一种可植入的富勒烯聚乳酸自团聚载药缓释微球的制备方法及应用

摘要

本发明涉及可植入的富勒烯聚乳酸自团聚载药缓释微球的制备方法及应用，可有效解决可植入的富勒烯聚乳酸自团聚载药缓释微球的制备及在制备光动力治疗肿瘤药物中的应用问题，其解决的技术方案是，在富勒烯分子上通过化学键连接有聚乳酸，聚乳酸相对分子量为1,0000-1,8000，富勒烯为C

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是一种可植入的富勒烯聚乳酸自团聚载药缓释微球的制备方法及应用。

背景技术

富勒烯（Fullerene），又名C₆₀，是碳元素的第三种同素异形体，是二十世纪重大发现之一。C₆₀具有π电子体系，它可以吸收一定波长的光子能量，由基态变成激发态，激发态的C₆₀与组织内的氧发生作用，催化活性氧的生成和超氧负自由基团，这些产物与肿瘤细胞内的大分子作用，损伤细胞的结构和功能，从而杀伤肿瘤细胞。富勒烯作为光敏剂可用于肿瘤光动力治疗(photodynamic therapy, PDT )治疗。

光动力治疗(photodynamic therapy, PDT )是指给予光敏剂之后，在一定波长的光照射下，才产生治疗作用的一种新兴的治疗方法。PDT 的优势在于能选择性地消灭局部的原发、复发肿瘤却不损伤正常组织, 且可与放疗、化疗同时进行, 发挥一定的协同作用。

聚乳酸(PLA)是一种无毒、无刺激性、具有良好生物相容性的新型高分子材料,是以乳酸为单体经缩聚反应合成的生物可降解高分子材料。它在生物体内经过酶分解,最终形成二氧化碳和水,在医学上有很广泛的应用前景。

C₆₀本身具有强烈的疏水性，难以在生理介质中直接使用，并且通过物理吸附的药物量有限，难以达到治疗的需要量，用水溶性氨基酸对C₆₀表面进行化学修饰合成C₆₀水溶性衍生物，保存了C₆₀的球形结构和光敏性，在此基础上将聚乳酸通过化学键连接在氨基酸上，可制备具有生物降解自团聚功能的富勒烯聚乳酸聚合物。应用富勒烯聚乳酸聚合物可以制备载药满足治疗需要的富勒烯聚乳酸载药微球，增加水溶性药物在体内的滞留时间，提高药物在机体内的稳定性，同时C₆₀本身具有光敏性，因此，富勒烯聚乳酸载药微球不但具有化疗性，同时具有光疗性。那么，如何制备富勒烯聚乳酸自团聚载药缓释微球至今未见有公开报道。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种可植入的富勒烯聚乳酸自团聚载药缓释微球的制备方法及应用，可有效解决可植入的富勒烯聚乳酸自团聚载药缓释微球的制备及在制备光动力治疗肿瘤药物中的应用问题。

 本发明解决的技术方案，在富勒烯分子上通过化学键连接有聚乳酸，聚乳酸相对分子量为1,0000-1,8000，富勒烯为C₆₀富勒烯，微球粒径为1-10μm，由以下步骤实现：

    1）将2.0-4.0g氨基酸和2.0-4.0g氢氧化钠加到40-50mL水和无水乙醇的混合溶剂中，其中水和无水乙醇的体积比为8:30，搅拌均匀，再逐滴加入到60mL的富勒烯甲苯溶液中，其中富勒烯与甲苯的重量比为5:3，在400r/min的转速下，室温下，磁力搅拌反应4-5h，除去上层的甲苯、水和无水乙醇的混合溶液，再经无水乙醇的抽滤洗涤3次，真空干燥24h, 得富勒烯氨基酸衍生物；所述的氨基酸为苯丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、结氨酸中的任意一种；

   2）将富勒烯氨基酸衍生物10-20mg放入容器中，加入乳酸5-10mL，然后加入无水氯化亚锡6-12mg，通入氮气（N₂），室温饱和5-10min，在抽真空环境中，110℃油浴磁力搅拌下预热1h，140-150℃油浴磁力搅拌下反应4-5h，反应结束产物,用二氯甲烷溶解，再用去离子水沉淀，由0.45μm的混合纤维素脂微孔滤膜抽滤，如此重复操作3次，然后冷冻干燥，得富勒烯聚乳酸聚合物；

3）将富勒烯聚乳酸聚合物150-200mg，加入2-3mL二氯甲烷溶液中溶解，加入1-2ml抗肿瘤药物水溶液，涡旋混匀10-15min，逐滴加入40mL甘油中，1200r/min磁力搅拌10min，将微球甘油液加入0.5%的明胶水溶液中，搅拌分散10min，80-120r/min低速下，搅拌2h，4℃放置10min，用0.45μm的混合纤维素脂微孔滤膜抽滤，再用去离子水反复冲洗5-6次，冷冻干燥，得富勒烯聚乳酸自团聚载药缓释微球；所述的抗肿瘤药物为阿霉素、米托蒽醌、五氟尿嘧啶、甲氨蝶呤水溶性抗肿瘤药物中的一种。

本发明方法所制备的富勒烯聚乳酸自团聚载药缓释微球可有效用于制备光动力治疗肿瘤的药物，制备方法简单，制备条件容易满足，并且不会对富勒烯本身的特性进行破坏，有效解决光动力治疗和化疗同时发挥肿瘤治疗作用，是肿瘤治疗药物上的创新。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1

    1）将2.0g氨基酸和2.0g氢氧化钠加到40mL水和无水乙醇的混合溶剂中，其中水和无水乙醇的体积比为8:30，搅拌均匀，再逐滴加入到60mL的富勒烯甲苯溶液中，其中富勒烯与甲苯的重量比为5:3，在400r/min的转速下，室温下，磁力搅拌反应4h，除去上层的甲苯、水和无水乙醇的混合溶液，再经无水乙醇的抽滤洗涤3次，真空干燥24h, 得富勒烯氨基酸衍生物；所述的氨基酸为苯丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、结氨酸中的任意一种；

2）将富勒烯氨基酸衍生物10mg放入容器中，加入乳酸5mL，然后加入无水氯化亚锡6-12mg，通入氮气（N₂），室温饱和5min，在抽真空环境中，110℃油浴磁力搅拌下预热1h，140℃油浴磁力搅拌下反应4h，反应结束产物,用二氯甲烷溶解，再用去离子水沉淀，由0.45μm的混合纤维素脂微孔滤膜抽滤，如此重复操作3次，然后冷冻干燥，得富勒烯聚乳酸聚合物；

3）将富勒烯聚乳酸聚合物150mg，加入2mL二氯甲烷溶液中溶解，加入1ml抗肿瘤药物水溶液，涡旋混匀10min，逐滴加入40mL甘油中，1200r/min磁力搅拌10min，将微球甘油液加入0.5%的明胶水溶液中，搅拌分散10min，80r/min低速下，搅拌2h，4℃放置10min，用0.45μm的混合纤维素脂微孔滤膜抽滤，再用去离子水反复冲洗5次，冷冻干燥，得富勒烯聚乳酸自团聚载药缓释微球；所述的抗肿瘤药物为阿霉素、米托蒽醌、五氟尿嘧啶、甲氨蝶呤水溶性抗肿瘤药物中的一种。

实施例2

    1）将2.5g氨基酸和2.5g氢氧化钠加到42mL水和无水乙醇的混合溶剂中，其中水和无水乙醇的体积比为8:30，搅拌均匀，再逐滴加入到60mL的富勒烯甲苯溶液中，其中富勒烯与甲苯的重量比为5:3，在400r/min的转速下，室温下，磁力搅拌反应4.5h，除去上层的甲苯、水和无水乙醇的混合溶液，再经无水乙醇的抽滤洗涤3次，真空干燥24h, 得富勒烯氨基酸衍生物；所述的氨基酸为苯丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、结氨酸中的任意一种；

   2）将富勒烯氨基酸衍生物13mg放入容器中，加入乳酸6mL，然后加入无水氯化亚锡8mg，通入氮气（N₂），室温饱和6min，在抽真空环境中，110℃油浴磁力搅拌下预热1h，143℃油浴磁力搅拌下反应4.5h，反应结束产物,用二氯甲烷溶解，再用去离子水沉淀，由0.45μm的混合纤维素脂微孔滤膜抽滤，如此重复操作3次，然后冷冻干燥，得富勒烯聚乳酸聚合物；

3）将富勒烯聚乳酸聚合物160mg，加入2mL二氯甲烷溶液中溶解，加入1ml抗肿瘤药物水溶液，涡旋混匀12min，逐滴加入40mL甘油中，1200r/min磁力搅拌10min，将微球甘油液加入0.5%的明胶水溶液中，搅拌分散10min，90r/min低速下，搅拌2h，4℃放置10min，用0.45μm的混合纤维素脂微孔滤膜抽滤，再用去离子水反复冲洗5次，冷冻干燥，得富勒烯聚乳酸自团聚载药缓释微球；所述的抗肿瘤药物为阿霉素、米托蒽醌、五氟尿嘧啶、甲氨蝶呤水溶性抗肿瘤药物中的一种。

实施例3

     1）将3g氨基酸和3g氢氧化钠加到45mL水和无水乙醇的混合溶剂中，其中水和无水乙醇的体积比为8:30，搅拌均匀，再逐滴加入到60mL的富勒烯甲苯溶液中，其中富勒烯与甲苯的重量比为5:3，在400r/min的转速下，室温下，磁力搅拌反应4.5h，除去上层的甲苯、水和无水乙醇的混合溶液，再经无水乙醇的抽滤洗涤3次，真空干燥24h, 得富勒烯氨基酸衍生物；所述的氨基酸为苯丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、结氨酸中的任意一种；

2）将富勒烯氨基酸衍生物15mg放入容器中，加入乳酸8mL，然后加入无水氯化亚锡9mg，通入氮气（N₂），室温饱和8min，在抽真空环境中，110℃油浴磁力搅拌下预热1h，145℃油浴磁力搅拌下反应4.5h，反应结束产物,用二氯甲烷溶解，再用去离子水沉淀，由0.45μm的混合纤维素脂微孔滤膜抽滤，如此重复操作3次，然后冷冻干燥，得富勒烯聚乳酸聚合物；

3）将富勒烯聚乳酸聚合物180mg，加入2.5mL二氯甲烷溶液中溶解，加入1.5ml抗肿瘤药物水溶液，涡旋混匀13min，逐滴加入40mL甘油中，1200r/min磁力搅拌10min，将微球甘油液加入0.5%的明胶水溶液中，搅拌分散10min，100r/min低速下，搅拌2h，4℃放置10min，用0.45μm的混合纤维素脂微孔滤膜抽滤，再用去离子水反复冲洗5次，冷冻干燥，得富勒烯聚乳酸自团聚载药缓释微球；所述的抗肿瘤药物为阿霉素、米托蒽醌、五氟尿嘧啶、甲氨蝶呤水溶性抗肿瘤药物中的一种。

实施例4

    1）将3.5g氨基酸和3.5g氢氧化钠加到47mL水和无水乙醇的混合溶剂中，其中水和无水乙醇的体积比为8:30，搅拌均匀，再逐滴加入到60mL的富勒烯甲苯溶液中，其中富勒烯与甲苯的重量比为5:3，在400r/min的转速下，室温下，磁力搅拌反应5h，除去上层的甲苯、水和无水乙醇的混合溶液，再经无水乙醇的抽滤洗涤3次，真空干燥24h, 得富勒烯氨基酸衍生物；所述的氨基酸为苯丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、结氨酸中的任意一种；

2）将富勒烯氨基酸衍生物18mg放入容器中，加入乳酸9mL，然后加入无水氯化亚锡11mg，通入氮气（N₂），室温饱和9min，在抽真空环境中，110℃油浴磁力搅拌下预热1h，147℃油浴磁力搅拌下反应5h，反应结束产物,用二氯甲烷溶解，再用去离子水沉淀，由0.45μm的混合纤维素脂微孔滤膜抽滤，如此重复操作3次，然后冷冻干燥，得富勒烯聚乳酸聚合物；

3）将富勒烯聚乳酸聚合物190mg，加入2.7mL二氯甲烷溶液中溶解，加入1.8ml抗肿瘤药物水溶液，涡旋混匀14min，逐滴加入40mL甘油中，1200r/min磁力搅拌10min，将微球甘油液加入0.5%的明胶水溶液中，搅拌分散10min，110r/min低速下，搅拌2h，4℃放置10min，用0.45μm的混合纤维素脂微孔滤膜抽滤，再用去离子水反复冲洗6次，冷冻干燥，得富勒烯聚乳酸自团聚载药缓释微球；所述的抗肿瘤药物为阿霉素、米托蒽醌、五氟尿嘧啶、甲氨蝶呤水溶性抗肿瘤药物中的一种。

实施例5

    1）将4.0g氨基酸和4.0g氢氧化钠加到50mL水和无水乙醇的混合溶剂中，其中水和无水乙醇的体积比为8:30，搅拌均匀，再逐滴加入到60mL的富勒烯甲苯溶液中，其中富勒烯与甲苯的重量比为5:3，在400r/min的转速下，室温下，磁力搅拌反应5h，除去上层的甲苯、水和无水乙醇的混合溶液，再经无水乙醇的抽滤洗涤3次，真空干燥24h, 得富勒烯氨基酸衍生物；所述的氨基酸为苯丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、结氨酸中的任意一种；

2）将富勒烯氨基酸衍生物20mg放入容器中，加入乳酸10mL，然后加入无水氯化亚锡12mg，通入氮气（N₂），室温饱和10min，在抽真空环境中，110℃油浴磁力搅拌下预热1h，150℃油浴磁力搅拌下反应5h，反应结束产物,用二氯甲烷溶解，再用去离子水沉淀，由0.45μm的混合纤维素脂微孔滤膜抽滤，如此重复操作3次，然后冷冻干燥，得富勒烯聚乳酸聚合物；

3）将富勒烯聚乳酸聚合物200mg，加入3mL二氯甲烷溶液中溶解，加入2ml抗肿瘤药物水溶液，涡旋混匀15min，逐滴加入40mL甘油中，1200r/min磁力搅拌10min，将微球甘油液加入0.5%的明胶水溶液中，搅拌分散10min，120r/min低速下，搅拌2h，4℃放置10min，用0.45μm的混合纤维素脂微孔滤膜抽滤，再用去离子水反复冲洗6次，冷冻干燥，得富勒烯聚乳酸自团聚载药缓释微球；所述的抗肿瘤药物为阿霉素、米托蒽醌、五氟尿嘧啶、甲氨蝶呤水溶性抗肿瘤药物中的一种。

场发射扫描电镜下观察富勒烯聚乳酸自团聚空白微球粒径在5-10μm. 将富勒烯聚乳酸自团聚空白微球水中分散后，光学显微镜下观察，微球粒径均匀，分散性好，无团聚现象。

上述发明内容部分以及实施例1-5给出的富勒烯聚乳酸自团聚载药缓释微球，具有光敏性，可有效用于制备光动力治疗肿瘤的药物，实现富勒烯聚乳酸自团聚载药缓释微球在制备光动力肿瘤药物中的应用。并经试验取得了有益的技术效果，有关实验资料如下：

    本发明富勒烯聚乳酸自团聚载药缓释微球具有光动力学治疗肿瘤作用，可通过以下试验证明。

 将制得的富勒烯聚乳酸自团聚微球溶分散于0.9%的氯化钠注射液中，原位注射到荷瘤小鼠A肿瘤内，给药后每2天用光源B照射，光照时间30s，每6天给药一次，隔天测量荷瘤小鼠A的肿瘤体积大小。

上述步骤中的荷瘤小鼠A为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血癌，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑癌，小肠癌，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴道癌，睾丸癌，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。

上述步骤1中的光源B为：400-800nm的宽波长光源或者激光中的一种。优选532nm激光。

 本发明富勒烯聚乳酸自团聚微球进行光动力学治疗深部肿瘤时，这些光源不能够穿透照射时，可通过适用部位的照射方法，来改善外部光源的穿透能力进行肿瘤治疗。

本发明富勒烯聚乳酸自团聚空白微球可以制成多种给药途径的药物制剂剂型。比如：静脉注射、肌内注射、瘤内注射、皮下植入等。本发明富勒烯聚乳酸自团聚空白微球可以加入各种制剂的添加剂，例如生理盐水、葡萄糖、冻干保护剂等以便制成合适的剂型需要。

本发明富勒烯聚乳酸聚合物作为药物载体在肿瘤治疗中的应用可通过以下技术方案予以实现：

    将制得的富勒烯聚乳酸自团聚载药微球分散于0.9%的氯化钠注射液中，原位注射到荷瘤小鼠A的瘤内，每6天给药一次，给药后每2天用光源B照射肿瘤部位，光照时间30s，测量荷瘤小鼠A的肿瘤体积大小。

 上述步骤中的荷瘤小鼠A为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血癌，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑癌，小肠癌，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴道癌，睾丸癌，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。

 上述步骤中的光源B为：400-800nm的宽波长光源或者激光中的一种。优选532nm激光。

本发明具有光疗作用及化疗作用在治疗肿瘤中的应用，经过多次试验，均取得良好试验结果，相关实验数据如下：

    光照后，富勒烯聚乳酸自团聚微球体内抗肿瘤活性测定。将B16-F10小鼠黑色素瘤细胞计数后，用生理盐水稀释成2×106个/mL细胞悬液，接种在小黑鼠右侧腹部皮下。接种肿瘤7天后，取其中肿瘤体积>100mm3的小鼠，随机分为8组，每组5只，具体分组如下：1）生理盐水组2）生理盐水光照组3）富勒烯聚乳酸自团聚载药微球光照组4）富勒烯聚乳酸自团聚载药微球。5）富勒烯聚乳酸自团聚空白微球组6）富勒烯聚乳酸自团聚空白微球光照组7）单纯药物组8）单纯药物光照组。8组均采用肿瘤原位注射给药方式，其中光照组使用光源为523nm激光照射，功率为2W，给药后每2天照射肿瘤部位，每次为30s。每6天给药一次，每次注射药物剂量为2.5mg/kg，每次注射100μL，共给药2次。整个实验过程每日观察小鼠生活状态，每2天称小鼠体重并用游标卡尺测量小鼠黑色素瘤的长径（A）与短径（B），计算肿瘤体积.小鼠肿瘤增值率=（给药组第11天瘤体积-给药组第0天瘤体积）/（对照组第11天瘤体积-对照组第0天瘤体积）×100%。

经证实，激光照射后，富勒烯聚乳酸自团聚空白微球组小鼠肿瘤增值率为39.93%，富勒烯聚乳酸自团聚空白微球组，小鼠肿瘤体积的增加得到了明显抑制。非激光照射，富勒烯聚乳酸自团聚空白微球的加入不影响小鼠肿瘤体积的增加，小鼠肿瘤体积增值率100.67%。富勒烯聚乳酸自团聚载药微球光照组小鼠肿瘤体积的增加得到了明显抑制甚至瘤体积明显缩小，小鼠肿瘤增值率为-7.14%。而单纯药物组和单纯药物组光照组均不能明显抑制小鼠肿瘤体积的增加，小鼠肿瘤体积增值率分别为98.17%和87.95%。

 本发明与现有技术相比具有以下突出的有益技术效果：

    1）本发明制备方法简单，制备条件容易满足，物理及化学稳定性好，原料来源丰富，成本低，并且不会对富勒烯本身的特性进行破坏；

2）本发明自团聚成微球后具有光敏性，可用于抗肿瘤光动力学治疗，光照时可发挥抗肿瘤活性，而不光照时，抗肿瘤活性较小；

3）本发明可作为药物载体，有极小的毒性，生物相容性好，具有缓释效果，可植入肿瘤部位给药，延长水溶性药物在瘤部位滞留时间，结合光照可发挥更为优秀的抗肿瘤活性。测试结果表明，本发明制备的富勒烯聚乳酸自团聚载药缓释微球，粒径均匀，冻干后，可以在水溶液中分散均匀，无粘连现象。是治疗肿瘤药物上的创新。