基于绵羊毛囊特异表达基因的启动子分离及鉴定

摘要

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及到绵羊毛囊特异表达基因的启动子的分离及鉴定。从绵羊基因组中分离并鉴定出一段具有毛囊组织表达特异性基因的上游调控序列，即启动子区片段，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。利用克隆得到的启动子片段构建了sKAP13.1p-GFP真核表达载体，在启动子后插入了ZsGreen1绿荧光报告基因，并将构建好的载体利用原核显微注射的方法整合到转基因小鼠基因组中。在分子水平和个体水平上对该启动子在毛囊表达的特异性进行了鉴定，为验证启动子的特异性提供了可靠的方法，也为应用基因工程技术改良羊毛品质提供了重要的功能元件。

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程和分子生物学技术领域，具体涉及到一种绵羊毛囊特异表达基 因的启动子分离及鉴定。该启动子属于绵羊毛囊特异表达基因上游调控序列，本发明通过分 离、鉴定出该启动子的特异性，获得了一个调控基因在毛囊组织中表达的启动子资源。

背景技术

上游调控序列是一段位于转录起始位点上游控制基因表达的DNA片段，而启动子是其 中的重要组成部分。启动子是位于基因转录起始位点上游，与RNA聚合酶特异性结合调控转 录起始的一段DNA序列，它通过与反式作用因子共同协调作用完成对基因的表达调控。真 核生物的转录，根据结合RNA聚合酶的种类不同分为三种类型：I型，II型，III型。I型和 II型启动子通常位于转录起始位点的上游，而III型启动子有部分可能位于转录起始位点下游。 而启动子根据其驱动基因表达的方式不同，可以分为组成型启动子，诱导型启动子和组织特 异性启动子。组成型启动诱导的基因在各个组织中的表达水平一致，不具有时间和空间特异 性，也不受外界影响，具有稳定性，因而也被称为非特异性表达启动子。诱导型启动子在一 般情况下诱导基因表达量较低或不能启动基因表达，只在特定的外界刺激之下，比如物理或 者化学信号的刺激，使得目的基因的表达量提高，因而它们通常也具有与特定物理或者化学 信号相结合的元件。组织特异型启动子也称为器官特异型启动子，在它的诱导下，外源基因 只在特定的组织或者器官中表达，通常也表现出发育调节的特性。因而，组织特异型启动子 具有使引入的外源基因仅在需要的器官和组织中特异表达的优点，克服了非特异性启动子造 成的浪费，对于基因工程有着重要的作用。

早期已经有利用组成型启动子研究外源基因表达的例子，例如启动子CMV和SV40，但 是组成型启动子会驱动外源基因在动物各个组织中广泛表达，产生的大量异源蛋白可能会影 响生物体其他组织的生长的发育，并且，重复使用同一种启动子启动两个以上的外源基因时， 可能引起基因沉默的现象。而组织特异型启动子就可以很好的解决这一问题，能控制外源基 因在特定的组织或者器官中表达，而不影响其他组织。因此，组织特异性启动子元件的克隆 与鉴定对有效地利用转基因技术有重要意义。

本发明以藏绵羊（Ovis aries）为研究材料，绵羊是具有多种用途的家畜，主要有毛用和 肉用两个方面的经济价值，而羊毛作为毛纺织工业的基础，畜牧业的重要产业之一，具有重 要的经济价值。基因工程和分子生物学技术是进行羊毛的品质改良，提高羊的经济价值的重 要手段。

本发明针对目前绵羊毛囊组织特性型启动子数量少，特异性不高的问题，分离克隆了绵 羊毛囊特异表达基因上游调控序列，对其启动子的活性和特异性进行检测，为利用基因工程 手段定向改良羊毛品质提供了基础。

发明内容

本发明的目的在于分离和克隆绵羊毛囊特异表达基因的上游调控序列，并对获得的启动 子进行活性验证，同时，通过构建绿荧光表达载体及制备转基因小鼠的方式对启动子的特性 进行鉴定，为定向改良绵羊羊毛的品质提供高特异性的启动子资源。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人通过克隆技术从藏绵羊毛囊特异表达基因KRTAP13.1中得到绵羊毛囊特异性表达启 动子sKAP13.1p，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：9所示。

本发明的具体步骤是：

1.毛囊特异表达基因的鉴定：采集藏绵羊的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、小 肠、大肠、瘤胃、皱胃、脂肪、淋巴（肠系膜）、毛囊、皮肤、睾丸、卵巢共16种组织样， 并提取这些组织的总RNA。然后用反转录PCR（RT-PCR）的方法验证候选基因KRTAP13.1 在各个组织中的表达情况。结果显示KRTAP13.1只在毛囊和皮肤中有表达，而通过原位杂交 和荧光定量PCR（q-PCR）的方法做进一步验证发现，KRTAP13.1基因只在毛干中表达，是 一种毛囊特异表达基因。

2.毛囊特异表达基因上游调控序列克隆及表达载体构建：通过设计特异性引物，从藏绵 羊基因组上扩增得到6938bp大小的上游调控序列区域片段，命名为sKAP13.1p。并将克隆的 该区域片段连接入无启动子的pZsGreen1-1绿荧光蛋白报告载体的启动子区域中，将构建好 的载体命名为sKAP13.1p-GFP。

3.启动子表达模式的验证：利用原核显微注射的方法制备转基因小鼠，将线性化的 sKAP13.1p-GFP载体序列整合到转基因小鼠基因组中。待阳性小鼠4周龄时，采集小鼠的心、 肝、脾、肺、肾、肌肉、肠、胃、脑、皮肤、舌、毛发、睾丸共13个组织，提取其总RNA。 经表型观察及RT-PCR验证绿荧光蛋白基因只在小鼠的毛发中表达，证明上游调控序列 sKAP13.1p在哺乳动物体内具有启动子活性，且为毛囊组织特异性表达启动子。

本发明的优点在于：

（1）本发明分离克隆了藏绵羊毛囊特异表达基因KRTAP13.1上游调控序列片段 sKAP13.1p，分别在分子水平和个体水平上对其活性和特异性进行了鉴定，为验证启动子的活 性和特异性提供了可靠的方法。

（2）本发明所构建的藏绵羊毛囊特异表达启动子sKAP13.1p-GFP载体，可进一步用于 启动其他外源基因在毛囊中表达的功能研究，为应用基因工程技术改良羊毛品质提供了重要 的功能元件。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1和2是应用实施例中用于扩增藏绵羊KRTAP13.1基因部分核苷酸序列 的引物。

序列表SEQ ID NO：3是应用实施例中扩增的藏绵羊KRTAP13.1基因的部分核苷酸序列。序 列长度为133bp，该序列为鉴定KRTAP13.1组织表达谱的序列。

序列表SEQ ID NO：4和5是应用实施例中用于扩增本发明命名的藏绵羊sKAP13.1p上游调 控序列的引物序列。

序列表SEQ ID NO：6和7是应用实施例中用于扩增本发明命名的藏绵羊sKAP13.1p启动子 的部分核苷酸序列的引物序列。

序列表SEQ ID NO：8是应用实施例中扩增的本发明命名的藏绵羊sKAP11.1p启动子的部分 核苷酸序列。序列长度为800bp，该序列为检测KRTAP13.1-ZsGreen1-1阳性质粒的序列。

序列表SEQ ID NO：9是应用实施例中扩增的本发明命名的藏绵羊sKAP13.1p启动子的核苷 酸序列。序列长度为6956bp。

图1：藏绵羊KRTAP13.1基因在藏绵羊各组织中的表达情况。图中：泳道1-16依次为组织毛 囊、皮肤（含毛囊）、心、肝、脾、肺、肾、瘤胃、皱胃、小肠、大肠、淋巴（肠系膜）、脂 肪、肌肉、睾丸、卵巢；泳道17为无模板阴性对照。第1行为KRTAP13.1扩增结果，第2 行为内参基因18S扩增结果。如图所示，KRTAP13.1只在毛囊及皮肤（含毛囊）样品中具有 扩增条带，说明KRTAP13.1在所检测的组织中，只在毛囊和皮肤（含毛囊）中表达。

图2：藏绵羊KRTAP13.1基因在藏绵羊皮肤和毛囊中的q-PCR结果。如图所示，该基因在 毛囊中的表达量要明显高于在皮肤（包含毛囊）中的表达量。

图3：藏绵羊KRTAP13.1基因在藏绵羊皮肤中的原位杂交结果。箭头（黑色）所指的区域为 探针杂交信号。如图所示，红色的探针信号存在于藏绵羊毛干之中，说明藏绵羊KRTAP13.1 为毛囊特异表达基因。

图4：sKAP13.1p扩增片段。图中：泳道M为DNA分子量标准DL10000；泳道1为sKAP13.1p 扩增片段。

图5：是pZsGreen1-1空载体、pZsGreen1-1空载体上多克隆位点的序列、sKAP13.1p-GFP 启动子表达载体构造示意图。在图5中：图5A为pZsGreen1-1空载体；图5B为pZsGreen1-1 空载体上多克隆位点的序列；图5C为sKAP13.1p-GFP启动子表达载体构造示意图。本发明 构建的载体sKAP13.1p-GFP为真核表达载体，由启动子sKAP13.1p连接绿荧光报告基因 ZsGreen1构成而成。该载体具有卡那霉素和新霉素抗性。

图6：利用荧光显微镜sKAP13.1p-GFP转基因阳性小鼠上剪下的毛发的观察得到的荧光图 像，可依次观察到转基因阳性小鼠的毛发发出绿色荧光图像。

具体实施方式

实施例1：藏绵羊毛囊特异表达基因KRTAP13.1组织表达谱验证

本实施例所用试剂及仪器包括：动物组织总RNA提取试剂盒购买于天根生化科技有限公 司（货号：DP431）；RNase-Free ddH2O购买于天根生化科技（北京）有限公司（货号：RT121）； 反转录反应使用宝生物工程大连有限公司的“PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser” 试剂盒（货号：DRR047S），PCR反应使用宝生物工程大连有限公司的Premix Taq^TMHot Start  Version（货号：DR028C）；DEPC（焦碳酸二乙酯）购买于Sigma公司（货号：D5758）；q-PCR 反应使用ToYoBo公司的qPCR Mix（货号：QPS-201）；原位杂交 使用Affymetrix公司的的QuantiGene ViewRNA ISH Tissue Assay原位杂交试剂盒（货号： QVT0050）；本实施例所使用的RNase-free枪头，EP管等均为KG公司耗材，并于120℃高 压灭菌30min。仪器为Bio-red公司的MyCycler PCR仪。

（1）RT-PCR检测藏绵羊KRTAP13.1基因在各组织中的表达情况

采集藏绵羊（来源西藏林芝地区羊场）的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、小肠、 大肠、瘤胃、皱胃、脂肪、淋巴（肠系膜）、毛囊、皮肤（含毛囊）、睾丸、卵巢共16种组织 样。利用动物组织总RNA提取试剂盒提取上述采集的各组织总RNA。提取的总RNA经1% 琼脂糖凝胶电泳检测完整性良好，经物性测定仪检测显示总RNA的OD260/OD280值在1.8-2.2 之间，可用于后续实验。取各组织中总RNA1μg，利用“RT reagent Kit With gDNA Eraser”试剂盒（购自宝生物工程大连有限公司）分别反转录成cDNA，具体反应条件及操作 参照产品说明书。利用PCR技术检测KRTAP13.1基因（NCBI登录号：NM_001080350.1） 在各组织中的表达情况，引物序列为SEQ ID NO：1和2所示。扩增得到的片段序列为SEQ ID NO：3所示。

PCR体系(总体积10ul)及反应条件如下：

cDNA 1μl Premix Taq^TMHot Start Version 5μl Primer-F（SEQ ID NO1） 0.2μl Primer-R（SEQ ID NO2） 0.2μl ddH2O 3.6μl

PCR反应条件：

94℃5min；（94℃30s，54℃30s，72℃20s）*28循环；72℃3min;15℃2min

将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物上样4ul，100bpMarker上样4ul，100V 恒压电泳30min，紫外凝胶成像仪下拍照，结果如图1。

如图1所示，KRTAP13.1只在毛囊及皮肤（含毛囊）样品中具有扩增条带，说明KRTAP13.1 在所检测的组织中，只在毛囊和皮肤（含毛囊）中表达。

（2）q-PCR鉴定藏绵羊KRTAP13.1基因在皮肤和毛囊中的表达情况

为了进一步验证KRTAP13.1为绵羊毛囊特异表达的基因，以绵羊KRT83基因（NCBI 登录号：NM_001199069.1）作为毛囊特异表达基因的阳性对照，以绵羊KRT5基因（NCBI 登录号：XM_004006326.1）作为皮肤特异表达基因的阳性对照，以牛18S基因（NCBI登录 号：NR_036642.1）作为内参，通过荧光定量PCR（q-PCR）的方法检测KRTAP13.1基因在 藏绵羊皮肤和毛囊中的表达情况。

q-PCR体系（总体积10ul）和反应条件如下：

q-PCR反应条件：95℃10min；（95℃10s,60℃20s,72℃15s）*45循环 结果如图2所示，其在毛囊中的表达量要明显高于在皮肤（包含毛囊）中的表达量。

（3）原位杂交检测藏绵羊KRTAP13.1在藏绵羊皮肤中的表达位置

为了进一步确定藏绵羊KRTAP13.1基因在皮肤中的表达位置，我们通过原位杂交实验对 其进行了定位。使用QuantiGene ViewRNA ISH Tissue Assay原位杂交试剂盒（购自Affymetrix 公司，货号：QVT0050）。由Affymetrix公司合成探针。采集新鲜藏绵羊皮肤样品，在4%多 聚甲醛（含0.1%DEPC）中固定48h。将皮肤组织包埋成腊块并用防脱切片制作皮肤组织切片， 厚度为4μm。原位杂交操作参照试剂盒说明书。结果如图3所示。红色的探针信号存在于藏 绵羊毛干之中，说明藏绵羊KRTAP13.1为毛囊特异表达基因。

实施例2：藏绵羊毛囊特异表达基因KRTAP13.1上游调控序列区域sKAP13.1p克隆

本实施例所用试剂及仪器包括：高保真扩增酶为宝生物工程大连有限公司的PrimerSTAR  GXL DNA Polymerase（货号：DR050S）；DNA纯化试剂盒使用天根生化科技（北京）有限 公司的通用型DNA纯化回收试剂盒（货号：DP214-02）。仪器为Bio-red公司的MyCycler PCR 仪。

以藏绵羊基因组为模板，根据澳大利亚CSIRO（英联邦科学和工业研究组织）发布的绵 羊基因组v2.0版本（网址：http://www.livestockgenomics.csiro.au/sheep/oar2.0.php），在绵羊 KRTAP13.1基因5’端上游设计引物（序列见SEQ ID NO：4，SEQ ID NO:5）进行PCR扩增， 得到绵羊KRTAP13.1基因6956bp基因上游调控序列sKAP13.1p（见SEQ ID NO:9），为了进 行下一步的真核表达载体构建，在扩增引物的5’端分别加入了SacII（正向引物）及XhoI （反向引物）酶切位点。具体反应体系及条件如下：

PCR反应体系（总体积10ul）如下：

DNA（100ng/ul） 0.2ul 5×Primer STAR GXL Buffer 2ul dNTP（2.5mM each） 0.8ul 引物-F（SEQ ID NO4） 0.2ul 引物-R（SEQ ID NO5） 0.2ul PrimerSTAR GXL DNA Polymerase 1ul H₂O 5.6ul

PCR反应条件为：94℃5min；（98℃30s；55℃15s；68℃7min），35循环；68℃5min； 15℃2min。

PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，纯化产物上样4ul，DL10,000Marker（天根生化 科技（北京）有限公司，货号：MD116）上样4ul，100V恒压电泳40min，紫外凝胶成像仪 下拍照，结果如图4，获得特异的扩增片段且清晰，大小与预期相符，可进行后续实验。

实施例3：绿荧光表达载体sKAP13.1p-GFP构建

本实施例所用试剂及仪器包括：限制性内切酶SacII和XhoI购自Fermentas公司； ZsGreen1-1载体骨架购自Clontech（货号：632473）；凝胶回收试剂盒使用天根生化科技（北 京）有限公司的通用型DNA纯化回收试剂盒（货号：DP214-02）；连接酶使用宝生物工程 大连有限公司的DNA Ligation Kit LONG（货号：D6024）；感受态细胞DH5α购自宝生物工 程大连有限公司（货号：D9057）。PCR反应使用宝生物工程大连有限公司的Premix Taq^TMHot  Start Version（货号：DR028C）。质粒提取使用天根生化科技（北京）有限公司的TIANprep Mini  Plasmid Kit试剂盒（货号：DP103）仪器为Bio-red公司的MyCycler PCR仪。具体操作如下：

（1）对上述实施例2中PCR扩增所获得的sKAP13.1p上游调控序列区域片段进行酶切， 形成粘性末端，为连接到ZsGreen1载体中做准备。

（2）酶切反应体系及条件：

总体积20ul体系：

PCR产物 10ul SacII（10U/ul） 2ul XhoI（10U/ul） 1ul 10X Buffer G 2ul ddH₂O 5ul

反应条件：37℃过夜。

酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，对sKAP13.1p6938b p大小的片段进行切胶纯化， 具体操作参照试剂盒的使用说明书。

（3）酶切质粒ZsGreen1-1。目的是在质粒启动子区域切开与sKAP13.1p片段两端相应 的酶切位点，形成粘性末端，以便将sKAP13.1p片段连接到载体上。具体体系及反应条件如 下：

总体积20ul体系：

ZsGreen1-1质粒（500ng/ul） 2ul SacII（10U/ul） 2ul XhoI（10U/ul） 1ul 10X Buffer G 2ul

ddH₂O 13ul

反应条件：37℃过夜

酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，对线性化的ZsGreen1-1约4500bp大小片段进行切 胶纯化，具体操作参照说明书。

（4）连接。目的是将sKAP13.1p片段，连接入ZsGreen1-1载体的启动子区域，最终构 建成sKAP13.1p-GFP载体（使用DNA Ligation Kit LONG试剂盒）。具体体系及反应条件如下： 总体积49ul体系：

ZsGreen1-1酶切纯化产物 1ul sKAP13.1p片段酶切纯化产物 2ul 10X LONG Ligation Buffer 5ul ddH₂O 41ul

反应条件：65℃3min后，冰中急冷；向反应体系中加入1μL DNA Ligase（LONG），轻微 混合；16℃15h。

（5）载体质粒转化及提取。目的在于筛选阳性质粒并扩大培养。具体操作如下：

①冰上解冻DH5α感受态细胞100ul，向其中加入10ul连接产物，冰上静置30min；

②放入42℃水浴热激60s，冰中静置3min；

③加入500ul37℃预热的LB培养基（不含抗生素），37℃振荡培养1h（225rpm）

④取200ul菌液涂布LB固体平板培养基（含卡那霉素，浓度30μg/mL），37℃倒置培养过 夜。

⑤挑取白色菌落放于含有1mL LB培养基（含卡那霉素，浓度30μg/mL）的1.5mL离心管 中，37℃振荡培养8h（225rpm）。

⑥以菌液为模板进行PCR检测，并设置阳性（sKAP13.1p片段为模板）及阴性（以 RNase-FreeH₂O为模板）对照。引物序列见SEQ ID NO：6、7。扩增得到的产物序列见SEQ  ID NO：8，其大小为800bp。具体反应体系及反应条件如下：

PCR反应体系（总体积为10ul）如下：

菌液 1ul Premix Taq^TMHot Start Version 5ul 引物-F（SEQ ID NO6） 0.2ul 引物-R（SEQ ID NO7） 0.2ul ddH₂O 3.6ul

PCR反应条件：

94℃5min；（94℃30s，54℃30s，72℃20s）*28循环；72℃3min;15℃2min

使用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，含有800bp扩增条带的样品即为阳性菌落。从 阳性菌落的菌液取100ul，加入到装有6mL LB液体培养基（含卡那霉素，浓度：30μg/mL） 的15mL离心管中。37℃过夜扩大培养。

使用质粒小提试剂盒对扩大培养后的菌液进行质粒提取，最终获得构建好的 sKAP13.1p-GFP毛囊特异表达基因上游调控序列绿荧光蛋白表达载体。sKAP13.1p-GFP载体 结构示意图如图5C所示。

实施例4：sKAP13.1p-GFP载体表达活性及特异性验证

本实施例所用的实验动物为昆明小鼠（白色，由深圳华大基因研究院提供）。

（1）制作转基因小鼠

本实施例采用原核显微注射的方法（徐艺玫,等.绿色荧光蛋白基因在转基因小鼠体内的表 达[J].生物技术通讯.2005），利用限制性内切酶酶切环状载体，使载体由闭合的环状结构变成 开环的线性结构的方式线性化sKAP13.1p-GFP载体，注射入小鼠原核期胚，通过同源重组的 方法将sKAP13.1p-GFP片段整合到小鼠基因组中，制备转基因小鼠，在个体水平上验证 sKAP13.1p启动子序列的活性及特异性。

（2）sKAP13.1p-GFP转基因阳性小鼠表型检测

由于sKAP13.1p-GFP载体中，sKAP13.1p启动子后连接有ZsGreen1绿荧光蛋白报告基因 （购自Clontech），因此，在荧光显微镜下可以观察到，从sKAP13.1p-GFP转基因阳性小鼠 上剪下的毛发，观察到是发出绿荧光的（图6所示），证明本发明的启动子在转基因阳性小鼠 的毛发上具有特异性活性表达。