梅花鹿鹿茸胸腺素β10重组蛋白及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及一种梅花鹿鹿茸胸腺素β10重组蛋白及其制备方法和用途，属于基因工程技术领域。所述方法包括鹿茸胸腺素β10基因的克隆、原核表达载体pET-28a-Tβ10的构建、在宿主菌E.coli BL21中的诱导表达、重组蛋白的分离纯化等步骤。本发明利用基因工程技术首次尝试了对梅花鹿鹿茸胸腺素β10的原核表达，成功构建了其原核表达载体，并诱导重组蛋白高效表达，纯化步骤简便、快捷。经体外活性研究发现，梅花鹿鹿茸胸腺素β10重组蛋白对成骨细胞M3T3有明显的促增殖作用。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀重组蛋白及其制备方法和用途。 

背景技术

梅花鹿鹿茸是鹿科动物梅花鹿雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，为我国传统名贵中药。鹿茸中的化学成分主要包括氨基酸、无机元素、蛋白质、脂类物质、糖类化合物等，其中蛋白质含量占50%以上。现代研究表明，鹿茸具有抗衰老、抗氧化、增强机体免疫力、抗肿瘤、抗化学药物损伤、抗溃疡等多种药理作用。近年来，随着生物技术的快速发展，越来越多的研究者开始关注鹿茸中具有生物活性的蛋白质及多肽类成分，它们在鹿茸的药用功能中占有极其重要的地位。 

鹿茸与其他哺乳动物的角有着明显的区别，可以周期性地进行脱落和再生。每年春天鹿茸自动脱落后，从角柄上长出新鹿茸，随后快速生长并形成分支，最快时每天可长2cm，到了秋天，鹿茸的生长速度变慢，软骨组织逐渐骨化形成硬骨，次年春天再次脱落，开始新一轮的循环，由于鹿茸具有独特的生长过程，对其生长机制的研究一直是生物学研究的热点。目前，尚未见制备梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀的相关报道。 

发明内容

本发明提供一种梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀重组蛋白及其制备方法和用途。 

一种梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所述。 

一种编码如权利要求1所述的梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀重组蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。 

本发明所述的梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀重组蛋白的制备方法，其步骤如下： 

（1）梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀基因的克隆：采用改良的Trizol法提取鹿茸总RNA，设计及合成胸腺素β₁₀特异引物，上游引物为5′—CATGCCATGGATGGCAGACAAGCCCGACAT—3′，下游引物为5′—CCCTCGAGTCACTTTGCTTGCTTCTCCT—3′，通过RT-PCR方法扩增得到胸腺素β₁₀基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，全长为129bp，与载体pMD18-T连接， 获得重组载体pMD18-T-Tβ₁₀，将其转化至E.coli DH5α感受态细胞中，用EcoR I和Sal I双酶切鉴定并进行测序验证； 

（2）梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀原核表达载体的构建：用EcoR I和Sal I将测序正确的重组载体pMD18-T-Tβ₁₀和表达载体pET-28a分别进行双酶切，连接后转化至E.coli BL21感受态细胞中，双酶切鉴定并进行测序验证； 

（3）梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀的表达和纯化：将构建成功的表达载体pET-28a-Tβ₁₀转化到宿主菌E.coli BL21中，用IPTG诱导表达。采用镍离子亲和层析进行分离纯化，并用Sephadex G-25凝胶层析脱盐，收集脱盐后的样品，冷冻干燥即得。 

所述的IPTG诱导表达，IPTG诱导浓度为0.5mmol/L，诱导时间为4h。 

所述的镍离子亲和层析分离纯化时，结合液为含有500mmol/L NaCl、20mmol/L咪唑，pH8.5的磷酸盐缓冲液，洗脱液为含有500mmol/L NaCl、500mmol/L咪唑，pH7.5的磷酸盐缓冲液。 

所述的梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀重组蛋白在制备对成骨细胞M3T3具有促增殖作用的药物中的应用。 

本发明利用基因工程技术首次成功构建了梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀原核表达载体，并诱导重组蛋白高效表达，纯化步骤简便，快捷。经体外活性研究发现，其对成骨细胞M3T3有明显的促增殖作用。从梅花鹿鹿茸中获取胸腺素β₁₀将对鹿茸快速生长机制的研究、鹿茸药效成分的研究以及鹿茸高科技含量产品的开发都具有重大意义，且应用前景广阔。 

附图说明

图1为梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀基因PCR扩增产物电泳图，1.胸腺素β₁₀基因；M.Maker自上而下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp； 

图2为原核表达载体pET-28a-Tβ₁₀双酶切鉴定电泳图，1.表达载体片段和目的基因；M.Maker自上而下依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp； 

图3为不同浓度IPTG诱导表达梅花鹿鹿茸Tβ10的SDS-PAGE电泳图，1-5.IPTG诱导浓度依次为0mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L； 

图4为梅花鹿鹿茸胸腺素β10重组蛋白纯化后SDS-PAGE电泳图，1.未纯化样品；2.流穿；3.Maker；4.纯化后样品。 

具体实施方式

以下实施例所用主要材料表 

实施例1：梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀基因的克隆 

1.提取鹿茸总RNA：称取鹿茸样品1.2g，在液氮中快速研磨成均匀细末，按1:10比例加入Trizol试剂，静置30min，继续研磨2min，然后将其转移至EP管中，每管1mL，各加入200μL的5M NaCl，充分震荡，再加入200μL的CHCl3，剧烈震荡，静置2min，离心，取上层。重复加CHCl₃萃取、离心，直至中间层没有杂质。转移上清至去RNase的EP管中，按1:1比例加入预冷的异丙醇，-20℃沉淀30min，离心，弃去上清，沉淀用1mL的75%乙醇洗涤，再用100%无水乙醇洗涤，挥干乙醇。经琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰明亮，无降解。 

2.特异引物的设计：应用软件Primer5设计胸腺素β₁₀特异引物，上游引物为5′—CATGCCATGGATGGCAGACAAGCCCGACAT—3′，下游引物为5′—CCCTCGAGTCACTTTGCTTGCTTCTCCT—3′。 

3.目的基因RT-PCR扩增：按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0说明书操作，扩增目的基因。PCR参数为95℃2min，95℃30s、60℃30s、72℃300s循环30次。用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物。经琼脂糖凝胶电泳检测，在129bp处得到单一清晰条带，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，atggcagaca agcccgacat gggggaaatc aacagcttcg ataaggccaa gctgaagaag actgagacgc aggagaagaa caccctgccg accaaagaga ccattgagca ggagaagcaa gcaaagtga，与预测的碱基数相吻合（图1）。 

4.目的基因与载体pMD18-T连接及鉴定：将目的基因克隆到载体pMD18-T上，获得重组载体pMD18-T-Tβ₁₀，并转化至E.coli DH5α感受态细胞中，取适当浓度的菌液均匀涂在37℃预热的LB固体培养基（含有50μg/mL Amp+）上，37℃平板倒置培养12h。筛选阳性单菌落接种于LB培养基（含有50μg/mL Amp+）中，37℃振荡培养12h。按照第三版《分子克隆》小剂量法提取质粒，通过EcoR I和Sal I双酶切鉴定，目的基因与载体pMD18-T连接成功，进一步测序结果正确。 

实施例2：梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀原核表达载体的构建 

用EcoR I和Sal I将测序正确的重组载体pMD18-T-Tβ₁₀和表达载体pET-28a分别进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离，按照胶回收方法回收目的基因和载体pET-28a，连接后转化至E.coli BL21感受态细胞中，涂板并于37℃培养，筛选阳性单菌落，用EcoR I和Sal I双酶切鉴定后，经琼脂糖凝胶电泳检测，表达载体片段和目的基因两条电泳条带清晰可见，且表达载体片段和目的基因的分子量均和理论值相符，初步鉴定原核表达载体pET-28a-Tβ₁₀构建成功（图2）。进一步测序后，比对测序结果证实序列完全匹配，即原核表达载体构建成功。 

实施例3：梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀的表达和纯化 

1.梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀的表达：将构建成功的原核表达载体pET-28a-Tβ₁₀转化到宿主菌E.coli BL21中，以37℃恒温，200r/min震荡培养12h后，按1:100的比例将菌液接种到新的LB（含有30μg/mL Kan+）培养基里，37℃震荡培养，每隔1h测定一次OD₆₀₀，在培养3.5h时达到其对数生长期。此时进行IPTG诱导表达，通过比较不同IPTG诱导浓度和不同诱导时间的SDS-PAGE电泳结果，优化出最佳IPTG诱导浓度为0.5mmol/L，最佳诱导时间为4h（图3）。将表达菌进行破壁处理后分别将上清和沉淀做SDS-PAGE电泳检测，显示Tβ₁₀重组蛋白为可溶性，没有形成包涵体。 

2.梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀的纯化：由于在构建重组基因表达载体时，在目的基因末端添加了组氨酸标签（His-tag），所以采用镍离子亲和层析进行分离纯化。结合液为含有500mmol/L NaCl、20mmol/L咪唑，pH8.5的磷酸盐缓冲液，洗脱液为含有500mmol/LNaCl、500mmol/L咪唑，pH7.5的磷酸盐缓冲液。由于亲和层析的流动相中含有高盐，因此经亲和层析纯化后的胸腺素β₁₀重组蛋白再用Sephadex G-25凝胶层析进行脱盐，收集脱盐后的样品，冷冻干燥即得，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，Met Ala Asp Lys Pro Asp Met Gly Glu Ile Asn Ser Phe Asp Lys Ala Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu  Lys Asn Thr Leu Pro Thr Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Lys，经SDS-PAGE电泳检测，纯化后的胸腺素β₁₀重组蛋白呈现单一条带（图4）。 

实施例4：梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀的体外活性检测 

用含有10%小牛血清的DMEM培养基培养复苏后的成骨细胞M3T3，待细胞生长状态良好，以1.0×10⁴/mL的细胞浓度接种于96孔板中，培养24h。再用含有0.4%小牛血清的DMEM培养基继续培养24h后，加入胸腺素β₁₀重组蛋白，使其终浓度分别为0μg/mL、15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL、120μg/mL。继续培养48h后，用MTT法检测细胞的增殖情况。分析结果显示，梅花鹿鹿茸胸腺素β10重组蛋白对成骨细胞M3T3具有明显的促增殖作用，见表1。 

表1梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀重组蛋白对成骨细胞M3T3的影响（n=6） 

注：*P﹤0.001 。