促进成骨的植入物以及诱导骨生长的方法

摘要

本公开描述了一种促进骨生长的植入物，其包括骨传导支架和骨诱导小分子。该骨传导支架还可包括聚合物粘合剂。该植入物还可包括成骨材料以提供活细胞群，以有助于骨修复和重塑。本发明还公开了一种形成促进骨生长的植入物的系统，以及形成本公开的植入物的方法，此外包括治疗使用该植入物的方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年2月25日提交的美国临时专利申请序列号 61/446,706的优先权，其公开内容据此以引用方式并入，如同全文示出于本 文中一样。

技术领域

本公开涉及用于促进骨生长的植入物，其包括骨传导支架和骨诱导小 分子。该植入物还可包括成骨材料。本发明还公开了一种形成植入物的系统 以及利用本公开的植入物进行处理的方法。

背景技术

骨折修复和脊柱融合通常需要生物学刺激骨的生长。由于自体移植已 被证明安全且有效，因此在临床处理上为最合乎期望的选项。自体移植为成 骨性、骨诱导性和骨传导性，并且不具有排斥的风险。然而，自体移植由于 与例如植自患者髂骨相关联的死亡率以及不易取得大量自体移植物而存在许 多问题。因此在临床上仍需要利用基于非自体移植物的骨诱导和成骨治疗选 项。

骨诱导是一种复杂的途径，其涉及重复多层生长因子、激素、干细胞 和造成此过程的其他因子的宿主。当前的生长因子治疗法，例如骨形成蛋白 (BMP)有时需要超生理剂量而导致副作用，并且可能不是最佳解决方 案。骨诱导治疗法在传统上被定义为可刺激原发性骨生长的因子或基质，例 如BMP-2和BMP-7。骨愈合是一种涉及不同细胞以及通过各种细胞信号途 径所控制和管理的生物学过程的多方面密切协调的过程。人类生长因子，例 如BMP，通常驱动这些途径以及给与其在治疗上代表影响骨生长的一种方 式。

然而，相互作用以触发骨生长的广泛途径之下，仍存在超过BMP的骨 诱导性质的潜在技术。

发明内容

本公开涉及一种促进骨生长的植入物，其包括骨传导支架和骨诱导小 分子。该支架可包括自体移植材料、异体移植材料、基于陶瓷的骨替代物、 以及它们的共混物和混合物。骨诱导小分子可选自：皮质类固醇、氧化固 醇、上调细胞内cAMP的化合物、和影响HMG coA还原酶途径的化合物、 以及它们的共混物和混合物。

该植入物还可包括成骨材料。该成骨材料可得自自体来源或异体来源 并且包括自体移植物、自体骨髓抽出物、自体脂肪抽出物、异体骨髓抽出 物、异体脂肪抽出物、以及它们的共混物和混合物。

根据另一个实施例，该骨传导支架为陶瓷骨替代物，例如基于钙-磷酸 盐的化合物，如磷灰石、或磷酸三钙、以及它们的共混物和混合物。根据另 一个实施例，该陶瓷骨替代物为多个具有约0.5mm至约4.0mm的平均粒径 和约20μm至约500μm的平均孔径的多孔颗粒。

根据另一个实施例，该支架还包括聚合物粘合剂。该聚合物粘合剂可 为吸收性聚合物并且可包括例如聚交酯、聚乙交酯、聚内酯、胶原、纤维 素、以及它们的共聚物、共混物和混合物。

根据本公开，该植入物包括骨诱导小分子，该骨诱导小分子来自一组 化合物，例如皮质类固醇、氧化固醇、上调细胞内cAMP的化合物、和影 响HMG coA还原酶途径的化合物。合适的皮质类固醇可包括例如布地奈 德、丙酸氟替卡松、氟米龙、哈西奈德、丙酸氯倍他索、以及它们的共混物 和混合物。根据一个实施例，该骨诱导小分子可与赋形剂结合。合适的赋形 剂可包括例如CremphorDMA、DMSO、NMP、聚乙二醇、丙二醇、PVP、Solutol HSTweenTween以及它们的混合物和衍生物。

根据本公开，提供了一种诱导患者骨生长的方法，其包括在患者内植 入根据本公开的任何实施例的植入物的步骤。

根据另一个实施例，一种形成植入物的方法包括将骨传导支架与骨诱 导小分子组合以形成植入物的步骤。根据另一个实施例，该支架可包括自体 移植材料、异体移植材料、陶瓷骨替代物、以及它们的共混物和混合物；并 且该合成小分子可包括皮质类固醇、氧化固醇、上调细胞内cAMP的化合 物、和影响HMG coA还原酶途径的化合物、以及它们的共混物和混合物。 根据另一个实施例，该方法可包括将成骨材料组合到植入物的步骤。合适的 成骨材料可包括自体移植物、自体骨髓抽出物、自体脂肪抽出物、异体骨髓 抽出物、异体脂肪抽出物、以及它们的共混物和混合物。根据另一个实施 例，该方法还可包括将骨诱导小分子与赋形剂结合的步骤。

本公开还包括形成促进骨生长的植入物的系统，其包括容纳在第一无 菌容器中的骨传导支架、骨诱导小分子、以及容纳在第二无菌容器中的成骨 材料，该第一无菌容器具有适于与第二容器连接的开口，该第二无菌容器具 有适于与第一容器连接的开口，使得成骨材料可从第二容器被传送至第一容 器。根据该系统的一个实施例，该支架可包括自体移植材料、异体移植材 料、陶瓷骨替代物、以及它们的共混物和混合物；该骨诱导小分子可包括皮 质类固醇、氧化固醇、上调细胞内cAMP的化合物、和影响HMG coA还原 酶途径的化合物、以及它们的共混物和混合物；并且该成骨材料可来源于： 自体移植物、自体骨髓抽出物、自体脂肪抽出物、异体骨髓抽出物、异体脂 肪抽出物、以及它们的共混物和混合物。根据该系统的另一个实施例，该骨 诱导材料被包含在第一容器中，并且根据另一个实施例，该骨诱导材料被包 含在第二容器中。

根据该系统的一个实施例，该支架为陶瓷骨替代物，并且在另一个实 施例中，该支架包括聚合物粘合剂。根据另一个实施例，该陶瓷骨替代物为 基于钙-磷酸盐的化合物，例如磷灰石、和磷酸三钙、以及它们的共混物和 混合物，并且在另一个实施例中，该聚合物粘合剂包括聚交酯、聚乙交酯、 聚内酯、胶原、纤维素、以及它们的共聚物、共混物和混合物。

根据该系统的另一个实施例，该骨诱导小分子可包括来自皮质类固醇 的化合物，该皮质类固醇包括布地奈德、丙酸氟替卡松、氟米龙、哈西奈 德、丙酸氯倍他索、以及它们的共混物和混合物。在该系统的另一个实施例 中，该骨诱导小分子可与赋形剂结合。合适的赋形剂可包括例如 CremphorDMA、DMSO、NMP、聚乙二醇、 丙二醇、PVP、Solutol HSTweenTween以及它们的混合物 和衍生物。

附图说明

结合附图进行阅读时，能够更好地理解前述发明内容和以下对本专利 申请的优选实施例的详细说明。然而，应当理解，本专利申请并不局限于所 描述的精确实施例。在附图中：

图1是根据本公开的实施例的两种小诱导分子的剂量反应曲线的图 示；

图2是根据另一个实施例的小分子的相对效力的图示；

图3A-3C是根据一个实施例利用LC/MS测量多种小分子从骨传导支架 的体外定时释放的图示；

图4是根据另一个实施例利用放射性标示来测定小分子从骨传导支架 的体外定时释放的图示；

图5是根据另一个实施例描述小分子从骨传导支架的体内理论释放的 图示；

图6是根据本公开的实施例在ALP测定中对于成骨材料所测量的多种 小分子的测量骨诱导性的图示；

图7是示出根据本公开的实施例在选择的骨诱导小分子的骨传导支架 上接种成骨材料中的ALP RNA表达量的图示；

图8是根据本公开的实施例从骨传导支架的骨诱导小分子体外释放曲 线以及已被放射性标示的相同骨诱导小分子体内释放曲线的图示；

图9是示出根据本公开的实施例的反应在成骨材料中羟基磷灰石 (HA)表达产生的骨诱导小分子的分化潜力的图示；

图10是根据本公开的一个实施例的具有容纳骨传导支架(包括聚合物 粘合剂)的第一容器以及容纳成骨材料的第二容器的植入物系统；

图11是图10的植入物系统，其中该第二容器是连接至第一容器以将 成骨材料从第二容器传送至第一容器；

图12根据图10和11中示出和描述的植入物系统而形成的植入物。

具体实施方式

为了更全面地理解本公开，示出了下列定义：

如本文所用，“骨传导”是指植入的基质允许或促进新骨在其表面上 或在其孔中、通道中或其他内部空隙中生长的过程。当移植材料或移植基质 可用作为用于新骨生长的支架时，其被称为“骨传导的”。在被修复的主骨 的缺损位点处的骨母细胞(成骨细胞)利用植入的移植材料作为骨架，其中 在该骨架上扩散和产生新骨。

如本文所用，“骨诱导”是指刺激骨原细胞分化为成骨细胞、成骨细 胞然后开始形成新骨的过程。当化学和生物组合物可刺激原始、未分化和多 能细胞变为成骨细胞时，所述化学和生物组合物被称为“骨诱导的”。

如本文所用，“骨生成”是当成骨细胞以及骨原细胞、干细胞和其他 类型的能够分化为成熟的成骨细胞而有助于骨移植物植入位点的新骨生长时 发生。如果细胞或细胞群能够分化为成熟的成骨细胞，则该细胞或细胞群被 称为“成骨的”。

如本文所用，“小分子”是指具有相对低的分子量(即低于约800道 尔顿)的有机分子，包括天然存在的和人工合成的。如本文所用，该术语不 包括大于约800道尔顿的天然或合成蛋白，例如天然和重组化人类生长因子 或成形素，如骨成形蛋白。

如本文所用，“EC50”是指术语有效浓度(EC50)，其为在一段特定 暴露时间后，诱导基线与最大值之间的治疗反应中间值的组合物的浓度。因 此，梯度剂量反应曲线的EC50代表观察到其最大效应的50％的化合物的浓 度。

如本文所用，“CC50”是指术语细胞毒性浓度(CC50)，其为在一段 特定暴露时间后，诱导基线与某个最大值之间的细胞毒性中间值的化合物的 浓度。

如本文所用，“治疗指数”(也被称为治疗比)是指组合物产生的治 疗效果的量与其产生的细胞毒性危害的量的比值。定量上，其为通过CC50 除以EC50而给定的比值。较高的治疗指数优于较低的治疗指数：相比于引 发治疗效果所需的剂量，其需要该组合物的较高剂量以达到细胞毒性阈值。

如本文所用，“赋形剂”是指药理学上合适的非活性物质，其与活性 剂例如骨诱导小分子联合使用以帮助或促进活性剂在哺乳动物宿主内的制 备、给药、递送、吸附或吸收。

本公开涉及促进骨生长的植入物，其包括骨传导支架和骨诱导小分 子，并且也可包括具有聚合物粘合剂的骨传导支架。该植入物还可包括成骨 材料。本公开还涉及形成该植入物的方法、以及该植入物的治疗处理和用 途。最后，本公开涉及形成该植入物的系统，其包括骨诱导小分子、容纳骨 传导支架的第一容器以及容纳成骨材料的第二容器，其中该第二容器适于将 成骨材料传送至该第一容器中。

根据本公开的骨传导支架可包括自体移植骨、异体移植骨、以及陶瓷 骨替代物。自体移植骨可取自例如髂骨之类的骨。自体移植骨由于其来自患 者本体而较不易发生排斥的风险。此外，自体移植骨除了具有骨传导性之 外，还可提供骨诱导性和成骨性。具有高固体骨含量的自体移植骨支架相比 于包含较低固体含量骨含量的自体移植骨具有较高的骨传导潜力。异体骨支 架提供与自体移植骨相同的骨传导性。异体支架可得自尸体样本，例如取自 组织库。

根据一个实施例，该骨传导支架包括陶瓷骨替代物。该陶瓷骨替代物 可为多孔或无孔的。术语“多孔”包括但不限于大孔隙度(平均孔径大于或 等于100um)、中孔隙度(平均孔径小于100um但大于或等于10um)和微 孔隙度(平均孔径小于10um)。该孔可为任何大小、形状或分布、或在预 定的公差内。此外，孔可为互连或非互连的。在一个实施例中，孔径大小可 在至多约750um的范围内。在另一个实施例中，孔大小在至多约500um的 范围内，其中大约75％的孔大小为至少100um并且其余的25％的孔大小为 不超过10um。

在一个实施例中，该陶瓷骨替代物包括基于磷酸钙的化合物。磷酸钙 的合适的例子包括非晶态磷酸钙、结晶磷酸钙、或它们的任何组合。例如， 磷酸钙化合物可为磷灰石。磷灰石是一组磷酸钙矿物，通常是指羟基磷灰石 Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂、氟磷灰石Ca₁₀(PO₄)₆(F)₂、氯磷灰石Ca₁₀(PO₄)₆(Cl)₂和溴磷 灰石Ca₁₀(PO₄)₆(Br)₂，并且还可包括硅酸盐(SiO₄^4-)和碳酸盐(CO₃^2-)取代的羟 基磷灰石，其中该取代是针对一个或多个羟基和/或磷酸盐基团。在另一个 实施例中，陶瓷骨替代物包括β-三磷酸钙Ca₃(PO₄)₂(b-TCP)。

该骨传导支架可为用于待修复的特定骨缺陷的期望的任何形状。根据 一个实施例，该支架为单一组合物，其可为多孔或无孔的。合适的形状可包 括例如球形、立方体、楔形、长方形、圆柱形、或它们的组合。在另一个实 施例中，该骨传导支架可为多个多孔或无孔的颗粒。该骨传导支架的比表面 积可变化。例如，当该支架为多孔颗粒时，该比表面积可在约0.1m²/g至约 100m²/g的范围内。

该骨传导支架可为任何大小或形状的陶瓷骨替代物粒子或颗粒。该颗 粒可通过碾磨或球磨钙化合物至期望的粒度或粒径而获得。在一个实施例 中，该颗粒的平均直径在约0.05mm至约10mm的范围内。在另一个实施例 中，该颗粒的平均直径在约0.075mm至约5mm的范围内。在另一个实施例 中，该颗粒的平均直径在约0.075mm至约1mm的范围内。在另一个实施例 中，该颗粒的平均直径在约1.4mm至约2.8mm的范围内。在另一个实施例 中，该颗粒的平均直径在约2.8mm至约5.6mm的范围内。在另一个实施例 中，该颗粒的平均直径在约0.1mm至约0.750mm的范围内。

根据本公开的另一个实施例，该骨传导支架还可与聚合物粘合剂结 合，使得该植入物可被成形为例如可根据需要成型以适应待修复的骨的区域 的可模塑的或柔韧的植入物。

该聚合物粘合剂可包含聚合物例如均聚物和共聚物(即，包括两个或 更多个单体单元的聚合物)、以及聚合物和共聚物的共混物、混合物和组 合。该聚合物可为吸收性聚合物、非吸收性聚合物、或它们的组合。在一个 实施例中，该聚合物粘合剂包含吸收性聚合物，并且该聚合物粘合剂基本上 不含非吸收性聚合物。根据一个实施例，该聚合物粘合剂在体内具有吸收性 并且包含吸收性聚合物。聚合物粘合剂的一种或多种聚合物还可包括合成聚 合物、非合成聚合物(即，得自植物或动物的聚合物)、或它们的组合。

用于制备该聚合物粘合剂的合适的聚合物包括但不限于选自下列单体 的均聚物或共聚物：L-丙交酯；L-乳酸；D-丙交酯；D-乳酸；乙交酯；α-羟 基丁酸；α-羟基戊酸；α-羟基乙酸；α-羟基己酸；α-羟基庚酸；α-羟基癸 酸；α-羟基肉豆蔻酸；α-羟基辛酸；α-羟基硬脂酸；羟基丁酸酯；羟基戊酸 乙酯；β-丙交酯；β-丙乳酸；γ-己内酯；β-己内酯；ε-己内酯；γ-丁内酯；新 戊内酯；四甲基乙交酯；四甲基乙醇酸；二甲基乙醇酸；三亚甲基碳酸酯； 对二氧环己酮；形成液晶聚合物的那些单体；形成纤维素的那些单体；形成 醋酸纤维素的那些单体；形成羧甲基纤维素的那些单体；形成羟丙基甲基纤 维素的那些单体；聚氨酯前体，包括选自下列的多元醇：聚己内酯、聚(环 氧乙烷)、聚(乙二醇)、聚(乙二醇己二酸)、聚(环氧丁烷)、以及它们的混合 物；异氰酸酯-官能化合物，其选自六亚甲基二异氰酸酯、异佛乐酮二异氰 酸酯、环己烷二异氰酸酯、氢化二苯基甲基二异氰酸酯、以及它们的混合 物；以及增链剂，其选自乙二胺、1，4-丁二醇、1，2-丁二醇、2-氨基-1-丁 醇、硫代二乙二醇、2-巯基乙醚、3-己炔-2，5-二醇、柠檬酸、体积它们的混 合物；以及前述两种或更多种的任何组合。

在一个实施例中，该聚合物粘合剂包括吸收性聚合物。吸收性聚合物 的合适的例子包括例如衍生自选自下列的单体的聚合物：L-乳酸、D-乳酸、 L-丙交酯、D-丙交酯、D，L-丙交酯、乙交酯、内酯、内酰胺、ε-己内酯、三 亚甲基碳酸酯、环状碳酸酯、环状醚、对-二氧杂环己烷、β-羟基丁酸、β- 羟基丙酸、β-羟基戊酸、多糖、胶原、血纤维蛋白、白蛋白、以及前述两种 或更多种的任何组合。

在另一个实施例中，该聚合物粘合剂包括吸收性合成聚合物。吸收性 合成聚合物的非限制性例子包括例如聚(L-丙交酯)(共)聚合物、聚(D，L-丙交 酯)(共)聚合物、聚乙交酯(共)聚合物、聚己内酯(共)聚合物、聚(四甲基乙醇 酸)(共)聚合物、聚对二氧环己酮(共)聚合物、聚羟基丁酸酯(共)聚合物、聚 羟基戊酸酯(共)聚合物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、聚(乙交酯-共-三亚 甲基碳酸酯)共聚物、聚(乙交酯-共-己内酯)共聚物、聚(乙交酯-共-二氧杂环 己烷-共-三亚甲基碳酸酯)共聚物、聚(四甲基乙醇酸-共-二氧杂环己烷-共-三 亚甲基碳酸酯)共聚物、聚(乙交酯-共-己内酯-共-L-丙交酯-共-三亚甲基碳酸 酯)共聚物、聚(丙交酯-共-己内酯)共聚物、聚(羟基丁酸酯-共-羟基戊酸酯)共 聚物、液晶(共)聚合物、以及它们的组合、或它们的共聚物。

根据本公开的一个实施例，其中该骨传导支架为陶瓷骨替代物，例如 磷灰石或b-TCP，用于该聚合物粘合剂的合适的聚合物可包括例如聚交酯、 聚乙交酯、基于纤维素的聚合物、聚内酯、以及基于胶原的聚合物、以及它 们的共混物和共聚物。根据另一个实施例，该骨传导支架为可模塑的植入 物，其包含与聚-ε己内酯结合的多个多孔b-TCP颗粒，如美国公开专利申 请2008/0003255中所述，该专利申请的公开内容全文以引用方式并入本 文。根据本公开的另一个实施例，该骨传导支架为柔韧的带，其包含一层多 孔b-TCP颗粒以及一层或多层吸收性聚合物，如美国公开专利申请 2006/0008504中所述，该专利申请的公开内容全文以引用方式并入本文。根 据另一个实施例，该骨传导支架为可模塑的植入物，其包括与胶原结合的多 个多孔b-TCP颗粒，该胶原在被液体重建成可模塑形式之前可被冷冻干燥 成刚性形式。

当该聚合物粘合剂包含吸收性聚合物时，包含有它们的骨传导支架趋 于表现出1个月至约2.5年例如约2个月至约2年的完全的体内或体外吸收 性。

如在前所述，该植入物包含骨诱导小分子。该骨诱导小分子可包括组 合物，该组合物包含皮质类固醇、氧化固醇、影响HMG coA还原酶途径的 化合物、以及上调细胞内cAMP的化合物。骨诱导小分子的合适的例子列 出于下表1中。根据一个实施例，骨诱导小分子的合适的例子包括皮质类固 醇，例如布地奈德、丙酸氟替卡松、氟米龙、哈西奈德、丙酸氯倍他索、以 及它们的共混物和混合物。

该骨诱导小分子还可根据需要结合有一种或多种赋形剂。配药学上可 接受的赋形剂在本领域中是已知的并且包括例如溶剂和稀释剂(例如乙醇、 丙二醇、二甲基乙酰胺、DMSO、二甲基异山梨醇、甲基吡咯烷酮)、增溶 剂(Cremophors(R))抗氧化剂(例如生育酚(维生素E)、抗坏血酸对羟 基苯甲酸甲酯、丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、以及 没食子酸丙酯)、表面活性剂和乳化剂(例如聚山梨醇酯(TWEEN 20、 TWEEN 40、TWEEN 80)、普郎尼克类(pluronics)、辛酸癸酸聚乙二醇 甘油酯(labrasol)、脂质(例如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆 蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、填料(例如 甘露糖醇、聚乙烯吡咯烷酮)、有机酸(例如柠檬酸、乳酸、苯甲酸)、亲 水性聚合物(例如聚乙二醇(PEG 300、PEG 400)、络合剂(例如烟酰 胺、烟酸、肌酸、环糊精)、以及防腐剂(例如苄醇)。根据一个实施例， 该赋形剂可选自CremphorDMA、DMSO、NMP、聚乙二醇、丙二醇、PVP、Solutol HSTweenTween以及它们的混合物和衍生物。

根据本公开，该骨诱导小分子可在手术前以及手术期间支架与支架结 合。当该骨诱导小分子在手术前被结合时，该小分子可在制造过程的一部分 中(其中该小分子在缓冲液中被涂覆至支架)与支架结合，然后被冷冻干燥 或风干。该小分子也可通过喷雾干燥或其他涂覆方法来施加。然后，将该植 入物包装和杀菌。当该骨诱导小分子在手术期间与支架结合时，该支架可被 浸入或涂覆有包含骨诱导小分子的缓冲液，然后被施加至待修复的骨位点。

根据本公开的另一个实施例，该植入物还可包括成骨材料以向骨修复 位点提供活细胞群。该成骨材料可得自自体来源以及异体来源，例如尸体来 源或组织库。合适的成骨材料可包括例如存活的细胞源例如干细胞、多潜能 细胞、多能细胞、骨原细胞、前成骨细胞、成熟的成骨细胞、以及它们的共 混物和混合物。根据一个实施例，成骨材料得自自体和/或异体人类骨髓， 并且根据另一个实施例，该成骨材料得自自体和/或异体人类脂肪抽出物。 可通过例如过滤、分离和/或浓缩方法来处理该骨髓和脂肪抽出物以进一步 增强期望的细胞群。为了保存该成骨材料的细胞群的活性，该成骨材料通常 在或接近植入过程中而与骨传导支架和骨诱导材料结合。

参见图10-12，用于形成植入物30的系统20包括容纳在第一无菌容器 40中的骨传导支架45以及容纳在第二无菌容器50中的成骨材料55，该第 一无菌容器具有开口48，该第二无菌容器具有开口58。第二容器开口58适 于与第一容器开口48连接，使得成骨材料55可经由第一开口48与第二开 口58的连接部而从第二容器50被传送至第一容器40。系统20包含骨诱导 小分子，该骨诱导小分子可处于第一容器40中并且其可按例如在前述的方 式而已与支架45结合。该骨诱导小分子也可被包含在第二容器50的成骨材 料55内。该骨诱导小分子也可在成骨材料55被传送至第一容器45并与支 架45结合后而与支架45结合。该骨诱导小分子也可被容纳在具有开口的第 三容器(未示出)，该第三容器的开口适于与第一容器开口连接，使得骨诱 导小分子可从第三容器被传送至第一容器中并且与支架结合。

支架45还可包括聚合物粘合剂，该聚合物粘合剂根据期望的聚合物或 选择的聚合物来向植入物30赋予可塑性和/或柔韧度。由系统20形成的可 模塑的植入物30示出于图12中，其包括b-TCP多孔颗粒和胶原聚合物的支 架45，该支架具有吸附于其表面上的干燥的骨诱导小分子和自体骨髓抽出 物的成骨材料55。作为另外一种选择，该骨诱导小分子可在将成骨材料55 传送至支架45之前或之后的手术期间与支架45结合。植入物30可在利用 支架45来注入成骨材料55时被模塑。

实例

实例1

体外候选物筛选和暴露曲线分析：

利用碱性磷酸酶(ALP)测定在人类初级骨髓间充质干细胞(MSC) 中筛选来自多类小分子化合物的样本的骨诱导潜力，所述样本包括皮质类固 醇、糖皮质素、氧化固醇、影响HMG coA还原酶途径的化合物、和上调细 胞内cAMP的化合物。使用DNA标准化ALP反应作为细胞数的函数而在多 孔板格式剂量范围内筛选样本化合物。这些剂量反应曲线使得能够确定 EC50以测量化合物之间的成骨反应的相对效力。图1是代表两种受测皮质 类固醇化合物，丙酸氯倍他索和地塞米松的剂量反应曲线。除了功能性分析 之外，某些经鉴定的化合物进行体外L929细胞毒性试验以测定CC50。因 此，首先评估化合物的效力，随后测定其细胞毒性，结果示于下面表1中。

表1

  OI测定(ALP)   细胞毒性(CTG)   EC50(nM)   CC50(uM) 氧化固醇       22(S)-羟基胆固醇 ＞12000     22(r)-羟基胆固醇 785   ＞12 20a-羟基胆固醇 ＞12000   ＞12 25-羟基胆固醇 ＞12000     19-羟基胆固醇       类固醇       倍他米松 1.96     醋酸氟氩可的松 4.12     布地奈德 0.296   ＞30 丙酸氟替卡松 0.0065   ＞1 地塞米松 0.95   ＞50 氟米龙 0.319   ＞5 哈西奈德 0.235   ＞10 氟氢缩松 1.56     丙酸氯倍他索 0.012   ＞30 二乙酸二氟拉松 1.38     曲安西龙 4.13     醛固酮98％ 287     地夫可特 9.85     细胞内cAMP上调剂       己酮可可碱(Trental) ＞10000     双嘧达莫 306   ＞30 双嘧达莫 ＞10000     3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX) ＞10000     丙戊茶碱 ＞10000     dbcAMP ＞10000     HMG Co-A还原酶调节剂       萨拉哥酸A 715   ＞30 β-谷甾醇 ＞12000     bm 15766硫酸盐 ＞10000     三苯乙醇 ＞10000     膦胺霉素 ＞10000     GGTI-286 ＞12000     棒曲霉素 ＞10000     FTI-277三氟乙酸盐 ＞12000    

实例2

相对效力：

该技术的一部分可能涉及利用骨诱导小分子化合物来涂覆骨传导支 架，从而在支架被植入时局部地递送该化合物。因此，测定用于将该化合物 保持在该位点以影响成骨效果所需的最佳时间和浓度曲线。最初，通过观察 暴露6天以判定效力。为了更好地理解最佳暴露曲线，在开始时的1小时至 4天以一系列剂量范围的暴露时间来处理MSC，其后移除经化合物处理的 介质并且将使细胞在基础介质条件下继续完成测定。这允许在短的暴露期间 测定化合物的相对效力并且提供达到期望成骨效果所需的释放要求的指示。

下表2列举了选择的化合物的相对效力的结果，其在1小时、4小时、 24小时和72小时的指定时间框架内进行测试，以及该选择的化合物达到 ALP测定对照物(10nM地塞米松(6天))完全反应的时间范围。图2是 代表基于表2所示结果的皮质类固醇、丙酸氟替卡松的相对效力图。

表2

NC：未计算

--：未测定

实例3

体外释放动力学

在涂覆溶液(乙醇)以及在含水释放介质中测定表1中鉴定的选择的 小分子化合物的溶解度。将小分子化合物溶解在乙醇中并且以其最大乙醇溶 解度添加至支架并风干。支架I由多孔b-TCP颗粒和吸收性聚(丙交酯-共-e- 己内酯)制成，采用柔韧带(ChronOS带，产品编号：07.801.100.99S，可从 Synthes Spine(West Chester，PA)商购获得)的形式。支架II由已被冷冻干 燥成刚性块的多孔b-TCP颗粒和胶原聚合物制成。涂覆有小分子化合物的 支架在如下条件下被放置在细胞培养基内：其中该小分子的浓度将低于其溶 解度即使所有小分子均被释放出来(漏槽状态)，并且通过液相色谱-质谱 仪(LC/MS)或通过测量放射标定含量来监测。该分析能够提供小分子化合物 随时间变化从支架被释放的累积释放百分数。图3A-3C是利用LC/MS测量 小分子丙酸氯倍他索、哈西奈德和丙酸氟替卡松分别从支架I释放的体外定 时释放曲线的图示。图4是使用放射标定含量测量小分子丙酸氯倍他索从支 架II释放的体外定时释放曲线的图示。

实例4

生物测定

一旦鉴定出所需暴露曲线和对应的释放动力学时，分析和结合这两组 资料以测定从支架I直接释放的选择的小分子化合物的时间-浓度曲线是否 在成骨材料(MSC)中具有如溶液中的相同小分子化合物诱导相同的成骨 效果的潜力。基于前述暴露和释放曲线数据来测定涂覆浓度。图5是如由在 前所述的数据组测定的从支架I释放的小分子化合物的理论暴露浓度的图 示。将选择的小分子化合物涂覆到支架I上并允许其释放到细胞培养基中。 在图5中指定每个选择的时间点，移除该培养液并用新鲜的培养液进行更 换。该移除的培养液被转移至培养基内的MSC并且该MSC暴露于培养基 直至下一时间点，此时培养液从MSC被移除并且在该时间点重复从支架I 移除该培养液的过程。在全部六天实验之后，利用ALP测定对MSC进行分 析。来自该实验的结果证明全部受测小分子化合物已被吸收到该支架上并从 支架被释放，证明该小分子化合物是骨传导性的，证明它们以足以诱导由与 其接触的MSC细胞群显示的成果反应的浓度曲线被释放。图6是ALP检测 结果的图示，所述ALP测定结果显示各个受测小分子化合物诱导的成骨反 应大于基础水平。

实例5

体外三维功效

通过将MSC接种到三维b-TCP聚合物复合材料支架、支架I(其在接 种前已涂覆有选择的化合物)上而在体外测定选择的小分子化合物的骨诱导 潜力。将这些细胞培养一段时间，其后测定它们的碱性磷酸酶(ALP)RNA 含量，这是一种成骨分化的早期标识。图7是示出MSC中的ALP RNA表 达量的图示，该ALP RNA表达量被表现为超过基础条件(标准培养环境) 的倍数增加。在该例子中，将地塞米松(用于测定的对照物)添加至溶液中 的培养基，而在所有其他情况下，化合物被预涂覆到支架I上，接着添加 MSC。然后，将细胞培养三天并且通过ALP RNA表达来测定它们的成骨反 应水平。氟替卡松、氯倍他索和哈西奈德全部显著地上调MSC的成骨分化 反应。

实例6

体内释放分析

与体外设定相比，体内设定环境更加复杂并且可能包括炎症反应、有 限血流供应和瞬时细胞群。因此，验证体外数据对于体内环境的适用性是关 键的。为此，该支架I分别被涂覆有两种化合物，20S-羟基胆固醇和3H-丙 酸氯倍他索(放射标记的)，并且被植入兔桡骨骨缺损模型中。在植入后 1、4和24小时，分别地外植周围肌肉组织和支架，并测定药物含量。图8 是与在前测量的体外释放曲线一起绘制的丙酸氯倍他索的体内释放曲线的图 示。

实例7

体内实验

在兔桡骨缺损模型中对两种小分子化合物，地塞米松和20S-羟基胆固 醇，进行评估。在手术期间，用该化合物来涂覆支架I，使其与自体骨髓结 合，并且植入15mm的兔桡骨缺损处。在手术后3和6周时摄取X射线图 像，其后牺牲该动物并通过微CT来分析外植体。在手术后3周，20S-羟基 胆固醇的X射线图像显示具有增强的骨膜反应，但在6周时放射性样本之 间没有统计意义上的显著性差异。

实例8

矿化测定

通过检查MSC和成骨细胞中的羟基磷灰石(HA)的产生来进行测定 以测量氯倍他索的诱导分化潜力。将冷冻的MSC和成骨细胞(Lonza)解 冻并使其生长至80％区集度，然后以大约8000细胞/孔在96孔平板内继代 5-7次(用于MSC)和2-10次(成骨细胞)，并且放置隔夜。完全吸除全 部的平板的培养液。将指定孔以150uL的下列之一来更换：

基础-(MSC/7.5mMβ-甘油磷酸盐(BGP)和抗坏血酸)或(成骨细胞 /7.5mM BGP)；

矿化对照-(成骨细胞/7.5mM BGP和400nM氢化可的松)或 (MSC/7.5mM BGP，100nM地塞米松和抗坏血酸)；或

氯倍他索受试试剂-(成骨细胞/7.5mM BGP+氯倍他索)、或 (MSC/7.5mM BGP、抗坏血酸+氯倍他索)。

以下列浓度测定氯倍他索：0.03nM、0.1nM、0.3nM、1nM、3nM和 10nM。每隔3-4天更换全部培养液，直至地14天为止。

使用OsteoImage套件(Lonza)和Hoechst染色/提取液进行处理后分 析。使用OsteoImage测定方案产生HA数据并且使用Hoechst测定产生 DNA数据。由该数据分析产生HA/DNA值并且将该值绘图示出于图9中。

实例9

以不同的pH值进行的赋形剂测试

这些实验的目标为增加该化合物的溶解度，使得增加的剂量可被添加 到材料支架。在一组实验中，利用一系列赋形剂以三种不同的pH值来评估 丙酸氯倍他索和丙酸氟替卡松的溶解度。制备在pH值3(低)和pH值7 (中)下的磷酸盐缓冲溶液，并且制备在pH值9(高)下的三羟甲基氨基 甲烷缓冲溶液。在给定赋形剂存在下的该化合物的溶解度在各个pH值下测 量为高于无赋形剂存在时的该化合物的溶解度的倍数增加。关于丙酸氯倍他 索结合赋形剂的溶解度的数据列于下面表3中。关于丙酸氟替卡松结合赋形 剂的溶解度的数据列于下面表4中。

表3(丙酸氯倍他索)

赋形剂 pH(低) pH(中) pH(高) Captisol 56.19 48.78 22.45 Cremophor_EL 2.40 5.00 2.30

二甲基异山梨醇 24.82 26.92 27.03 DMA 4.10 2.31 4.92 DMSO 1.88 1.41 2.77 Labrasol 3.17 0.44 0.85 NMP 6.39 5.87 6.01 PEG400 18.51 17.75 22.58 丙二醇 35.43 24.24 25.65 PVP 7.71 3.93 8.46 Solutol_HS_15 13.11 6.96 6.42 Tweens 32.52 19.94 23.32

表4(丙酸氟替卡松)

赋形剂 pH(低) pH(中) pH(高) Captisol 55.01 80.81 67.60 Cremophor_EL 94.00 138.82 89.92 二甲基异山梨醇 4.14 5.78 5.01 DMA 6.67 8.41 7.07 DMSO 1.79 1.96 1.84 Labrasol 54.03 85.96 79.23 NMP 6.39 9.02 7.96 PEG400 3.22 4.32 3.55 丙二醇 5.63 7.89 5.90 PVP 2.21 3.98 2.73 Solutol_HS_15 3.82 5.00 4.47 Tweens 194.37 272.98 231.06

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