利用DArT标记技术分析三疣梭子蟹遗传多样性的方法

摘要

本发明公开了利用DArT标记技术分析三疣梭子蟹遗传多样性的方法，特点是包括三疣梭子蟹基因组代表性DNA片段文库构建的步骤；基因组代表性DNA芯片点制及在芯片上设置一系列阳性和阴性对照的步骤；提取不同地理种群三疣梭子蟹的DNA分别与基因组代表性DNA芯片杂交并清洗的步骤；最后杂交后采用芯片扫描仪进行扫描，并用LuxScan3.0软件提取数据，计算获得多态性效率、多态信息含量和遗传分型图谱，优点是可获得稳定并明确的遗传分型图谱，可应用于三疣梭子蟹遗传多态性检测、野生群体和家系识别、遗传图谱和指纹图谱构建等领域，具低成本、高效、稳定、准确的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种分析三疣梭子蟹遗传多样性的方法，尤其是涉及一种利用DArT标记技术分析三疣梭子蟹遗传多样性的方法。

背景技术

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)隶属甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹属(portunus)，是一种重要的大型海产经济蟹类，广泛分布于中国、日本、朝鲜及马来西亚群岛等海域，它具有肉质好、生长快、产量高等优点，经济价值高，养殖利润丰厚，随着海水养殖的快速发展，三疣梭子蟹养殖已成为各沿海地区的主导养殖品种。

目前，三疣梭子蟹养殖业的蟹苗主要还是依靠野生资源，由于环境恶化、病害和过度捕捞导致野生资源急剧下降，严重限制了养殖业的发展，因此迫切需要对野生资源进行保护，了解三疣梭子蟹的野生种群遗传结构，为开展优良、抗逆品种的选育提供科学依据，保持我国三疣梭子蟹养殖业的持续健康发展。据报道，同工酶、16S rRNA、线粒体DNA、COI、CR、ITS1基因片段序列分析、随机扩增多态性 DNA (RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、微卫星标记(SSR) 等技术均以广泛应用于研究三疣梭子蟹种群内和种群间、或与其他相近物种之间的遗传关系。但上述技术存在检测位点少、筛选周期长、自动化程度低，需已知基因组序列信息等缺点。

多样性芯片技术(Diversity Arrays Technology，DArT)是一种新遗传标记技术，综合了基因芯片、AFLP、PCR、分子克隆等技术，不需已知基因组序列，因此十分适合研究非模式生物。同时，它具有高通量和低成本的显著特点，较好地克服了以往跑电泳凝胶为主的标记技术产量低、成本高、耗时长、自动化程度低以及依赖核酸序列信息等缺点，是一种比较理想的遗传标记技术，已成功应用于水稻、大麦和木薯等多种农作物和细菌的遗传多样性和种质鉴定研究。但是，目前国内外还没有公开任何关于利用DArT标记技术分析三疣梭子蟹地理种群遗传多样性的方法的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效、稳定、准确的利用DArT标记技术分析三疣梭子蟹遗传多样性的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种利用DArT标记技术分析三疣梭子蟹遗传多样性的方法，包括以下步骤：

（1）三疣梭子蟹基因组代表性DNA片段文库构建

提取不同地理种群三疣梭子蟹的DNA并等量混合，将混合基因DNA采用限制性内切酶消化后，进行接头连接，连接产物作为模板进行后续PCR扩增，扩增产物纯化后，克隆至载体pMD19-T，转化大肠杆菌TOP10F’并涂布于含氨苄青霉素和X-gal的LB培养基上得到基因组代表性DNA文库；

（2）基因组代表性DNA芯片点制

从基因组代表性DNA文库中随机挑选单菌落，采用质粒载体上的通用引物M13F-47和M13R-48对插入的DNA片段进行PCR扩增，扩增产物用异丙醇沉淀后，采用微阵列芯片点样仪进行芯片点制，同时在芯片上设置一系列阳性和阴性对照；

（3）芯片杂交和清洗

提取不同地理种群三疣梭子蟹的DNA，分别采用限制性内切酶消化后，进行接头连接，连接产物作为模板进行后续PCR扩增，扩增产物用异丙醇沉淀后，加入试剂盒中进行Cy3荧光标记，于37℃孵育10min后，加入dNTPs 0.4μL，再于37℃孵育30min，加入0.1μL pH 8.0的EDTA终止反应，得到Cy3标记反应产物；其中酶切、接头连接及PCR扩增的具体过程同上述步骤（1）；   

采用pMD19-T载体多克隆位点片段为参考DNA并进行Cy5荧光标记，得到Cy5标记反应产物；将Cy3标记反应产物和Cy5标记反应产物各5.5μL等量混合后，再加入1μL的浓度为10g/L的鲑鱼精DNA和50μL ExpressHyb?杂交液混合后，96℃变性3 min，冰浴骤冷1min，得到Cy3-Cy5标记产物；

将步骤（2）得到的基因组代表性DNA芯片在紫外交联仪中250毫交交联备用，然后将基因组代表性DNA芯片与Cy3-Cy5标记产物在晶芯^?杂交仪中进行杂交反应，于65℃孵育过夜，杂交后先用0.3×SSC，0.1% SDS各清洗一次，再用0.06×SSC清洗两次，离心甩干；

（4）数据采集和分析

杂交后采用芯片扫描仪进行扫描，并用LuxScan3.0 软件提取数据，若对应的参考DNA杂交荧光强度较弱，则属于坏点，弃之；质量符合条件的探针，转换成0或1标记矩阵，计算获得多态性效率、多态信息含量和遗传分型图谱。

步骤（1）混合基因DNA采用限制性内切酶消化的具体步骤如下：采用Pst I 和TaqI双酶切体系进行酶切，Pst I和TaqI双酶切体系包括混合基因DNA 5μl，15U/μl的PstI内切酶 1μl，10U/μl TaqI内切酶 1μl，10×TaqI Basal buffer 2μl，加水至20μl，于37℃酶切2h。

步骤（1）接头连接的具体步骤如下：

a. 接头连接反应体系配置：50μM 的DArT-PstI接头引物1 1.28 μL，50μM的DArT-PstI接头引物2 1.28 μL，0.5M NaCl 2.00μL，加水至反应总体积为20μL，然后加热到95℃再降到室温；其中DArT-PstI接头引物1序列为5’-CACGATGGATC CAGTGCA-3’， DArT-PstI接头引物2序列为5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’；

b.取9 uL酶切后的产物与1 uL上述接头连接反应体系混合，然后加入10μL T4 DNA连接酶，于16℃，连接反应2h。

步骤（1）连接产物作为模板进行后续PCR扩增的具体步骤如下：取0.5μl连接完成的DNA模板，加入10×PCR Buffer 5μl；dATP、dCTP、dGTP和dTTP各浓度均为25mM的dNTP Mixture 7μl；5U/μl的Taq酶 0.5μl；10μM 的PstI引物 4μl，加水至反应总体积为50μl，PCR反应程序如下：94℃变性5 min后，以下程序重复35个循环，94℃变性30s，53℃复性30 s，72℃延伸1 min，循环结束后72℃延伸反应10min，其中PstI引物序列为5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’。

步骤（3）中Cy3荧光标记采用DecaLabel DNA标记试剂盒具体步骤如下：

1）DNA 模板 150ng，Y5片段1.0μL，含10碱基随机引物的5X缓冲液1.0μL，再加无核酸酶污染的水至总体积4.0μL，短暂离心3-5s，于PCR仪99℃ ，反应5-10min，然后快速置于冰上；

2）在步骤（1）得到的反应物4μL中加入混合物底物C（Mix C）0.6μL，25nmol的 Cy3-dCTP 0.2μL，大肠杆菌聚合酶I的大片断（Klenow fragment，exo-）0.3μL，振荡，短暂离心，于 37℃反应10min；

3）在步骤（2）得到的反应物5.1μL中加入2.5mM 的dNTPs 0.4μL，于37℃反应30min， 再加入0.1μL  EDTA（0.1M，pH 8.0）终止反应，得到Cy3标记反应产物。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了利用DArT标记技术分析三疣梭子蟹遗传多样性的方法，采用了Pst I/ Taq I复杂性降低方法，构建了三疣梭子蟹基因组代表性DNA文库，从中扩增获得基因组代表性DNA片段，用于点制多样性芯片，再通过杂交获得DArT标记（即质量符合条件的探针），重新点制多态性富集芯片，通过荧光信号强度转换获得0/1矩阵，从而分析各三疣梭子蟹地理种群遗传多样性，以期为三疣梭子蟹野生种群保护及选育提供资料。

综上所述，本发明采用高通量的DArT技术结合自创的反应体系及反应条件，可用于三疣梭子蟹遗传多样性分析，可获得稳定并明确的遗传分型图谱，将有助于三疣梭子蟹自然资源遗传多样性研究和开展优良品种选育工作，可应用于三疣梭子蟹遗传多态性检测、野生群体和家系识别、遗传图谱和指纹图谱构建等领域，具低成本、高效、稳定、准确的优点。

附图说明

图1为本发明实施例中5个三疣梭子蟹地理种群基因组DNA电泳图，M：1kb DNA ladder；A1：丹东，A2：烟台，A3：青岛，A4：连云港，A5：宁波；

图2为本发明实施例中5个三疣梭子蟹混合基因组DNA Pst I和Taq I酶切后电泳图；

图3为本发明实施例中连接反应后PCR扩增电泳图；

图4为本发明实施例中基因组DNA代表性文库插入片段电泳检测结果，1-24：随机选取的克隆；

图5为5个三疣梭子蟹地理种分别与多态性富集芯片杂交后获得的不同杂交图谱5；

图6为 5个三疣梭子蟹地理种群之间的遗传关系图。 

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例一

1.实验材料和试剂

本发明采用5个地理种群的三疣梭子蟹样品，分别取自我国由南到北的五个不同区域：丹东(DD)、烟台(YT)、青岛(QD)、连云港(LYG)、宁波(NB)，分别代表黄海的鸭绿江口种群；渤海的莱州湾种群；会场野生种群；海州湾种群；东海的舟山种群。以上5个种群都于2011年取样，所有样品壳平均长度11.51±1.22 cm，平均体重164.4± 19.7 g，雌雄比例1:1。活体运回实验室，取大螯于-80℃冰箱中保存备用。

大肠杆菌TOP10F’由实验室保存，PstI、TaqI 、T4 DNA连接酶购自Takara公司，氨苄青霉素、X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）、LB培养基、SSC、1kb DNA ladder和SDS购自上海生工生物工程公司，DecaLabel DNA Labeling Kit购自Fermatas公司，ExpressHyb? 杂交液购自Clontech公司，鲑鱼精DNA购自Sigma公司，Cy3-dCTP和Cy5-dCTP购自GE公司。

 2.基因组代表性DNA片段文库构建

采用酚-氯仿法提取不同地理种群三疣梭子蟹的DNA并等量混合，将混合基因DNA采用限制性内切酶消化后，进行接头连接，连接产物作为模板进行后续PCR扩增，扩增产物纯化后，克隆至载体pMD19-T，转化大肠杆菌TOP10F’并涂布于含氨苄青霉素和X-gal的LB培养基上得到基因组代表性DNA文库，具体步骤如下：

2.1三疣梭子蟹基因组DNA抽提

1）称取100mg三疣梭子蟹肌肉组织，转入1.5ml离心管中，加入500μL TE缓冲液，剪刀剪碎，然后加入20μl 20%SDS，5μl 蛋白酶K，5μl RNA酶，混匀，55℃水浴2h；   

2）再加入100μl NaCl（5M）混匀，加入80μL CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）/NaCl混匀，65℃水浴10min；

3）冷却后，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液（氯仿：异戊醇为24:1），12000rpm，离心5min；

4）吸上清，装入一新的EP管，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液(酚：氯仿：异戊醇为25:24:1)，混匀，12000rpm，离心5min，重复该步骤1次；

5）吸上清，转入一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，混匀，室温放置15min，沉淀DNA，然后于4℃，12000rpm，20min弃上清；

6）向离心管中加入75%的乙醇洗涤2-3次，置于吸水纸上倒置晾干；

7）加入ddH₂O（10-20μl）溶解，-20℃保存备用；

8）将上述获得的不同地理种群三疣梭子蟹基因DNA等量混合，然后进行电泳检测，结果如图1所示，本发明中5个三疣梭子蟹基因组DNA完整，纯度高，无RNA污染。

2.2 混合基因组DNA双酶切

取2.1步骤得到的混合基因DNA 5μl（各地理种群三疣梭子蟹基因DNA各1μg）采用Pst I 和TaqI双酶切体系进行酶切，于37℃反应2h，Pst I 和TaqI双酶切体系各成分组成如下表1所示：

                表1 Pst I 和TaqI双酶切体系组成

将Pst I和Taq I完全酶切后的产物进行电泳检测，结果如图2所示，说明酶切完全。

 2.3 接头连接

1）接头连接反应体系配置

DArT-PstI 连接引物1和DArT-PstI 连接引物2 都配成贮存液浓度为50μM，连接反应体系各成分组成如下表2所示，

表2 连接反应体系组成

注：将上述连接反应体系加热到95℃后再降到室温。其中DArT-PstI 连接引物1序列为5’-CACGATGGATC CAGTGCA-3’， DArT-PstI连接引物2序列为5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’；

  2）接头连接反应条件

取9 uL 2.2步骤中得到的酶切产物与1μl上述接头连接反应体系混合，然后加入10 uL T4 DNA连接酶（350U/μl），于16℃，连接反应2h。

2.4 PCR扩增反应

PCR扩增反应体系各成分组成如下表3所示：

表3 PCR扩增反应体系组成

PCR反应程序如下：94℃变性5 min后，以下程序重复35个循环，94℃变性30s，53℃复性30 s，72℃延伸1 min，循环结束后72℃延伸反应10min，以保证获得全长产物。PCR扩增产物经1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，说明PCR产物大小在250bp以上。

 2.5 PCR产物过柱纯化

用CHROMA SPIN ^TM Columns纯化，具体方法如下：

1）取出1个CHROMA SPIN Column，颠倒数次使凝胶基质完全重悬；

2）拧掉底部裂痕处，将其放入提供的2ml离心收集管中；

3）700×g 离心5min，管内混合物呈半干燥状态；

4）从转子中取出离心管，弃掉离心管和buffer；

5）将CHROMA SPIN Column放入第二个2ml 离心管中；

6）缓慢的将PCR产物加入混合物截面中间，不要让样品贴近管壁；

8）700×g 离心 5min；

从转子中取出离心管，纯化样品就在离心管底部。

 2.6克隆至载体pMD19-T，转化大肠杆菌TOP10F’

1)纯化PCR产物与载体pMD19-T连接

 取14μl步骤2.5纯化得到的PCR产物(沉淀后产物)，加入1μL pMD19-T 和5μL T4 DNA连接酶，于16℃连接反应2h；

2)接种-80℃长期保存的菌株TG1到5 ml LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜(12 h左右)；

3)然后按1:100稀释到新鲜的LB液体培养基中，继续37℃摇床培养2h；

4)取出菌液置冰上10 min，将冰冷的菌液1 ml/管分装到1.5 mL的Eppendorf管，5,000 g离心1 min，弃上清；

5)沉淀用200μl预冷的0.1 mol/L CaCl₂悬浮，冰浴30 min后离心(5,000 g) 1 min，弃上清，沉淀再用100μl 0.1 mol/L CaCl₂重悬浮，冰浴放置24-48h备用；

6)取10μl步骤2.6.1得到的连接产物加到100μl感受态细胞TG1中，冰浴放置30 min；

7)再42℃水浴90s，立即转移到冰上冷却数分钟；

8)加入冰预冷的LB培养液(每升含10 g胰蛋白胨，5 g酵母抽提物，10 g NaCl，pH 7.0)890μl后37℃摇床低速培养1 h；

9)取100 μl涂布于含氨卞青霉素（50-100μg/ml）的LB平板(液体LB培养基中添加1.5 %琼脂粉，预先涂布X-gal和IPTG)，37℃过夜培养(10-14h)；

10)筛选白色菌落置1 ml含氨卞青霉素（50-100 mg/ml）的LB培养液，在37℃培养8-12h，随机挑取10000个克隆，得到基因组代表性DNA片段文库。

上述所得基因组代表性DNA文库滴度≥10⁵，如图4所示，阳性克隆平均插入片段长度>500bp，符合DArT芯片点制要求。

 3 基因组代表性DNA芯片点制

从随机挑取的2500个基因组代表性DNA文库中随机挑选单菌落，采用质粒载体上的通用引物M13F-47和M13R-48对插入的DNA片段进行PCR扩增，扩增产物用异丙醇沉淀后，采用晶芯? SmartArrayer^TM 48微阵列芯片点样仪进行芯片点制成基因组代表性DNA芯片，每个点重复3次，同时在芯片上设置一系列阳性和阴性对照。

4 芯片杂交和清洗

4.1 各地理种群代表性基因组DNA片段获得

将各地理种群基因组DNA(50ng) 分别用Pst I和Taq I进行酶切消化后，在T4 DNA连接酶作用下， DNA酶切片段与Pst I特异性接头连接，连接产物作为模板进行后续PCR扩增，操作及反应程序如上述2.1、2.2、2.3、2.4所述。

4.2 各地理种群代表性基因组DNA片段分别进行Cy3荧光标记

各地理种群代表性基因组DNA片段分别用1倍体积异丙醇将DNA样品浓缩10倍，变性后用DecaLabel DNA标记试剂盒进行Cy3荧光标记，Cy3荧光标记具体步骤如下：

1）DNA 模板 150ng，Y5片段 1.0μL，含10碱基随机引物的5X缓冲液1.0μL，再加无核酸酶污染的水至总体积4.0μL，短暂离心3-5s，于PCR仪99℃ ，反应5-10min，然后快速置于冰上；

2）在步骤（1）得到的反应物4μL中加入混合底物C（Mix C） 0.6μl，Cy3-dCTP(25nmol) 0.2μl，大肠杆菌聚合酶I的大片断（Klenow fragment，exo-）0.3μL，振荡，短暂离心，于 37℃反应10min；

3）在步骤（2）得到的反应物5.1μl中加入dNTPs（2.5mM）0.4μl，于37℃反应30min， 再加入0.1μl EDTA（0.1M，pH 8.0）终止反应，得到Cy3标记反应产物。

4.3 参考DNA进行Cy5荧光标记

采用pMD19-T载体多克隆位点片段为参考DNA并进行Cy5荧光标记，得到Cy5标记反应产物。

4.4 Cy3-Cy5标记产物制备

将Cy3标记反应产物和Cy5标记反应产物等量(各5.5μl)混合后，再加入1μL的浓度为10g/L的鲑鱼精DNA和50μL ExpressHyb?杂交液混合后，96℃变性3 min，冰浴骤冷1min，得到Cy3-Cy5标记产物。

 4.5 芯片杂交和清洗

将基因组代表性DNA芯片在紫外交联仪中进行预处理，具体步骤如下：

1）将扫描芯片点有DNA的一面在60℃水浴锅上水合10s，芯片距离水面2-3cm，在空气中室温自然干燥，再进行一次水合；

2）点有DNA一面朝上，放在紫外交联仪中250毫交交联；

3）将芯片放在42℃预热的0.5%SDS中清洗10min，水平摇床80rpm；

4）将芯片放在42℃预热的蒸馏水中清洗4-5min，水平摇床80rpm；

5）将芯片放在42℃预热的无水乙醇中清洗1-2min，水平摇床80rpm；

6）芯片离心甩干 1500rpm 1min；

然后将经处理的基因组代表性DNA芯片与Cy3-Cy5标记产物在晶芯^?杂交仪中进行杂交反应，于65℃孵育过夜，杂交后先用0.3×SSC，0.1% SDS各清洗一次，再用0.06×SSC清洗两次，离心甩干。

5数据提取及处理

杂交后采用晶芯? LuxScan^TM 10K-A 双通道激光共聚焦扫描仪进行扫描，并用LuxScan3.0 软件提取数据，若对应的参考DNA杂交荧光强度较弱，则属于坏点，弃之；质量符合条件的探针，其对应的荧光强度按照log[cy3target/cy5reference]进行计算并均一化，利用模糊C-均值聚类分析法(模糊度为1.5)及方差分析获得0或1标记矩阵，计算获得多态性效率、种群间的相对遗传距离、遗传相似性系数和遗传分型图谱。

多态性富集芯片中探针对应的结果必须满足：在90%的芯片中置信水平P>0.95(赋值概率采用聚类算法)；符合前述条件时，在某张芯片上如果P<0.95则标记为缺失(×)。

上述过程获得313个质量符合条件的探针，多态性效率为12.5%，将313个多态性标记（即探针）重新点制成多态性富集型DArT芯片，每个点重复3次，杂交显示Q>71%，call rate>93.5%，不一致性(discordance)<0.01，符合质量标准。313个候选多态性标记的多态信息含量(polymorphism information content, PIC)介于0.32到0.48，中间值为0.40，较高于随机选择的双等位基因位点的多态信息含量。该芯片共35行、27列，每个DArT标记重复3次，每个点的位置用“行标-列标”表示。其中1-1～1-3为HEX探针结合质控，1-4～1-18为阴性质控，1-19～1-21为阳性质控，1-22～1-27为空白，35-22～35-27为三疣梭子蟹阳性探针。

如图5所示，5个三疣梭子蟹地理种分别与多态性富集芯片杂交，获得5个不同的杂交图谱（分别为丹东(DD)、烟台(YT)、青岛(QD)、连云港(LYG)、宁波(NB)）。杂交结果显示，每个样品的图谱不同，说明他们遗传结构不同。

 具体实施例二

来自于上述5个三疣梭子蟹野生种群Pst I/Taq I代表性片段（见上述实施例4.2所示）再次与多态性富集DArT芯片杂交，并重复一次。依据上述数据处理原则，获得稳定的0/1矩阵。采用PHYLIP 3.695软件的RESTDIST和NEIGHBOR程序，根据313个Pst I/ Taq I多态性标记用Nei/Li方法计算遗传距离并构建非加权组平均法(UPGMA))系统发生图，用SEQBOOT程序进行bootstrap分析，分叉处数值表示1,000次重复抽样所得到的置信度百分比，只显示置信度50%以上的数值。如图6系统进化树所示，其显示了5个三疣梭子蟹地理种群之间的遗传关系，其中青岛和连云港的种群最先成簇，再与宁波种群成簇，这可能是由于青岛和连云港都属于黄海，宁波位于东海，黄海和东海两个水域之间存在基因交流。 

重复性验证先采用不同生长阶段和不同环境的宁波地区三疣梭子蟹样品制备6份Pst I/Taq I代表性片段（见上述实施例4.2所示），每份样品重复杂交一次。这个基因型杂交call rate为98%。重复实验中两次赋值结果一致性为99.1%，绝大部分(96%)DArT标记在不同的样品杂交结果中赋值相同。其余4%在6个样品杂交中结果不同，这可能是由于发育或环境造成了基因组甲基化不同。这些DArT标记显然不适合包含在基因分型芯片中。另外，重复性验证还采用同一样品不同个体的代表性DNA片段进行杂交。3个样品，每个样品2个个体。结果显示，同一样品不同个体间的差异不显著，两个个体之间差异在0.7%-1.6%之间，这是个体遗传异质性造成的。

综上所述，本发明采用DArT技术结合自创的反应体系及反应条件，对三疣梭子蟹地理种群遗传多样性分析，可获得高效、稳定、准确的遗传分型图谱，将有助于三疣梭子蟹自然资源遗传多样性研究和开展优良品种选育工作。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。