测量荧光寿命降低来报道通过PRMT5的精氨酸甲基化。

西奈芬净抑制剂滴定

为了证明用于PRMT5的FLT蛋白酶保护测定适合于抑制剂筛选， 购买了已知的通用SAM竞争性抑制剂西奈芬净(Sigma)并在测定中进 行测试。条件如下：测定缓冲液(20μL)中的西奈芬净(2mM至0.1μM)、 PRMT5(50nM)、SAM(10μM)和肽15(1μM)。反应在室温下在384 孔微孔板中一式三份地进行3小时，并且通过添加Endo-ArgC(1nM) 终止。对于西奈芬净测定IC₅₀为13μM(图51)。该抑制剂针对PRMT5 的IC₅₀值先前在同行评审的文献中未有报道。

总之，该工作为使用Endo-ArgC作为特异性蛋白酶的蛋白质精氨酸 甲基转移酶提供了FLT蛋白保护测定的示例。同时，使用PRMT5进行 举例说明，使用适当设计的肽底物可将这样的方法延伸至其他PRMT。

(D)用于EZH2赖氨酸甲基转移酶的FLT蛋白酶保护测定

在测定蛋白质甲基转移酶的FLT蛋白酶保护法的另一个示例中， EZH2(一种赖氨酸甲基转移酶)被验证为合适的靶标。

EZH2使组蛋白H3上的赖氨酸-27甲基化并且在与四种其他蛋白质 (EED、SUZ12、RbAp48和AEBP2)复合时具有活性。人重组五元复 合体可得自于BPS Bioscience。EZH2酶的突变与非霍奇金淋巴瘤之某些 形式的恶性肿瘤的风险提高相关(Morin，R.D.；Johnson，N.A.；Severson， T.M.；Mungall，A.J.；An，J.；Goya，R.；Paul，J.E.；Boyle，M.；Woolcock， B.W.；Kuchenbauer，F.；Yap，D.；Humphries，R.K.；Griffith，O.L；Shah， S.；Zhu，H.；Kimbara，M.；Shashkin，P.；Chariot，J.F.；Tcherpakov，M.； Corbett，R.；Tam，A.；Varhol，R.；Smailus，D.；Moksa，M.；Zhao，Y.； Delaney，A.；Qian，H.；Birol，I.；Schein，J.；Moore，R.；Holt，R.；Horsman， D.E.；Connors，J.M.；Jones，S.；Aparicio，S.；Hirst，M.；Gascoyne，R.D.； Marra，M.A.Nat.Genet.2010，42，181-185)。因此，药物发现小组努力探 索有助于寻找EHZ2的小分子抑制剂的测定。

基于H3K27序列的肽是EZH2酶复合体的合适底物，并且这样的肽 被修饰成包含9AA发光团和色氨酸残基，从而能够开发用于该酶的FLT 蛋白酶保护测定(图68)。

肽20：PRKQLATK(9AA)AARK²⁷SAPATGGW-CONH₂

将肽20暴露于赖氨酸特异性蛋白酶(例如Endo-LysC)将在邻近赖 氨酸-27处切割，导致9AA与色氨酸残基的调节作用分开，导致FLT提 高。相比之下，当赖氨酸-27通过EZH2的作用而被甲基化时，通过 Endo-LysC在该残基处的切割不再可能，从而维持了对9AA之FLT的调 节。因此，通过测定的所测量FLT降低来报道EZH2甲基化。

肽20的Endo-LysC切割

通过在测定缓冲液(20mM Bicine pH7.6，50mM NaCl，0.002％吐 温-20，0.005％BSA，1mM DTT)(20μL)中不同浓度的Endo-LysC(4～0 nM)存在下在包含肽20(1μM)的384孔hi-base微孔板中研究肽20 的蛋白酶切割。1小时中以规律的间隔测量FLT，并且测量在NanoTaurus 读板器上一式三份地进行。

通过Endo-LysC切割肽20导致FLT的时间和浓度依赖性提高，原 因是赖氨酸-27处的切割导致9AA与色氨酸的调节作用分开(图69)。FLT 由12ns提高至16ns，为测定提供了良好的动态范围。

EZH2测定时间过程

测定在384孔hi-base黑色微孔板中以10μL体积进行并且包含缓冲 液(20mM Bicine pH7.6，50mM NaCl，0.002％吐温-20，0.005％BSA， 1mM DTT)中的肽20(1μM)、SAM(3μM)和EZH2复合体(200ng/ 孔至75ng/孔)。以规律的间隔通过添加10μL Endo-LysC(终浓度4nM) 终止反应。在室温下与Endo-LysC孵育35分钟后测量FLT。所有测量使 用NanoTaurus读板器一式两份地进行。

由图70可以看出，在与蛋白酶孵育后，所测量的FLT作为EZH2浓 度和测定时间的函数而降低，这与赖氨酸-27的甲基化赋予针对蛋白酶诱 导切割的保护相一致。关于75和100ng/孔EZH2，响应都是线性的，选 择后一浓度用于后续的实验。注意，由于EZH2复合体的周转率较低，所 以使测定运行较长的一段时间。总之，通过测定的所测量荧光寿命降低来 报道通过EZH2的甲基化。

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)滴定

使用肽20作为底物研究了EZH2测定对SAM辅因子的依赖性。测 定使用100ng/孔EZH2复合体和1μM底物在测定缓冲液(10μL)中在 室温下在384孔hi-base微孔板中进行5小时。SAM浓度在100μM至0.05 μM之间变化。完成后，向每个孔中添加Endo-LysC(4nM)并且在15 分钟孵育期后测量FLT。将数据在GraphPad Prism中拟合至可变斜率剂 量响应模型(variable slope dose-response model)以确定SAM的K_M(app)。

由图71看出，在EZH2测定中SAM的K_M(app)测定为0.71μM。该 值与放射性计量测定形式中确定的文献值0.21至0.30μM(Sneeringer，C. J.；Scott，M.P.；Kuntz，K.W.；Knutson，S.K.；Pollock，R.M.；Richon，V. M.；Copeland，R.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A2010，107，20980-20985) 非常吻合。

S-腺苷高半胱氨酸(SAH)抑制剂滴定

为了证明用于EZH2的FLT蛋白酶保护测定适合于抑制剂筛选，购 买了已知的通用SAM竞争性抑制剂SAH(Sigma)并在测定中进行测试。 条件如下：测定缓冲液(10μL)中的SAH(1mM～0.05μM)、EZH2复 合体(100ng/孔)、SAM(3μM)和肽20(1μM)。反应在384孔hi-base 微孔板中在室温下进行5小时(重复三次)并通过添加Endo-LysC(4nM) 终止。

对于SAH，确定IC₅₀为9.7μM(图72)。针对EZH2的该抑制剂的 IC₅₀值先前在同行评审的文献中未有报道。

总之，肽20已被验证为用于FLT蛋白酶保护测定中赖氨酸甲基转移 酶EZH2的底物。测定的基础是使用9AA标记肽底物，其并入了在调节 剂与荧光团被在邻近赖氨酸残基处特异性切割的蛋白酶Endo-LysC之作 用而分开之前调节9AA之FLT的芳族部分(例如，色氨酸)，从而维持 对肽FLT的调节。因此，通过测定的所测量FLT降低来报道赖氨酸甲基 化。

通过进行酶、SAM和抑制剂滴定证明FLT EZH2测定性能。

该研究为蛋白质赖氨酸甲基转移酶提供了FLT蛋白酶保护测定的另 一个示例，并且将该方法延伸至赖氨酸-27组蛋白甲基转移酶EZH2。

实施例3-用于蛋白质脱甲基酶的FLT保护测定

图25示出了通过FLT蛋白酶保护法测定蛋白质脱甲基酶(PDM) 的方法，所述脱甲基酶将一个或更多个甲基从肽/蛋白质底物的赖氨酸或 精氨酸残基中移除。在这里，9-氨基吖啶(9AA)(或其他合适的报道分 子)的底物寿命受序列中色氨酸残基(或其他已知的荧光寿命调节剂)之 存在的调节。用在赖氨酸或精氨酸之后切割的蛋白酶处理底物不引起蛋白 质水解并且保留了通过色氨酸的寿命调节。通过适当PDM酶进行赖氨酸 或精氨酸脱甲基化后，然后用蛋白酶处理产物肽引起赖氨酸或精氨酸后的 切割并且荧光团(9AA)的寿命不再受调节。

重组PKDM(例如，LSD1，Jumonji结构域类)酶可商购自供应商 例如BPS Bioscience、Millipore或Enzo-Life Sciences。迄今为止鉴定的 唯一一种PRDM为JMJD6(Cheng，B.，Chen，Y.，Zhao，Y.，Bruick，R.K.， Science，2007，318，444-447)，但是最近的研究反驳其声称的脱甲基酶活 性，认为其主要作用是催化赖氨酸残基的水解(Webby，C.J.，Wolf，A.， Gromak，N.，Dreger,M.，Kramer,H.，Kessler,B.，Neilsen，M.L，Schmitz， C，Butler,D.S.，Yates III，J.R.，Delahunty，C.M.，Hahn，P.，Lengeling，A.， Mann，M.，Proudfoot，N.J.，Schofield，C.J.和A.，Science，2009， 325，90-93)。

JHDM1A是用于PKDM之概念验证FLT蛋白酶保护测定的合适候 选物。该酶可商购自BPS Bioscience并且优先使组蛋白H3上的赖氨酸-36 脱甲基化，将其由二甲基化或单甲基化状态转化为天然的未甲基化残基 (Tsukada，U.等，Nature，2006，439，811-826)。用于FLT测定的合适底物 是图26所示的肽10。

在图26所示的这个实施例中，9AA的FLT受在C端附近合并的色 氨酸残基之存在的调节。JHDM1A对赖氨酸-36的脱甲基化允许该残基处 的蛋白酶诱导切割，从而减轻调节并导致9AA的FLT提高。相比之下， JHDM1A抑制剂的存在可防止赖氨酸脱甲基化，从而使肽在赖氨酸-36处 保留对蛋白酶诱导切割的抗性。因此，9AA的FLT仍受调节并且调节程 度可与脱甲基化的程度相关。对于该目的合适的蛋白酶是Endo-LysC，其 不切割甲基化赖氨酸(赖氨酸-37作为单甲基衍生物被保护以防止该残基 的非特异性切割)。Endo-LysC可商购自供应商例如Thermo-Fisher。

JHDM1A测定

测定在384孔黑色微孔板中以20μL体积进行并且包含测定缓冲液 (50mM Tris，pH7.4，100μM抗坏血酸钠，10μM硫酸亚铁铵，100μM α-酮戊二酸盐，0.01％吐温-20)中的肽10(1μM)和JHDM1A酶(150nM)。 还包括仅包含肽的对照孔。在室温下孵育5小时后，将10μL Endo-LysC (30nM)添加到孔中并在室温下将板孵育直至120分钟。然后在 NanoTaurus读板器上一式三份地测量FLT。

肽10对照的FLT在与蛋白酶孵育后不提高，这与甲基化赖氨酸赋予 蛋白酶保护导致固有色氨酸残基对9AA之FLT的持续调节相一致(图 35)。相比之下，在与JHDM1A反应后，肽10的FLT在蛋白酶处理后提 高超过1ns。该结果与JHDM1A对赖氨酸-36的脱甲基化使得肽对 Endo-LysC切割敏感相一致(图35)。因此，通过测量的荧光寿命提高来 报道脱甲基酶对底物的脱甲基化，并因此报道脱甲基酶活性。

这些结果证明FLT蛋白酶保护策略可延伸至测定蛋白质脱甲基酶靶 标类。

实施例4-用于组蛋白乙酰转移酶的FLT蛋白酶保护测定

图27示出了通过FLT蛋白酶保护法测定组蛋白乙酰转移酶(HAT) 的方法，所述乙酰转移酶使肽/蛋白质底物中的赖氨酸残基乙酰化。在这 里，9-氨基吖啶(9AA)(或其他合适的报道分子)的底物寿命受序列中 色氨酸(或其他已知的荧光寿命调节剂)之存在的调节。用在赖氨酸之后 切割的蛋白酶处理底物将引起蛋白酶水解并移除色氨酸残基对荧光寿命 的调节。通过适当的HAT酶使赖氨酸乙酰化后，然后用蛋白酶处理产物 肽不引起赖氨酸后的切割并且荧光团(9AA)的寿命仍受调节。

重组HAT酶(例如，Gcn5、PCAF、Hat1、p300)可商购自供应商 例如abnova或millipore。

基于在具体HAT乙酰化位点的赖氨酸残基对侧并入荧光团和调节残 基的组蛋白N端序列的肽底物可形成该类酶FLT蛋白酶保护测定的基础。 肽16是基于具有PCAT乙酰化位点K14的组蛋白H3序列(图28)。

肽16：WQTARK(Me)STGGK¹⁴APRK(9AA)QLATK-CONH₂

肽16的Endo-LysC切割

通过在Endo-LysC(25nM)存在或不存在下，在包含测定缓冲液(50 mM Tris pH8，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.05％BSA)(30μL)中的 肽16(1μM)的384孔微孔板中进行测定研究了肽16的蛋白酶切割。1 小时中以规律的间隔测量FLT，并且测量在NanoTaurus读板器上一式三 份地进行。

当与Endo-LysC孵育1小时后，肽16的FLT由13.9ns提高至15.7 ns(图52)。相比之下，在Endo-LysC不存在下，FLT在该时间段中保持 不变。这些结果与Endo-LysC在赖氨酸-14处的切割导致9AA荧光团与 色氨酸残基的调节作用分开，导致9AA之FLT提高相一致。还设计了第 二种底物，其中9AA与色氨酸更接近(图53)。用肽17重复如上详述的 通过Endo-LysC的切割反应，结果示于图54中。

肽17：9AA-STGGK¹⁴APRWQLATK-CONH₂

对于肽17，在暴露于Endo-LysC后FLT由10.2ns提高至15.0ns， 提供了4.8ns的测定范围，这与肽16观察到的1.8ns范围相比有显著提 高。此外，曲线在1小时后没有变平，提供了通过延长切割反应再进一步 提高测定范围的选择。

乙酰化的证据

将肽17(30μL)与测定缓冲液(50mM Tris pH8，0.1mM EDTA， 1mM DTT，0.05％BSA)(250μL)中的PCAF(100nM)和乙酰辅酶 A(AcCoA)(50μM)孵育，以规律的时间间隔取出等量份并通过 RP-HPLC和ESI-MS进行分析以确定pCAF对肽底物的乙酰化程度。测 定在室温下进行并且分别在0分钟、30分钟、60分钟和90分钟时间间隔 取样。

通过图55中的HPLC谱示出了90分钟时间过程中的测定进展。30 分钟后明显有一个与底物峰(t_R＝16.1分钟)分开的新峰(t_R＝16.7分钟) 出现。通过ESI-MS分析该峰确定t_R＝16.7分钟的新峰的质量比底物高42 amu，这与添加一个乙酰基相一致(图56)。到90分钟时，底物峰可以 忽略，被替换为乙酰化产物的峰。因此，该实验确定肽17是用于PCAF 的良好底物。

PCAF测定时间过程

测定在384孔黑色微孔板中以20μL体积进行并且包含测定缓冲液中 的肽17(1μM)、AcCoA(50μM)和PCAF酶(250nM至31nM)。以 规律的间隔通过添加10μL Endo-LysC(终浓度25nM)终止反应。在室 温下与Endo-LysC孵育90分钟后测量FLT。所有的测量在NanoTaurus 读板器上一式两份地进行。

由图57A可以看出，在添加Endo-LysC之前肽17的FLT变化可以 忽略。但是，在添加蛋白酶并与其孵育后，FLT作为PCAF浓度和测定 时间的函数而降低，这与赖氨酸乙酰化赋予了针对蛋白酶诱导切割的保护 相一致(图57B)。总之，通过测定的所测量荧光寿命降低来报道通过PCAF 的乙酰化。

AcCoA滴定

研究了PCAF测定对AcCoA浓度的依赖性。测定使用125nM PCAF 和1μM肽17在测定缓冲液(20μL)中在室温下在384孔微孔板中进行 2小时。AcCoA的浓度在25μM至0.02μM之间变化。反应完成后，向 每个孔中添加Endo-LysC(25nM)并在90分钟孵育期后测量FLT。将 数据在GraphPad Prism中拟合至可变斜率剂量响应模型以确定AcCoA 的表观K_M。

由图58看出，在PCAF测定中AcCoA的K_M(app)测定为1.2μM。 该值与报道的K_M1.6μM(Poux，A.N；Cebrat，M.；Kim，C.M.；Cole，P.A.； Marmorstein，R.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2002，99，14065-14070)相一 致。

总之，肽17已被验证为用于FLT蛋白酶保护测定中组蛋白乙酰转移 酶PCAF的底物。测定的基础是使用9AA标记的肽底物，其并入了在调 节剂与荧光团被在邻近赖氨酸残基处特异性切割的蛋白酶Endo-LysC之 作用而分开之前调节9AA之FLT的芳族部分(例如色氨酸)。通过pCAF 使赖氨酸乙酰化赋予了对于Endo-LysC切割的保护，从而维持了肽FLT 的调节。因此，通过测定的所测量FLT降低来报道赖氨酸乙酰化。

通过进行酶和SAM滴定验证FLT PCAF测定性能。

该研究使用PCAF作为代表性实例为组蛋白乙酰转移酶的FLT蛋白 酶保护测定提供了示例。

实施例5-用于组蛋白脱乙酰酶的FLT蛋白酶保护测定

图29示出了通过FLT蛋白酶保护法测定组蛋白脱乙酰酶(HDAC) 的方法，所述脱乙酰酶使肽/蛋白质底物的赖氨酸残基脱乙酰化。在这里， 9-氨基吖啶(9AA)(或其他合适的报道分子)的底物寿命受序列中色氨 酸残基(或其他已知的荧光寿命调节剂)之存在的调节。底物由于赖氨酸 残基的乙酰化性质而被保护免于被赖氨酸特异性蛋白酶切割，从而维持荧 光团的FLT调节。通过适当HDAC的脱乙酰化使得肽在赖氨酸处对蛋白 酶诱导切割敏感，导致荧光团与调节序列分开并且FLT随之提高。重组 HDAC酶(例如，HDAC1-11、SIRT1-5)可商购自供应商例如Millipore， Signalchem，Sigma-Aldrich，Enzo Life Sciences或BPS Bioscience。

如图30所示的底物可适用于基于FLT的蛋白酶保护测定。在这里， 在邻近脱乙酰化的赖氨酸的C端并入了荧光团(9AA)，并且色氨酸(或 其他合适的调节残基)布置在前述赖氨酸的N端侧上。在HDAC催化脱 乙酰化后的蛋白酶诱导切割导致FLT提高，原因是9AA与色氨酸残基被 分开。因此，FLT的提高可与HDAC活性直接相关。当然，考虑根据所 讨论HDAC的序列特异性可采用其他类似地设计的底物。

HDAC1是用于组蛋白脱乙酰酶之概念验证FLT蛋白酶保护测定的 合适候选物，原因是它是可商购自供应商例如BPS Bioscience的被很好表 征的酶。虽然已报道HDAC1使组蛋白H3上的赖氨酸-27脱乙酰化，但 是文献的证据表明HDAC1和其他成员可识别包含图30所示类型的乙酰 化赖氨酸残基的短肽底物(Riester，D.；Hildmann，C；Grünewald，S.； Beckers，T.；Schwienhorst，A.Biochem.Biophys.Res.Commun.2007，357， 439-445)。因此，用于HDAC1FLT蛋白酶保护测定的合适底物是以下和 图59示出的肽18

肽18：Ac-IWK(Ac)K(9AA)-CONH₂

肽19：Ac-IWKK(9AA)-CONH₂

在肽18的乙酰化赖氨酸残基的N端侧是色氨酸残基，并且在C端侧 有其侧链标记有9AA荧光团的赖氨酸残基。在未受损的底物中，9AA的 FLT受位于附近的色氨酸残基调节。通过HDAC1使赖氨酸残基脱乙酰化 以形成肽19(图60)使得肽对适当酶(例如胰蛋白酶)在该位点的切割 敏感，导致9AA与色氨酸分开，导致FLT提高。将底物18暴露于胰蛋 白酶不引起切割，原因是所述蛋白酶不识别乙酰化赖氨酸。此外，HDAC1 抑制剂的存在将阻止赖氨酸脱乙酰化，从而保留肽对蛋白酶诱导切割的抗 性。因此，9AA的FLT仍受调节并且调节程度可与抑制程度相关。

肽18和19的胰蛋白酶切割

为了检查肽18和19的蛋白酶切割，在包含测定缓冲液(25mM Tris  pH8，137mM NaCl，2.7mM KCl，1mM MgCl₂，0.01％BSA)(30μL) 中的肽18(1μM)或19(1μM)和不同浓度胰蛋白酶(625pM至0pM) 的384孔微孔板中制备测定。1小时中以规律的间隔测量FLT，并且测量 在NanoTaurus读板器上一式三份地进行。

当将肽18暴露于不同浓度的胰蛋白酶时没有观察到FLT提高，这与 该蛋白酶不能在乙酰化赖氨酸附近切割相一致(图61A)。相比之下，当 将对应的脱乙酰化肽19与胰蛋白酶孵育时，FLT具有时间和浓度依赖性 提高，原因是赖氨酸处的切割导致9AA与色氨酸的调节作用分开(图 61B)。FLT由5.5ns提高至16ns，提供了10.5ns的优良测定范围。

脱乙酰化的证据

将肽18(15μM)与测定缓冲液(25mM Tris pH8，137mM NaCl， 2.7mM KCl，1mM MgCl₂，0.01％BSA)(200μL)中的HDAC1(200nM) 孵育，以规律的时间间隔取出等量份并通过RP-HPLC和ESI-MS进行分 析以确定HDAC1对肽底物的脱乙酰化程度。测定在室温下进行并且分别 在0小时、2小时、4小时和6小时时间间隔取样。

通过图62中的HPLC谱示出了6小时时间过程中的测定进展。2小 时后，明显有一个与底物峰(t_R＝21.2分钟)分开的新峰(t_R＝19.1分钟) 出现。通过ESI-MS分析峰确定了t_R＝16.7分钟的新峰的质量比底物小42 amu，这与失去一个乙酰基相一致(图63)。但是正如通过t_R＝21.2分钟 的底物峰的持续存在所证明的，反应在6小时后似乎没有达到完成，其原 因可能是试剂随时间降解。该实验确定了肽18是用于HDAC1的底物。

HDAC1测定时间过程

测定在384孔黑色微孔板中以20μL体积进行并且包含测定缓冲液中 的肽18(1μM)和HDAC1酶(200nM至25nM)。以规律的间隔通过 添加10μL胰蛋白酶(终浓度10nM)终止反应。在室温下与Endo-LysC 孵育10分钟后测量FLT。所有的测量在NanoTaurus读板器上一式两份 地进行。

由图64A可以看出，在添加胰蛋白酶之前FLT的改变可以忽略。但 是，在添加蛋白酶并与其孵育后，FLT作为HDAC1浓度和测定时间的函 数而提高，这与赖氨酸脱乙酰化使得肽对蛋白酶诱导切割敏感相一致(图 64B)。使用200nM HDAC1在2小时后导致完全脱乙酰化，正如通过FLT 值的平台所表明的；而25nM HDAC1导致信号随时间线性提高。总之， 通过测定的所测量荧光寿命提高来报道通过HDAC1的乙酰化。

底物滴定

研究了HDAC1测定对肽底物浓度的依赖性。测定使用25nM  HDAC1在测定缓冲液(20μL)中在室温下在384孔微孔板中进行1小 时。肽18的浓度在40μM至0.3μM之间变化。反应完成后，向每个孔 中添加胰蛋白酶(10nM)并在10分钟孵育期后测量FLT。参照标准曲 线将数据转化为产物形成速率并且在GraphPad Prism中拟合到 Michaelis-Menten模型以确定底物K_M。

由图65看出，在HDAC1测定中底物18的K_M确定为22.5μM。该 值与HDAC测定中采用的其他短肽底物(Riester，D.；Hildmann，C； Grünewald，S.；Beckers，T.；Schwienhorst，A.Biochem.Biophys.Res. Commun.2007，357，439-445)相一致。

曲古抑菌素A抑制剂滴定

为了证明用于HDAC1的FLT蛋白酶保护测定适合于抑制剂筛选， 购买了已知的通用型HDAC抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA) 并在测定中进行测试。条件如下：测定缓冲液(20μL)中的TSA(1μM 至5.6nM)、HDAC1(25nM)和肽18(10μM)。反应在室温下在384 孔微孔板中一式三份地进行1.5小时，并且通过添加胰蛋白酶(10nM) 终止。

TSA的IC₅₀测定为0.89nM(图66)，这与文献报道的1.3nM的IC₅₀(Halley，F.；Reinshagen，J.；Ellinger，B.；Wolf，M.；Niles；A.M.；Evans，N. J.；Kirkland，T.A.；Wagner，J.M.；Jung，M.；Gribbon，P.；Gul，S.J. Biomol.Screen.2011，16，1227-1235)相一致。

Z’-因子

为了证明HDAC1FLT测定与高通量筛选(HTS)兼容，确定了Z’- 因子的值。

在384孔微孔板中建立测定，其中板的一半包含HDAC1(25nM) 和肽18(10μM)，而另一半包含HDAC1(25nM)、肽18(10μM)和 TSA抑制剂(1μM)。最终测定体积为20μL并且将板在室温下孵育1.5 小时，此时向每个孔中添加测定缓冲液(10μL)中的胰蛋白酶(10nM 终浓度)。在室温下再孵育15分钟后，测量FLT并计算Z’-因子为0.85 (图67)，证明测定适合于HTS筛选。

总之，肽18已被验证为FLT蛋白酶保护测定中组蛋白脱乙酰酶 HDAC1的底物。测定的基础是使用9AA标记的肽底物，其并入了在调 节剂与荧光团被在邻近赖氨酸(或精氨酸)残基处特异性切割的蛋白酶胰 蛋白酶之作用而分开之前调节9AA之FLT的芳族部分(例如，色氨酸)。 HDAC1的赖氨酸脱乙酰化使得肽对胰蛋白酶的切割敏感，由于9AA荧 光团与调节剂被分开而导致FLT提高。因此，通过测定的所测量FLT提 高来报道赖氨酸脱乙酰化。

通过进行酶、底物和抑制剂滴定证明了FLT HDAC1测定性能，并且 0.85的Z’-因子确定测定适合于HTS应用。

该研究使用HDAC1作为代表性实例为组蛋白脱乙酰酶的FLT蛋白 酶保护测定提供了示例。

实验-材料和方法

以下章节提供了用于实施例1至5的实验方案、材料和方法的另一些 细节。

概述

除非另有说明，否则试剂和溶剂购买自Sigma-Aldrich、Merck  Chemicals、New England Biolabs、Thermo-Fisher或Rathburn并且以供 应原样使用。人重组PAD4酶通过Insight Biotechnology购买自Origene。 人重组G9a酶购买自Millipore、Abcam或BPS Bioscience(通过AMSBio， UK)。人重组PAD2酶购买自Modiquest Research、Nijmegen、The  Netherlands。人重组JHDM1A、Set7/9、PRMT5、HDAC1和 EZH2/EED/SUZ12/RbAp48/AEBP2复合体通过AMSBio，UK购买自BPS  Bioscience并且人重组PCAF购买自Enzo Life Sciences。3-(9-氨基吖啶-2- 基)-丙酸由Almac Sciences，Craigavon，NI制备并且以供应原样使用。384 孔微孔板购买自Greiner(#781076或784076)。

质谱得自于Bruker microTOF电喷雾MS。分析型RP-HPLC使用 Agilent1100或1200系列HPLC系统进行，所述系统使用Phenomenex  Luna C18柱(250×4.6mm)和包含0.1％TFA的水/乙腈梯度，流速为1 ml/分钟。制备型RP-HPLC使用Gilson HPLC系统进行，所述系统由 Gilson305泵、Gilson811C动态混合器和ABI783A UV检测器组成，并 且使用Phenomenex Luna C18柱(250×21.2mm)和包含0.1％TFA的 水/乙腈梯度，流速为9ml/分钟。

荧光寿命在NanoTaurus荧光寿命读板器(Edinburgh Instruments  Ltd.)上采用时间相关单光子计数(time-correlated single photo counting， TCSPC)进行测量。激发源是405nm的半导体激光，其以5MHz的重 复频率产生皮秒光脉冲。通过带宽20nm的438nm带通滤波器(Semrock) 收集发射。在峰通道中收集3000次计数的数据并使用双指数衰减模型 (biexponential decay model)计算平均寿命。

肽合成

使用标准的Fmoc/tBu SPPS化学，在具有0.20～0.25mMol Rink酰胺 树脂的ABI433肽合成器上进行自动化固相肽合成，每个偶联循环使用1 mmol Fmoc-氨基酸和HOCt(1-羟基-1H-1，2，3-三唑-4-羧酸乙酯)或Oxyma  Pure(2-氰基-2-(羟基亚胺基)乙酸乙酯)/DIC(N，N′-二异丙基碳二亚胺) 偶联剂。通过用0.5M乙酸酐的DMF溶液处理来封闭未反应的氨基。通 过用20％v/v哌啶的DMF溶液处理20分钟进行Fmoc移除。当荧光团 标记是通过赖氨酸残基进行时，根据染料连接位点在肽序列N端还是肽 序列内，使用Boc-Lys(Fmoc)-OH或Fmoc-Lys(ivDde)-OH构件有助于正 交脱保护。通过用3％肼的DMF溶液处理从树脂上移除ivDde基团。

通过以下过程进行3-(9-氨基吖啶-2-基)-丙酸对肽的手动标记：将染料 (相对于树脂为2当量)溶解于最小体积的DMF中，以及用0.5M HOCt (1-羟基-1H-1，2，3-三唑-4-羧酸乙酯)(3当量)和0.5M DIC(2当量)的 DMF溶液通过超声活化30分钟。然后将活化的染料添加到树脂中，在 DMF中预膨胀，并且在室温下将反应混合物超声搅拌5小时后使其在室 温下静置过夜。过滤树脂，用DMF和DCM彻底清洗并在真空中下干燥 过夜。

在伴有侧链脱保护的情况下，通过用92.5％TFA v/v、5％H₂O v/v、 2.5％TIS v/v处理4小时将肽从固相中切割下来。通过过滤移除树脂，粗 制肽从冰冷的醚中沉淀出来并且通过以4000rpm离心5分钟进行收集。 然后将粗制肽溶解于MeCN/H₂O(50∶50)中并冻干，然后通过制备型 HPLC纯化至＞95％的纯度。基于8735M^-1cm^-1的9AA摩尔消光系数(在 1∶1MeCN/水中405nm处)将标记的肽等分，并且在Varian Cary50UV 紫外分光光度计上进行测量。

缓冲条件

PAD4和PAD2缓冲液由pH8.0的20mM Tris/HCl，200μM CaCl₂， 5mM DTT和0.01％CHAPS构成。

G9a、Set7/9和PRMT5缓冲液由pH8.0的20mM Tris/HCl，25mM  NaCl，1mM DTT和0.025％吐温-20构成。

JHDM1A缓冲液由pH7.4的50mM Tris/HCl，100μM抗坏血酸钠， 10μM硫酸亚铁铵，100μMα-酮戊二酸盐和0.01％吐温-20构成。

HDAC1缓冲液由pH8.0的25mM Tris/HCl，137mM NaCl，2.7mM  KCl，1mM MgCl₂，0.01％BSA构成。

pCAF缓冲液由pH8.0的50mM Tris/HCl，0.1mM EDTA， 0.05％BSA，1mM DTT构成。

EZH2缓冲液由pH7.6的20mM Bicine，50mM NaCl，0.002％吐温 -20，0.005％BSA，1mM DTT构成。

切割测定

将相关测定缓冲液(10μL)中的Endo-LysC或胰蛋白酶添加到384 孔微孔板的孔中。还可包括其中将蛋白酶替换为测定缓冲液的对照。通过 添加测定缓冲液(10μL)中的肽底物开始反应并且以规律的间隔测量 FLT。所有的测量一式三份地进行。

PAD4测定

为了HPLC监测，测定在微型离心管中在室温下进行，总测定体积 为300μL。通过将肽添加到包含重组PAD4酶的溶液中开始反应。测定 中PAD4的终浓度为30nM并且肽的终浓度为15μM。在以下间隔从测 定混合物中取样(50μL)：0分钟、30分钟和60分钟，然后添加到包含 50μL水和0.1％TFA的玻璃HPLC小瓶(Crawford Scientific)中。将 全部的100μL样品注射到HPLC系统中，收集相关峰并稀释于MS缓冲 液(包含0.1％甲酸的1∶1MeCN/水)中用于分析。

当确证了肽底物的瓜氨酸化后，用测定缓冲液将测定混合物稀释15 倍，转移到384孔微孔板中(20μL/孔)并测量FLT。然后将胰蛋白酶(测 定缓冲液中10μL)添加到每个孔中并且在室温下将板孵育10分钟。然 后再次测量FLT。所有的测量一式三份地进行，并且孔中胰蛋白酶的终浓 度为10nM。

或者，测定在室温下在384孔微孔板中进行，测定体积为20μL/孔。 向包含测定缓冲液(10μL)中的重组PAD4酶的孔中添加测定缓冲液(10 μL)中的肽1。振摇板，然后用盖玻片密封。测定中PAD4的终浓度在 125至500pM之间变化，同时肽1的浓度维持在1μM不变。测定在不 同时间开始并且90分钟后通过添加胰蛋白酶(测定缓冲液中的10μL； 终浓度10nM)一起终止。在室温下孵育10分钟后，以500rpm将微孔 板离心1分钟并测量FLT。

对于底物滴定，向包含测定缓冲液(10μL)中不同浓度的肽1的孔 中添加测定缓冲液(10μL)中的PAD4。将板在室温下孵育1小时，然 后将10μL测定缓冲液中的胰蛋白酶添加到每个孔中。在室温下再孵育 10分钟后测量FLT。所有的测量一式三份地进行。

对于Z’-因子确定，384孔微孔板的一半装有10μL测定缓冲液中的 PAD4和肽1。其余的孔装有10μL不包含CaCl₂的测定缓冲液中的PAD4 和肽1。将板密封并在室温下孵育1小时。然后将10μL测定缓冲液中的 胰蛋白酶添加到每个孔中，在室温下孵育10分钟后测量FLT。试剂的终 浓度为：PAD4(125pM)；肽1(200nM)；胰蛋白酶(10nM)。

PAD2测定

为了HPLC监测，测定在微型离心管中在室温下进行，总测定体积 为300μL。通过将肽1添加到包含重组PAD2酶的溶液中开始反应。测 定中PAD2的终浓度为30nM并且肽的终浓度为15μM。在以下间隔从 测定混合物中取样(50μL)：0分钟、30分钟和120分钟，然后添加到包 含50μL水和0.1％TFA的玻璃HPLC小瓶(Crawford Scientific)中。 将全部的100μL样品注射到HPLC系统中，收集相关峰并稀释于MS缓 冲液(包含0.1％甲酸的1∶1MeCN/水)中用于分析。

当确证了肽底物的瓜氨酸化后，用测定缓冲液将测定混合物稀释15 倍，转移到384孔微孔板中(20μL/孔)并测量FLT。然后将胰蛋白酶(测 定缓冲液中10μL)添加到每个孔中并且在室温下将板孵育10分钟。然 后再次测量FLT。所有的测量一式三份地进行，并且孔中胰蛋白酶的终浓 度为10nM。

或者，测定在室温下在384孔微孔板中进行，测定体积为20μL/孔。 向包含测定缓冲液(10μL)中的重组PAD2酶的孔中添加测定缓冲液(10 μL)中的肽1。还包括仅含肽或瓜氨酸化肽的对照。振摇板，然后用盖玻 片密封。测定中PAD2的终浓度在23.5至1.5nM之间变化，同时肽1的 浓度维持在1μM不变。测定在不同时间开始并且60分钟后通过添加胰 蛋白酶(测定缓冲液中的10μL；终浓度10nM)一起终止。在室温下孵 育10分钟后，以500rpm将微孔板离心1分钟并测量FLT。所有的测量 一式三份地进行。

G9a测定

为了HPLC监测，测定在微型离心管中在室温下进行，总测定体积 为150μL。通过将SAM(100μM)添加到包含重组G9a酶的溶液中开 始反应。测定中G9a的终浓度为100μM并且肽的终浓度为15μM。在以 下间隔从测定混合物中取样(50μL)：0分钟、2小时和6小时，然后添 加到包含50μL水和0.1％TFA的玻璃HPLC小瓶(Crawford Scientific) 中。将全部的100μL样品注射到HPLC系统中，收集相关峰并稀释于 MS缓冲液(包含0.1％甲酸的1∶1MeCN/水)中用于分析。

或者，测定在室温下在384孔微孔板中进行，测定体积为20μL/孔。 向包含测定缓冲液(5μL)中的重组G9a酶的孔中添加测定缓冲液(10μL) 的肽。通过添加SAM(5μL)开始反应。振摇板，然后用盖玻片密封。 G9a浓度在200nM与1.5nM之间变化并且SAM浓度在200与0.4μM 之间变化。肽的浓度维持在1μM不变。测定在不同时间开始并且在2小 时后通过添加Endo-LysC(测定缓冲液中的10μL；终浓度2nM)一起 终止。在室温下孵育10分钟后，以500rpm将微孔板离心1分钟并测量 FLT。

对于抑制剂滴定，将化合物(5μL)与G9a(5μL)在室温下预孵育 30分钟后添加肽5(5μL)和SAM(5μL)。包括不包含SAM或抑制剂 的对照。

对于Z’-因子确定，384孔微孔板的一半装有10μL测定缓冲液中的 G9a、肽9和SAM。其余的孔装有10μL G9a和肽9并且不存在SAM。 将板密封并在室温下孵育1小时。然后将10μL测定缓冲液中的 Endo-LysC添加到每个孔中，在室温下孵育10分钟后测量FLT。试剂的 终浓度为：G9a(625pM)；肽9(1μM)；Endo-LysC(2nM)。

Set7/9测定

为了HPLC监测，测定在微型离心管中在室温下进行，总测定体积 为200μL。通过将SAM添加到包含重组Set7/9酶和肽12的溶液中开始 反应。测定中试剂的终浓度为172nM(Set7/9)、100μM(SAM)和15μM (肽12)。在以下间隔从测定混合物中取样(50μL)：0小时、2小时和6 小时，然后添加到包含50μL水和0.1％TFA的玻璃HPLC小瓶(Crawford  Scientific)中。将全部的100μL样品注射到HPLC系统中，收集相关峰 并稀释于MS缓冲液(包含0.1％甲酸的1∶1MeCN/水)中用于分析。

当确证了肽底物的甲基化后，用测定缓冲液将测定混合物稀释15倍， 转移到384孔微孔板中(20μL/孔)并测量FLT。然后将Endo-LysC(测 定缓冲液中10μL)添加到每个孔中并且在室温下将板孵育15分钟。然 后再测量FLT。所有的测量一式三份地进行，并且孔中Endo-LysC的终 浓度为2nM。

或者，测定在室温下在384孔微孔板中进行，测定体积为20μL/孔。 向包含测定缓冲液(10μL)中的重组Set7/9酶和肽12或13的孔中添加 测定缓冲液的SAM(10μL)。还包括仅包含肽的对照。振摇板，然后用 盖玻片密封。测定中Set7/9的终浓度在100nM与12.5nM之间变化，同 时肽和SAM的浓度分别维持在1μM和100μM不变。测定在不同时间 开始并且在120分钟后通过添加Endo-LysC(测定缓冲液中的10μL；终 浓度2nM)一起终止。在室温下孵育15分钟后，以500rpm将微孔板离 心1分钟并测量FLT。所有的测量一式两份地进行。

对于抑制剂滴定，将化合物(5μL)与Set7/9(5μL)和肽13(5μL) 在室温下预孵育10分钟后添加SAM(10μL)。包括不包含SAM或不包 含抑制剂的对照。

对于Z’-因子确定，将10μL包含测定缓冲液中的Set7/9和肽13的 溶液添加到384孔微孔板的每个孔中。向板的一半中添加10μL测定缓冲 液，同时向另一半中添加测定缓冲液(10μL)中的SAM以使反应开始。 将板密封并在室温下孵育2小时。然后将测定缓冲液(10μL)中的 Endo-LysC添加到每个孔中，在室温下孵育15分钟后测量FLT。试剂的 终浓度为：Set7/9(25nM)；SAM(100μM)；肽13(1μM)；Endo-LysC (2nM)。

PRMT5测定

为了HPLC监测，测定在微型离心管中在室温下进行，总测定体积 为200μL。通过将SAM添加到包含重组PRMT5酶和肽15的溶液中开 始反应。测定中试剂的终浓度为150nM(PRMT5)、100μM(SAM)和 15μM(肽15)。在以下间隔从测定混合物中取样(50μL)：0小时、3.5 小时和17.5小时，然后添加到包含50μL水和0.1％TFA的玻璃HPLC 小瓶(Crawford Scientific)中。将全部的100μL样品注射到HPLC系 统中，收集相关峰并稀释于MS缓冲液(包含0.1％甲酸的1∶1MeCN/水) 中用于分析。

当确证了肽底物的甲基化后，用测定缓冲液将测定混合物稀释15倍， 转移到384孔微孔板中(20μL/孔)并测量FLT。然后将Endo-ArgC(测 定缓冲液中10μL)添加到每个孔中并且在室温下将板孵育15分钟。然 后再测量FLT。所有的测量一式三份地进行，并且孔中Endo-ArgC的终 浓度为10nM。

或者，测定在室温下在384孔微孔板中进行，测定体积为20μL/孔。 向包含测定缓冲液(10μL)中的重组PRMT5酶和肽15的孔中添加测定 缓冲液中的SAM(10μL)。还包括仅包含肽的对照。振摇板，然后用盖 玻片密封。测定中PRMT5的终浓度在100nM与12.5nM之间变化，同 时肽15和SAM的浓度分别维持在1μM和100μM不变。测定在不同时 间开始并且在120分钟后通过添加Endo-ArgC(测定缓冲液中的10μL； 终浓度1.25nM)一起终止。在室温下孵育15分钟后，以500rpm将微 孔板离心1分钟并测量FLT。所有的测量一式两份地进行。

对于抑制剂滴定，将化合物(5μL)与PRMT5/肽15(5μL)在室 温下预孵育30分钟后添加SAM(5μL)。测定在室温下运行3小时并通 过添加10μL Endo-ArgC终止。在室温下孵育1小时后测量FLT。还包 括不包含PRMT5或不包含抑制剂的对照。所有的测量一式三份地进行。

EZH2测定

酶滴定在室温下在384孔hi-base微孔板中进行，测定体积为10μL/ 孔。向包含测定缓冲液(5μL)中的重组EZH2复合体的孔中添加测定缓 冲液(5μL)中的肽20/SAM混合物。还包括不含EZH2的对照。振摇板， 然后用盖玻片密封。测定中EZH2的终浓度在100ng/孔与75ng/孔之间 变化，同时肽20和SAM的浓度分别维持在1μM和3μM不变。测定在 不同时间开始并且在6小时后通过添加Endo-LysC(测定缓冲液中的10 μL；终浓度4nM)一起终止。在室温下孵育35分钟后，以500rpm将 微孔板离心1分钟并测量FLT。所有的测量一式两份地进行。

对于SAM滴定，向包含测定缓冲液(2.5μL)中的不同浓度SAM的 孔中添加测定缓冲液(2.5μL)中的EZH2复合体。通过添加测定缓冲液 (5μL)中的肽20而开始反应。在室温下将板孵育5小时，然后将10μL 测定缓冲液中的Endo-LysC添加到每个孔中。在室温下再孵育15分钟后， 测量FLT。所有的测量一式三份地进行。

对于抑制剂滴定，将化合物(2.5μL)与EZH2复合体(2.5μL)在 室温下预孵育20分钟后添加测定缓冲液(5μL)中的肽20/SAM混合物。 测定在室温下运行5小时并通过添加10μL Endo-LysC终止。在室温下孵 育1小时后测量FLT。包括不包含EZH2或抑制剂的对照。所有的测量 一式三份地进行。

JHDM1A测定

测定在室温下在384孔微孔板中进行，测定体积为20μL/孔。向包含 测定缓冲液(10μL)中的重组JHDM1A酶的孔中添加测定缓冲液(10μL) 中的肽10。包括两组仅含肽10的对照孔。振摇板，然后用盖玻片密封。 测定中JHDM1A的终浓度为150nM，肽10的终浓度为1μM。在室温 下孵育5小时后，将Endo-LysC(测定缓冲液中10μL；终浓度10nM) 添加到测定孔和一组对照孔中。向另一组对照孔中添加10μL测定缓冲 液。在室温下孵育120分钟后，以500rpm将微孔板离心1分钟并测量 FLT。所有的测量一式三份地进行。

PCAF测定

为了HPLC监测，测定在微型离心管中在室温下进行，总测定体积 为250μL。通过将AcCoA添加到包含重组PCAF酶和肽17的溶液中开 始反应。测定中试剂的终浓度为100nM(PCAF)、50μM(AcCoA)和 30μM(肽17)。在以下间隔从测定混合物中取样(50μL)：0分钟、30 分钟、60分钟和90分钟，然后添加到包含50μL水和0.1％TFA的玻璃 HPLC小瓶(Crawford Scientific)中。将全部的100μL样品注射到HPLC 系统中，收集相关峰并稀释于MS缓冲液(包含0.1％甲酸的1∶1MeCN/ 水)中用于分析。

酶滴定在室温下在384孔微孔板中进行，测定体积为20μL/孔。向包 含测定缓冲液(10μL)中的重组PCAF酶的孔中添加测定缓冲液(10μL) 中的肽17/AcCoA混合物。还包括不包含PCAF的对照。振摇板，然后用 盖玻片密封。测定中PCAF的终浓度在250nM与31.3nM之间变化，同 时肽17和AcCoA的浓度分别维持在1μM和50μM不变。测定在不同时 间开始并且在120分钟后通过添加Endo-LysC(测定缓冲液中的10μL； 终浓度25nM)一起终止。在室温下孵育90分钟后，以500rpm将微孔 板离心1分钟并测量FLT。所有的测量一式两份地进行。

对于AcCoA滴定，向包含不同浓度AcCoA(测定缓冲液中5μL) 中添加5μL测定缓冲液中的肽17然后添加10μL测定缓冲液中的PCAF。 将板在室温下孵育2小时，然后将10μL测定缓冲液中的Endo-LysC添 加到每个孔中。在室温下再孵育90分钟后，测量FLT。所有的测量一式 三份地进行。

HDAC1测定

为了HPLC监测，测定在微型离心管中在室温下进行，总测定体积 为200μL。通过将肽18添加到包含重组HDAC1酶的溶液中开始反应。 测定中试剂的终浓度为200nM(HDAC1)和15μM(肽18)。在以下间 隔从测定混合物中取样(50μL)：0小时、2小时、4小时和6小时，然 后添加到包含50μL水和0.1％TFA的玻璃HPLC小瓶(Crawford  Scientific)中。将全部的100μL样品注射到HPLC系统中，收集相关峰 并稀释于MS缓冲液(包含0.1％甲酸的1∶1MeCN/水)中用于分析。

酶滴定在室温下在384孔微孔板中进行，测定体积为20μL/孔。向包 含测定缓冲液(10μL)中的重组HDAC1酶的孔中添加测定缓冲液(10 μL)中的肽18。还包括仅包含肽的对照。振摇板，然后用盖玻片密封。 测定中HDAC1的终浓度在200nM与25nM之间变化，同时肽18的浓 度维持在1μM不变。测定在不同时间开始并且在2小时后通过添加胰蛋 白酶(测定缓冲液中10μL；终浓度10nM)一起终止。在室温下孵育10 分钟后，以500rpm将微孔板离心1分钟并测量FLT。所有的测量一式 两份地进行。

对于底物滴定，向包含测定缓冲液(10μL)中的不同浓度肽18的孔 中添加测定缓冲液(10μL)中的HDAC1。将板在室温下孵育1小时， 然后将10μL测定缓冲液中的胰蛋白酶添加到每个孔中。在室温下再孵 育10分钟后测量FLT。所有的测量一式三份地进行。

对于抑制剂滴定，将化合物(5μL)与HDAC1(5μL)在室温下预 孵育30分钟后添加测定缓冲液(10μL)中的肽18。测定在室温下运行 1.5小时并通过添加10μL胰蛋白酶终止。在室温下孵育10分钟后测量 FLT。包括不包含HDAC1或不包含抑制剂的对照。所有的测量一式三份 地进行。

对于Z’-因子确定，384孔微孔板的一半装有5μL测定缓冲液和5μL 测定缓冲液中的HDAC1。其余的孔装有测定缓冲液中的5μL TSA抑制 剂和5μL HDAC1。在室温下预孵育30分钟后，将10μL测定缓冲液中 的肽18添加到每个孔中。密封板并在室温下孵育1.5小时。然后将10μL 测定缓冲液中的胰蛋白酶添加到每个孔中并在室温下孵育15分钟后测量 FLT。试剂的终浓度为：HDAC1(25nM)；TSA(1μM)，肽18(10μM)； 胰蛋白酶(10nM)。

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