一种苏云金芽胞杆菌Bt20菌株的发酵培养基

摘要

一种苏云金芽胞杆菌Bt20菌株的发酵培养基，它涉及一种苏云金芽胞杆菌Bt20菌株的发酵培养基。本发明要解决现有针对苏云金芽胞杆菌Bt20菌株培养的培养基成本高，不适于产业化大规模生产推广应用的问题。本发明的苏云金芽胞杆菌Bt20菌株的最佳发酵配方为：玉米粉3%、蝇蛆3.0%、黄豆粉3%、酵母粉2%以及余量水。本发明以发酵液的吸光度值及杀虫毒力测定为指标，通过单因子及正交试验对发酵配方的碳氮源进行优化。获得的Bt20菌株的培养基，其72h的发酵培养液对小菜蛾2龄幼虫的校正死亡率可达到96.61%。本发明的发酵工艺简单、原材料易得、生产成本低、市场竞争力强。本发明应用于Bt菌株培养领域。

说明书

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及苏云金芽胞杆菌Bt20菌株液体发酵培养基配方。 

背景技术

随着人们环保意识的提高，生物农药引起了越来越多的关注。其中，以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt）发酵产生的Bt杀虫剂是目前应用最广泛的微生物杀虫剂，但Bt杀虫剂的原料成本在逐年增高、特别是随着全球市场上蛋白原材料价格的增高，使得苏云金芽胞杆菌发酵成本明显增高，进而影响其市场占有率。 

生防制剂在商品化生产之前，发酵培养基的配方选择尤为重要，一个有效的发酵培养基配方能在相对较短的发酵时间内产生足够的杀虫晶体蛋白，能有效的发挥杀虫菌株的毒力、降低成本、易于推广。因此，寻找到能使苏云金芽胞杆菌高产、并降低生产成本、易得的发酵原材料是大规模商品化生产的基础。 

国际上常用鱼粉、大豆粉、工农业废弃物（木薯淀粉，玉米淀粉，稻草，麦麸，玉米浆酒，甘蔗糖蜜，干酪乳清和椰子废物等）和工业废水、污泥代替高成本发酵介质，用于Bt杀虫剂的生产。虽然这些方法都在一定程度上提高了苏云金芽胞杆菌生物杀虫剂的产量，克服生产成本过高的弊端，但综合成本的进一步降低仍是Bt杀虫剂商品化生产追求的目标。 

苏云金芽胞杆菌Bt20（以下简称Bt20）是东北农业大学农学昆虫研究室独立分离出来的野生菌株，具有自主的知识产权，其菌种保藏号为：CGMCCNO.1710。Bt20对甘蓝夜蛾、小菜蛾、草地螟等鳞翅目害虫具有很高的杀虫活性，其杀虫活性与目前在市场上已应用的苏云金芽胞杆菌HD-73野生菌株的杀虫活性相当，具有开发应用的前景。本研究室已对苏云金芽胞杆菌Bt20菌株的杀虫毒力、杀虫谱、其生物源杀虫配方及其相关助剂配方均已研究并获得相应的发明专利（ZL200610009912.0和ZL200810209585.2）。针对近年来，市场上发酵配方用的蛋白价格逐年上涨，直接导致苏云金芽胞杆菌Bt20菌株发酵的培养基成本明显增高，不利于其产业化，及大规模推广应用。 

发明内容

本发明的目的是为了解决现有针对Bt20菌株培养的培养基成本高，不适于产业化大规模生产及推广应用的问题，而提供了一种苏云金芽胞杆菌Bt20菌株的发酵培养基。 

本发明的一种苏云金芽胞杆菌Bt20菌株的发酵培养基，按重量百分含量计，组分为：1.5%～4%的玉米粉、0.1%～3.5%的蝇蛆、0.5%～3.5%的黄豆粉、0.5%～2.5%的酵母粉和余量的水。 

本发明包含以下有益效果： 

本发明首次选取蝇蛆粉作为发酵培养基的氮源，替代原来常用的蛋白-鱼粉，并发现苏云金芽胞杆菌Bt20菌株对蝇蛆粉的吸收利用要显著优于其他氮源，提高了发酵液的吸光度值，增强了菌株的毒力，可完全代替鱼粉作为发酵培养基的氮源，这一应用目前尚无报道。据调查，鲜蝇蛆价格低廉，约5000～7500元/吨，相比鱼粉、酵母粉、蛋白胨等氮源在价格上有明显的优势，并且发酵工艺简单、原材料易得、变废为宝，增强了Bt生物杀虫剂的市场竞争力，为大规模的产业化生产奠定基础。采用本发明的苏云金芽胞杆菌Bt20菌株的发酵配方的培养基，其72h的发酵培养液对小菜蛾2龄幼虫的校正死亡率可达到96.61%，其效果与标准菌株HD-73的校正死亡率94.53%相当。 

附图说明

图1为实施例中不同碳源对苏云金芽胞杆菌Bt20菌株吸光度值影响柱状图； 

图2为实施例中不同氮源对苏云金芽胞杆菌Bt20菌株最大吸光度值影响响柱状图。 

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种苏云金芽胞杆菌Bt20菌株的发酵培养基，按重量百分含量计，组分为：1.5%～4%的玉米粉、0.1%～3.5%的蝇蛆、0.5%～3.5%的黄豆粉、0.5%～2.5%的酵母粉和余量的水。 

本实施方式所述的苏云金芽胞杆菌Bt20菌株的菌种保藏号为：CGMCCNO.1710。 

本实施方式首次选取蝇蛆粉作为发酵培养基的氮源，替代原来常用的蛋白-鱼粉，并发现苏云金芽胞杆菌Bt20菌株对蝇蛆粉的吸收利用要显著优于其他氮源，提高了发酵液的吸光度值，增强了菌株的毒力，可完全代替鱼粉作为发酵培养基的氮源，这一应用目前尚无报道。据调查，鲜蝇蛆价格低廉，约5000～7500元/吨，相比鱼粉、酵母粉、蛋白胨等氮源在价格上有明显的优势，并且发酵工艺简单、原材料易得、变废为宝，增强了Bt生物杀虫剂的市场竞争力，为大规模的产业化生产奠定基础。采用本实施方式的苏云金芽胞杆菌Bt20菌株的发酵配方的培养基，其72h的发酵培养液对小菜蛾2龄幼虫的校正死亡率死亡率可达到96.61%，其效果与标准菌株HD-73的校正死亡率94.53%相当。 

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的Bt20菌株的发酵培养基，按重量百分含量计，组分为：2%～4%的玉米粉、0.5%～3%的蝇蛆、1%～3%的黄 豆粉、1%～2%的酵母粉和余量的水。其它与具体实施方式一相同。 

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：所述的Bt20菌株的发酵培养基，按重量百分含量计，组分为：2.5%～3.5%的玉米粉、1%～3%的蝇蛆、1.5%～3%的黄豆粉、1.5%～2%的酵母粉和余量的水。其它与具体实施方式一或二相同。 

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：所述的苏云金芽孢杆菌20菌株的发酵培养基，按重量百分含量计，组分为：2.5%～3.5%的玉米粉、1%～3%的蝇蛆、1.5%～3%的黄豆粉、1.5%～2%的酵母粉和余量的水。其它与具体实施方式一至三之一相同。 

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：所述的苏云金芽孢杆菌20菌株的发酵培养基，按重量百分含量计，组分为：3%的玉米粉、2%～3%的蝇蛆、2%～3%的黄豆粉、2%的酵母粉和余量的水。其它与具体实施方式一至四之一相同。 

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：所述的苏云金芽孢杆菌20菌株的发酵培养基，按重量百分含量计，组分为：3%的玉米粉、2.5%～3%的蝇蛆、2.5%～3%的黄豆粉、2%的酵母粉和余量的水。其它与具体实施方式一至五之一相同。 

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：所述的苏云金芽孢杆菌20菌株的发酵培养基，按重量百分含量计，组分为：3%的玉米粉、3%的蝇蛆、3%的黄豆粉、2%的酵母粉和余量的水。其它与具体实施方式一至六之一相同。 

通过以下实施例验证本发明的有益效果： 

实施例 

本实施例的苏云金芽胞杆菌Bt20菌株的发酵培养基，以质量百分含量为2%的玉米粉和质量百分含量为2%的玉米淀粉作为碳源，质量百分含量为2%的黄豆粉、质量百分含量为2%的鱼粉、质量百分含量为2%的蝇蛆、质量百分含量为2%的蛋白胨、质量百分含量为2%的酵母粉和质量百分含量为2%的硫酸铵为氮源，分别进行单因子筛选试验。 

依据单因素的实验结果，筛选出以玉米粉作为唯一碳源，黄豆粉、鱼粉、蝇蛆、酵母粉作为氮源的四个因素，每个因素设定3个水平，采用L18(3⁷)正交表（表2）进行实验，随机安排因素和浓度水平（见表1）。 

表1苏云金芽孢杆菌Bt20菌株碳氮源正交试验因素和水平设计（%） 

表2苏云金芽孢杆菌Bt20菌株正交试验设计 

对苏云金芽胞杆菌Bt20菌株Bt20培养，对培养后的苏云金芽胞杆菌Bt20菌株Bt20进行毒理和吸光度测定。 

具体如下：按以上各配方配制发酵培养基，50mL装入250mL的三角瓶中灭菌，将在牛肉膏蛋白胨培养基中活化的苏云金芽胞杆菌Bt20按接种量为1%的量接种到发酵培养基中，在温度为30℃，转速为230rpm的条件下，发酵振荡培养，发酵至芽胞晶体形成并有30%的胞晶分离时终止。测定各个配方培养液的吸光度值D600（1/30）及对2龄小菜蛾的致死中浓度。 

结果： 

1、不同碳源对苏云金芽胞杆菌Bt20发酵液OD600(1/30)值的影响 

不同碳源对苏云金芽胞杆菌Bt20发酵液OD600(1/30)值的影响结果见图1，由图1可知：在1%水平下，振荡培养40h时，以玉米粉为主要碳源的苏云金芽胞杆菌Bt20发酵液其吸光度OD600(1/30)值为0.729，极显著优于振荡培养44h时以玉米淀粉为碳源的发酵液的OD600(1/30)值0.679。数据分析结果表明苏云金芽胞杆菌Bt20对碳源的利用能力：玉米粉>玉米淀粉。 

2、不同氮源对苏云金芽胞杆菌Bt20发酵液OD600(1/30)值的影响 

不同氮源对苏云金芽胞杆菌Bt20发酵液OD600(1/30)值的影响结果见图2，从图2可见：苏云金芽胞杆菌Bt20对不同氮源的利用情况不同，主要利用有机氮源。以蝇蛆的 利用最好，极显著优于其它氮源，其发酵液的OD600(1/30)值为0.651，较最低的硫酸铵高出两倍，其次是酵母粉、鱼粉发酵液的OD600(1/30)值分别为0.623、0.582。虽然蛋白胨和黄豆粉最大吸光度值存在极显著差异，但从整个生长周期看，蛋白胨的最佳产孢时间为48h远长于黄豆粉的最佳产孢时间为36h。同时，从发酵的生产成本看，蛋白胨的价格是45000元/吨是黄豆粉价格：4800/吨的9倍。因此，从田间应用角度，黄豆粉要优于蛋白胨。最后是硫酸铵，为无机氮源，在整个发酵过程中并没有使苏云金芽胞杆菌Bt20产生芽胞及伴胞晶体。综合来看，苏云金芽胞杆菌Bt20对氮源的利用顺序：蝇蛆>酵母粉>鱼粉>黄豆粉>蛋白胨>硫酸铵。 

3、苏云金芽胞杆菌Bt20发酵正交试验结果 

表3苏云金芽胞杆菌Bt20菌株正交试验设计与结果 

对苏云金芽胞杆菌Bt20正交试验吸光度值统计结果用Duncan新复极差法进行分析，结果表明：蝇蛆作为发酵培养的主要氮源，含有丰富的氨基酸，在其质量分数为0%、1.5%、3%时，发酵液的OD(1/30)值分别为0.7173、0.7383、0.8878。证明了，其含量的变化能影响发酵液的OD(1/30)值，具有极显著的促进作用。由蝇蛆的极差R'=0.2172，可知蝇蛆是最优的氮源，应选3水平（含量3%）； 

同理由极差分析表明，其它各因素对发酵液的吸光度值影响（如表4所示）：E酵母粉>A×B>B鱼粉>D黄豆粉>A×C。其中，酵母粉3水平>1水平>2水平，选3（2.0%） 水平；鱼粉1水平>3水平>2水平，应选1水平，但是A×B互作对发酵液OD600(1/30)值的影响比鱼粉的影响要大，互作中3水平>1水平>2水平，因此，鱼粉应选3（0.0%）水平，表明鱼粉对发酵液OD600(1/30)值影响不大；黄豆粉3水平>2水平>1水平，应选3（3%）水平； 

表4各因素对发酵液的吸光度值影响 

因此，综合考虑上述实验结果，苏云金芽胞杆菌Bt20最佳液体发酵培养基组合： 

A₁B₃C₃D₃E₃即配方3玉米粉3%，蝇蛆3.0%，黄豆粉3%，酵母粉2%。 

4、发酵培养基对苏云金芽胞杆菌Bt20菌株发酵毒力的影响 

表5不同配方苏云金芽胞杆菌Bt20毒力回归方程 

由表5可知，苏云金芽胞杆菌Bt20菌株在配方3培养基中产生发酵液对2龄小菜蛾 的毒力最强其LC50为2.11×10⁴·mL^-1，其次是配方4所产的的发酵液对2龄小菜蛾的LC50为2.45×10⁴·mL^-1，而配方18和16的发酵液毒力最差，其LC50分别为1.623×10⁶·mL^-1、1.48×10⁶·mL^-1，配方3、4的毒力约是配方18和16的60～77倍，也显著优于其它配方组合。因此，在配方3发酵培养基下摇瓶发酵产生的苏云金芽胞杆菌Bt20发酵液对2龄小菜蛾杀虫活性最强。该结果与菌株发酵液OD600(1/30)值统计结果基本一致，即配方3：（玉米粉3%，蝇蛆3.0%，黄豆粉3%，酵母粉2%）是苏云金芽胞杆菌Bt20的最佳发酵培养基。 

苏云金芽胞杆菌Bt20能利用多种氮源，以蝇蛆的利用效果最好，可代替工业上常用的鱼粉，可能是蝇蛆自身的氨基酸能更好的被苏云金芽胞杆菌Bt20吸收利用，并且蝇蛆的价格5000～7500元/吨，是鱼粉价格10300～10400元/吨的2/3，生产成本可降低33%，有利于大规模生产应用。