蛋白、DNA分子、含有该DNA的转化宿主及该转化宿主用于生产L-缬氨酸的方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，特别涉及蛋白、编码该蛋白的DNA分子、含有该DNA分子的转化宿主机该转化宿主用于生产L-缬氨酸的方法。通过将辅助因子为NADH的亮氨酸脱氢酶的编码基因leuDH（核苷酸序列如SEQ ID No.2所示）转化导入棒杆菌中，获得胞内氧化还原平衡改变的基因工程菌，培养该菌株能够用于生产L-缬氨酸，极显著提高了L-缬氨酸的产量。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及蛋白、编码该蛋白的DNA分子、含有该DNA分子的转化宿主机该转化宿主用于生产L-缬氨酸的方法。 

背景技术

L-缬氨酸(L-valine)，化学名称为L-α-氨基异戊酸，分子式为C₅H₁₁NO₂，相对分子质量为117.15。呈白色结晶或结晶性粉末，无臭，味苦，在水中溶解度：25℃为88.5g/L，50℃为96.2g/L，不溶于冷乙醇，乙醚，丙酮。等电点为5.96，熔点315℃。L-缬氨酸(L-Val)是人体八种必需氨基酸之一，又是三种支链氨基酸(包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。可以广泛应用于医药工业、食品工业和饲料工业等。医药工业中，可作氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，可治疗肝功能衰竭、中枢神经系统功能紊乱。如缺乏可引起神经障碍、停止发育、体重下降、贫血等。食品工业中，可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。米制糕饼中添加缬氨酸(1g/kg)，产品有芝麻香，用于面包亦能改善风味。L-缬氨酸也可用作氨基酸能量饮料与运动员饮料，有形成肌肉、强化肝功能、减轻肌肉疲劳等作用。饲料工业中，对动物的乳腺组织分泌乳汁有重要的促进作用。将其用于雏鸡饲料中，可提高雏鸡对鸡新城疫病毒的免疫能力。而且L-缬氨酸是动物饲料中的一种限制性氨基酸，所以L-缬氨酸可作为饲料添加剂改善动物日粮中氨基酸含量的不足。 

L-缬氨酸的生产方法有三种：提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制、生产成本高、污染环境，难以实现工业化生产。微生物发酵法生产L-缬氨酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-缬氨酸最主要的方法。通过菌株的选育，以解除代谢调节中的反馈抑制和阻遏，达到过量积累L-缬氨酸的目的，是微生物发酵法工业应用最为广泛的手段。 

棒杆菌是用于生产L-氨基酸的代表性微生物，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)和黄色短杆菌(Breviabacterium flavum)。然而，现有的菌株发酵生产L-缬氨酸的产量较低，无法满足市场需求。 

为了改善微生物的L-缬氨酸生产能力，可以通过传统诱变和代谢工程等方法对生产菌株进行不断地改造。传统诱变育种，是指通过对特定出发菌株进行物理、化学或二者合并地诱变处理，再选育出营养缺陷型和/或氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制或阻遏作用，从而达到过量积累某种氨基酸的目的。代谢工程育种，就是在对代谢网络系统分析的基础上采用基因工程技术改造细胞代谢系统以提高产物得率或改进细胞性能。主要包括如下手段：对原有代谢途径的改造、新代谢途径的构建、组学规模的代谢关键途径或靶点的识别。通过理性的代谢工程构建氨基酸生产菌株，正逐渐成为氨基酸育种的主要策略。 

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种蛋白、编码该蛋白的DNA分子、含有该DNA分子的转化宿主机该转化宿主用于生产L-缬氨酸的方法。通过将辅助因子为NADH的亮氨酸脱氢酶的编码基因leuDH转化导入棒杆菌中，获得胞内氧化还原平衡改变的基因工程菌，培养该菌株能够用于生产L-缬氨酸，极显著提高了L-缬氨酸的产量。 

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： 

本发明提供了一种具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的亮氨酸脱氢酶或其功能等价物。 

缬氨酸的合成代谢途径，是从二分子的丙酮酸开始，经过乙酰乳酸、二羟基异戊酸和酮基异戊酸等三个中间产物，最终形成缬氨酸。而这些中间代谢产物分别通过乙酰羟酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶、二羟酸脱水酶和转氨酶的催化活性而产生的，如图1所示。 

乙酰羟酸合成酶（AHAS）是L-缬氨酸合成途径上的第一个共用酶也是关键酶，催化2分子丙酮酸脱羧合成1分子乙酰乳酸，即缬氨酸的前体。AHAS 受三种支链氨基酸中的任何一种反馈抑制。 

二羟酸还原异构酶（AHAIR）是L-缬氨酸合成途径上的第二个酶，为一四聚体酶，由大小为53kDa的同种亚基组成，催化乙酰乳酸生成2,3-二羟基异戊酸。反应包括烷基的异构和还原；发生该反应还需要Mg²⁺(激活剂)和NADPH(氢供体)。 

二羟酸脱水酶（DHAD）是L-缬氨酸合成途径上的第三个酶，是由两个亚基组成的二聚体酶，可催化2,3-二羟基异戊酸生成2-酮基异戊酸。 

转氨酶（TA）B是缬氨酸合成过程中的最后一个酶。转氨酶B、转氨酶C和芳香转氨酶(基因分别为ilvE、avtA和tyrB)在支链氨基酸的合成中都具有催化活性，但主要由转氨酶B催化三种支链氨基酸合成的最后一步反应。 

亮氨酸脱氢酶(Leucine Dehydrogenase，LDH，EC1.4.1.9)是一种NAD⁺依赖型的氧化还原酶，它可逆地催化L-亮氨酸和一些支链L-氨基酸反应生成对应的酮酸及其类似物，如下所示： 

来源于巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）ATCC14945的亮氨酸脱氢酶具有良好的热稳定性、化学稳定性和操作稳定性。 

NADH和NADPH是细胞内重要的辅酶，参与糖、脂、蛋白质三类物质代谢的绝大部分氧化还原反应，NAD/NADH和NADP/NADPH分别是其对应的氧化还原对。将来源于巨大芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶编码基因leuDH导入到棒杆菌或黄杆菌中，其编码产物以NADH为辅酶。该酶的表达可以用NADH作为辅酶补充原来以NADPH为辅酶的转氨酶的功能，从而减少对NADPH的消耗，达到调节胞内NADH与NADPH的平衡的效果，转化并表达的结果是使胞内氧化还原平衡也相应得到改变。 

作为优选，本发明提供的具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的亮氨 酸脱氢酶的功能等价物通过在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基获得。 

本发明还提供了具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的亮氨酸脱氢酶或其功能等价物用于催化2-酮基异戊酸生成缬氨酸的应用。 

本发明还提供了编码具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的亮氨酸脱氢酶或其功能等价物的DNA分子。 

在本发明的一些实施例中，本发明提供的编码具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的亮氨酸脱氢酶或其功能等价物的DNA分子核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。 

本发明还提供了编码具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的亮氨酸脱氢酶或其功能等价物的DNA分子，其核苷酸序列与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的同源性大于95%以上。 

本发明还提供了编码具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的亮氨酸脱氢酶或其功能等价物的DNA分子的载体；编码具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的亮氨酸脱氢酶或其功能等价物的DNA分子可以为核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子或核苷酸序列与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的同源性大于95%以上的DNA分子。 

在本发明的一些实施例中，编码具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的亮氨酸脱氢酶或其功能等价物的DNA分子的载体为pMX119。 

本发明还提供了编码具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的亮氨酸脱氢酶或其功能等价物的DNA分子的转化宿主；编码具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的亮氨酸脱氢酶或其功能等价物的DNA分子可以为核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子或核苷酸序列与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的同源性大于95%以上的DNA分子。 

在本发明的一些实施例中，编码具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的亮氨酸脱氢酶或其功能等价物的DNA分子可以为核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子或核苷酸序列与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的同源性大于95%以上的DNA分子通过电击转化法导入。 

在本发明的一些实施例中，编码具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列 的亮氨酸脱氢酶或其功能等价物的DNA分子可以为核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子或核苷酸序列与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的同源性大于95%以上的DNA分子表达增强。 

作为优选，表达增强的方式为编码具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的亮氨酸脱氢酶或其功能等价物的DNA分子可以为核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子或核苷酸序列与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的同源性大于95%以上的DNA分子至于强启动子的控制之下或增加其拷贝数。 

在本发明的一些实施例中，转化宿主为棒杆菌或短杆菌。 

在本发明的另一些实施例中，转化宿主为棒杆菌，其保藏编号为其保藏编号为CGMCC No.7041。 

本发明还提供了上述转化宿主用于发酵生产L-缬氨酸的用途。 

本发明还提供了上述转化宿主发酵生产L-缬氨酸的方法，其特征在于，取所述转化宿主在种子培养基中扩增后，置于发酵培养基中于28℃～37℃培养50～120h，即得。 

本发明提供一种蛋白、编码该蛋白的DNA分子、含有该DNA分子的转化宿主机该转化宿主用于生产L-缬氨酸的方法。通过将辅助因子为NADH的亮氨酸脱氢酶的编码基因leuDH转化导入棒杆菌中，获得胞内氧化还原平衡改变的基因工程菌，培养该菌株能够用于生产L-缬氨酸。摇瓶发酵的发酵液中，出发菌株CGMCC1.299的L-缬氨酸产量为1.2g/L，而本发明提供的棒杆菌的L-缬氨酸产量为3.8g/L，比出发菌株产量提高216%。在50L罐的发酵液中，出发菌株CGMCC1.299的L-缬氨酸产量为2.9g/L，而本发明提供的棒杆菌的L-缬氨酸产量为9.1g/L，比出发菌株产量提高213.7%，极显著提高了L-缬氨酸产量（P＜0.01）。综合上述发酵试验结果，本发明提供的保藏编号为CGMCCNo.7041的棒杆菌均极显著提高了L-缬氨酸产量（P＜0.01）。 

生物保藏说明 

分类命名：北京棒杆菌Corynebacterium pekinense于2012年12月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为其保藏编号为CGMCC No.7041。 

附图说明

图1示L-缬氨酸生物合成路线图； 

图2示重组质粒pXMJ19-leuDH的示意图。 

具体实施方式

本发明公开了一种蛋白、编码该蛋白的DNA分子、含有该DNA分子的转化宿主机该转化宿主用于生产L-缬氨酸的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。 

本发明提供的蛋白、编码该蛋白的DNA分子、含有该DNA分子的转化宿主机该转化宿主用于生产L-缬氨酸的方法中所用试剂均可由市场购得。其中，出发菌株的保藏编号为CGMCC1.299。 

下面结合实施例，进一步阐述本发明： 

实施例1  表达质粒pXMJ19-leuDH的构建 

1.以巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium ATCC14945的基因组DNA为模板，用leuF和leuR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物： 

leuF：5-’GAAGCTTATGAAAATTTTTGACTAT-3’(下划线为HindIII酶切识别位点) 

leuR：5-’CGAATTCTTAGCGCGTATGACGTCTAC-3’(下划线为EcoRI酶切识别位点) 

2.回收步骤1的PCR产物并连到载体pEASY^TM-T5(购自北京全式金生物技术有限公司)，得到重组质粒pT5-leuDH，测序得到leuDH基因序列,如SEQ ID No.1所示； 

3.用两种限制性内切酶（HindIII和EcoRI）双酶切质粒pT5-leuDH和载体pXMJ19，切胶回收后分别得到leuDH片段（约1100bp）与pXMJ19载体骨架(约6600bp)； 

4.将步骤3所得的两条双酶切产物进行连接，转化大肠杆菌，经含有17μg/mL氯霉素的LB培养基平板筛选得到阳性克隆子，扩增培养后提取重组质粒pXMJ19-leuDH，其结构示意图如图2所示。 

实施例2 工程菌CGMCC1.299/pXMJ19-leuDH的构建 

1.制备棒杆菌的电击转化感受态细胞； 

2.电击转化：将3-8μL的pXMJ19-leuDH质粒加入到感受态细胞中，冰上放置10min；转入1mm电击杯，1.8或2.1kV电击5-7ms； 

3.加入LB培养基1mL，33℃、150rpm培养1h，；浓缩后涂布于含25μg/mL卡那霉素的脑心培养基平板上，33℃恒温培养36-48h； 

4.筛选阳性克隆子，通过用leuF/leuR组成的引物对进行PCR鉴定(有约1.1kb的特异条带的为阳性)，得到重组菌。 

将重组菌命名为北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)MHZ-1010，该菌株已于2012年12月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.7041。 

实施例3 本发明提供的保藏编号为CGMCC No.7041的棒杆菌发酵生产L-缬氨酸 

1.培养基 

种子活化培养基：酵母提取物1％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，葡萄糖0.5％，琼脂2％，pH7.2； 

种子培养基：玉米浆2.5%，葡萄糖1.0％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.1％，尿素0.1％，CaCO₃0.5%，pH7.2； 

发酵培养基：玉米浆0.5%，葡萄糖12.0％，硫酸铵4.0％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.1％，CaCO₃4%，V_H50ug/L，V_B1·HCl100μg/L,pH7.2； 

2.摇瓶发酵生产L-缬氨酸 

(1)种子培养：挑取本发明提供的棒杆菌斜面种子1环接至装有20mL种子培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养16-22h； 

(2)发酵培养：将2mL种子液接种至装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养72h；24h时加入IPTG（终浓度为10μmol/L）诱导； 

(3)取1mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测棒杆菌与对照菌发酵液中的L-缬氨酸含量，其浓度如表1所示。 

表1摇瓶发酵的发酵液中L-缬氨酸含量的比较结果 

如表1中数据所示，出发菌株CGMCC1.299的L-缬氨酸产量为1.2g/L，而本发明提供的棒杆菌的L-缬氨酸产量为3.8g/L，比出发菌株产量提高216%,极显著提高了L-缬氨酸产量（P＜0.01）。 

3.50L罐发酵生产L-缬氨酸 

(1)二级种子培养：挑取棒杆菌斜面种子2-3环接至装有100mL种子培养基的2L三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养约12-16h；再将其转入含1L培养液的5L三角瓶中，33℃、220r/min继续培养16-20h； 

(2)50L发酵：将3L种子液接种至装有22L发酵培养基的50L发酵罐中，31℃培养72h；过程中用氨水来调节pH7.0，用80%(m/v)的葡萄糖维持残糖浓度为2-3%，相对溶氧控制在10-20%之间，24h时时加入IPTG（终浓度为10μmo l/L）诱导； 

(3)取1mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，HPLC检测棒杆菌与对照菌发酵液中的L-缬氨酸含量，其浓度如表2所示。 

表250L罐的发酵液中L-缬氨酸含量的比较结果 

如表2所示，出发菌株CGMCC1.299的L-缬氨酸产量为2.9g/L，而本发明提供的棒杆菌的L-缬氨酸产量为9.1g/L，比出发菌株产量提高213.7%，极显著提高了L-缬氨酸产量（P＜0.01）。 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。