利用微生物拮抗作用清除滴灌系统灌水器堵塞的方法

摘要

本发明公开了利用微生物拮抗作用清除滴灌系统灌水器堵塞的方法。本发明提供了一种清除滴灌系统灌水器堵塞的方法，包括如下步骤：1）将用于灌溉的水源进行膜过滤，收集固体颗粒物，分离纯化所述固体颗粒物中的微生物，选取丰度最高的菌种，为诱发堵塞关键菌；2）将所述诱发堵塞关键菌与农用微生物菌进行拮抗反应，选择与所述诱发堵塞关键菌有拮抗作用的农用微生物菌作为拮抗菌；所述农用微生物菌为枯草芽孢杆菌、防病促生芽孢杆菌或内生芽孢杆菌；3）将所述拮抗菌加入灌溉水中，施加到堵塞处进行反应，再冲洗反应后滴灌管，实现清除滴灌系统灌水器堵塞。本发明优点：加拮抗菌剂后，对系统进行冲洗，可有效将脱落的堵塞物质排出系统外。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用微生物拮抗作用清除滴灌系统灌水器堵塞的方法。

背景技术

灌水器是滴灌系统最关键的部件，其作用是使有压水流通过其内部的狭长流道或微孔充分消能后，以均匀、稳定的小流量滴入土壤。但也正是由于灌水器消能的需要，流道尺寸一般只有0.5～1.2mm左右，水中的悬浮物、溶解盐、化学沉淀、溶解性有机物、微生物等杂质都极易引起灌水器的堵塞，灌水器堵塞问题已成为制约滴灌技术应用、推广的主要障碍，它解决的好坏直接决定着滴灌工程的使用寿命和应用效益。目前，大量的科研学者研究通过合理配置过滤设备、以及灌水器流道优化设计等多方面来解决系统堵塞问题，取得了一些较有意义的成果，但堵塞问题依然未能得到很好地解决，主要原因在于对灌水器堵塞的机理还缺乏深入、系统的认识。

最新研究报道显示：滴灌系统的堵塞与灌溉系统内生物膜的形成、生长有着密切的关系，其过程为灌溉水源中微生物首先在滴灌系统毛管内部固定形成生物膜，并不断摄取、消耗水中的底物和营养物进行新陈代谢，分泌大量的胞外多聚物，并依靠胞外多聚物的粘性不断吸附微生物及固体悬浮颗粒物，引起生物膜不断形成、生长与脱落以及堵塞沉积物的不断聚集，最终导致灌水器堵塞，生物膜是灌水器堵塞产生的初始条件及诱发因素。因此，采取有效措施抑制生物膜生长，促进生物膜脱落并及时将生物膜排出系统成为解决灌水器堵塞问题的关键。所以研究通过抑制滴灌系统内生物膜形成的生物堵塞具有重要意义。国内外广大研究人员对解决滴灌系统灌水器堵塞问题给予了广泛关注，相关专家学者也提出了防治滴灌灌水器堵塞的相关专利：中国农业科学院农田灌溉研究所高胜国等（授权公告号：CN202168387）公开了滴灌系统抗生物堵塞装置，借助臭氧发生器，有效杀死流道内微生物。但其结构相对复杂，成本较高，长时间使用会对土壤群落结构甚至土壤健康质量产生一定的影响，不适宜在大田普遍推广应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种清除滴灌系统灌水器堵塞的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤:

1）将引起堵塞的且用于灌溉的水源进行菌种分析，选取丰度最高的菌种，为诱发堵塞关键菌；

2）选择与所述诱发堵塞关键菌有拮抗作用的农用微生物菌作为拮抗菌；所述农用微生物菌为对农田作物无害的农用微生物菌；

3）将所述拮抗菌加入灌溉水中，施加到堵塞处进行反应，再冲洗反应后灌水器，实现清除滴灌系统灌水器堵塞。

上述方法中，步骤3）中，所述拮抗菌按照终浓度为10⁷-10⁹CFU/mL加入灌溉水；

所述施加的方式为两天一次、所述施加次数为两次，所述每次施加时间为10-15min；每施加一次后冲洗一次；

所述反应时间为24h；

所述冲洗的流速为0.45±0.05m/s，所述冲洗的时间为5-10min；

所述拮抗菌以菌株或者菌剂形式加入灌溉水。

上述方法中，步骤1）中，所述菌种分析为将所述引起堵塞的且用于灌溉的水源进行膜过滤，收集固体颗粒物，分离纯化所述固体颗粒物中的微生物，选取丰度最高的菌种，为诱发堵塞关键菌；

步骤2）中，选择与所述诱发堵塞关键菌有拮抗作用的农用微生物菌作为拮抗菌的方法包括如下步骤：将所述诱发堵塞关键菌与所述农用微生物菌进行拮抗反应，选择与所述诱发堵塞关键菌有拮抗作用的农用微生物菌作为拮抗菌。

上述方法中，步骤1）中，所述膜过滤采用膜孔径为0.1-0.2μm的微滤膜；

所述分离纯化采用的培养基为LB培养基，培养温度为37度；

步骤2）中，所述拮抗反应包括如下步骤：将所述诱发堵塞关键菌与所述农用微生物菌进行平板拮抗，选取与所述诱发堵塞关键菌具有拮抗作用的农用微生物菌A。

上述方法中，步骤2）中，在所述平板拮抗后还包括如下步骤：将所述农用微生物菌A与所述诱发堵塞关键菌用Biolog生态板进行拮抗反应，选取与所述诱发堵塞关键菌具有拮抗作用的农用微生物菌A作为拮抗菌。

上述方法中，所述引起堵塞的且用于灌溉的水源为CASS工艺处理后的生活污水，在本发明的实施例中，用于灌溉的水源为北京市昌平区北七家污水处理厂的生活污水经过CASS工艺处理得到的再生水。

所述诱发堵塞关键菌为Arcicella.sp；

所述拮抗菌为内生芽孢杆菌或内生芽孢杆菌菌剂或抗重茬菌剂；

内生芽孢杆菌或内生芽孢杆菌菌剂或抗重茬菌剂在清除滴灌系统灌水器堵塞中的应用也是本发明保护的范围。

内生芽孢杆菌菌剂（也称为绿康微经济类作物菌剂），购自中农绿康(北京)生物技术有限公司；

抗重茬菌剂（广谱），购自中农绿康(北京)生物技术有限公司。

本发明的实验证明，本发明具有如下优点：（1）高效性：本发明直接锁定诱发灌水器堵塞的微生物，提出了以控制生物膜形成、生长为目标的滴灌灌水器堵塞的生物加拮抗菌剂并配合管道冲洗清除方法。通过在滴灌系统中通入含有拮抗菌剂的水，可有效抑制堵塞物质的生长，促进其脱落。加拮抗菌剂后，对系统进行冲洗，可有效将脱落的堵塞物质排出系统外，大大减小灌水器堵塞风险。

（2）经济性：发现的两种菌剂价格低廉，通过采用这种方法清除灌水器堵塞，可以有效延长滴灌带使用期1-2年，降低了滴灌系统的总体投资。

（3）环保性：应用此发明清除灌水器堵塞，不会对植物、土壤及地下水环境有任何危害，而且这两种菌剂还可以控制植物的某些疾病，有一举两得的效果，是一种解决灌水器堵塞问题的环境友好型方法。

（4）可操作性：通过滴灌系统首部的施肥罐可将拮抗菌剂施加到灌溉水中，进而达到解决灌水器堵塞的目标，不需要任何其他附加装置，操作简便。

附图说明

图1为本发明工作流程图

图2为菌剂拮抗试验部分灌水器流量变化图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的思路：本发明利用微生物拮抗原理，寻求诱发灌水器堵塞的关键菌群的拮抗微生物来抑制微生物活性、粘性分泌物以及生物膜的生长，进而降低生物膜与灌水器壁面粘附力，进而增强生物膜的可脱落性，从而达到清除灌水器堵塞的目的。在生物膜微生物群落生物化学组分分析尤其是细菌种类的初步研究基础上，培养、分离、筛选出诱发堵塞关键菌；选用拮抗性较好的微生物菌剂。进行诱发堵塞关键菌和微生物菌剂中优势菌之间的拮抗试验，并对筛选出的拮抗菌剂进行验证试验，以此确定适合抑制诱发堵塞关键菌生长的菌剂。将成功筛选的菌剂，以不同的施用模式（不同的施用浓度、时间、频率）进行滴灌试验，最终确定相对高效的施用模式。

唯一碳源利用方法由美国BIOLOG公司于1989年开发成功，最初应用于纯种微生物鉴定。其载体是BIOLOG公司生产的微孔板，微孔板为96孔，其中95个孔中加入了95种单一的不同碳源和四唑染料，另外一个孔未加碳源作为对照。根据不同的用途，BIOLOG公司生产了加入不同碳源的多种微孔板，这其中用于群落多样性分析最多的是革兰氏阴性板（GN）和生态板（Eco）。其中Eco板是专门为群落分析而设计，每个板上只有31种碳源，设置了3个重复。分析时将处理过的微生物菌液接种到微孔板的孔中后，孔中的生物就可能利用其中的碳源发生氧化还原作用，而孔中一旦有电子转移，四唑染料就会变为紫色，再根据颜色反应的深浅读出每孔的OD值，以获得不同孔中碳源被接种到其中的微生物所利用的程度。最后运用多变量统计分析方法来分析微生物群落产生的代谢多样性类型及其变化。

下述实施例中如无特殊说明，所用液体培养基均为LB液体培养基，所用的固体培养基均为LB固体培养基。

实施例1、清除滴灌系统灌水器堵塞的方法

图1为本发明工作流程图。

一、诱发堵塞关键菌提取

1、固体颗粒物提取

将用于灌溉的水源（北京市昌平区北七家污水处理厂的生活污水经过CASS工艺处理得到的再生水）微滤膜（膜孔径为0.2μm）进行过滤，收集固体颗粒物；

2、分离纯化固体颗粒物中的微生物

对上述1得到的固体颗粒物进行分离纯化，采用纯培养的方法，具体如下：

将收集的固体颗粒物加入到100ml已经高压高温灭菌的LB液体培养液中，在常温（25度）摇床上24小时培养（转速为60r/min），得到固体颗粒物中的微生物菌群；

将微生物菌群先用水稀释1000倍，均匀涂布在固体LB平板上，在37度恒温微生物培养箱中培养24小时；再挑取单菌落在新的LB平板不断划线37度培养，共获得100个纯培养菌。

将纯培养菌均提取基因组DNA，采用Roche454GS Junior测序仪（罗氏公司）和配套的GS FLX反应体系试剂盒对DNA片段进行细菌16S rRNA的高通量测序（通用引物：338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；907R：CCGTCAATTCMTTTGAGTTT；M为简并序列）。

测序结果在MG-RAST序列比对数据库网站（实际应用中，也可使用MEGAN、RDP

classifier、NIH Blast等本地软件）进行菌群数据库比对和物种注释，获得样本的菌群结构，即各门/属/种的细菌分别测出哪些，各自的测序读取次数（reads数目）以及各自的读序次数占样本测序读取总次数的百分比（相对丰度）。

结果从纯培养菌中选取相对丰度最高的菌种（15%）为诱发堵塞关键菌，为Arcicella.sp。

二、拮抗菌剂的选择

本发明选用三种无公害的农用微生物菌剂与诱发堵塞关键菌进行拮抗试验：

枯草芽孢杆菌菌剂（也称为多肽植物素肥料），购自北京世纪阿姆斯生物技术股份有限公司，产品编号：AMMS0602，有效菌种枯草芽孢杆菌；

内生芽孢杆菌菌剂（也称为绿康微经济类作物菌剂），购自中农绿康(北京)生物技术有限公司；

抗重茬菌剂（广谱），购自中农绿康(北京)生物技术有限公司。

1、平板拮抗试验

1）、候选拮抗菌剂培养

分别将适量枯草芽孢杆菌菌剂、抗重茬菌剂、内生芽孢杆菌菌剂接种到100ml灭菌的LB液体培养基中，放入37度恒温摇床上24小时培养，得到枯草芽孢杆菌菌液、抗重茬菌菌液、内生芽孢杆菌菌液。

2）、平板拮抗

将农用微生物菌的枯草芽孢杆菌菌液、抗重茬菌菌液、内生芽孢杆菌菌液分别与上述一得到的诱发堵塞关键菌进行平板拮抗筛选，即在平板中间涂诱发堵塞关键菌，以中间诱发堵塞关键菌株为圆心，在平板边缘涂农用微生物菌。观察二者的生长情况确定菌株是否具有拮抗性。

经过筛选，确定对诱发堵塞关键菌具有拮抗作用的农用微生物菌有：内生芽孢杆菌剂。

2、利用Biolog生态板验证农用微生物菌的拮抗性

下述实验的农用微生物菌采用上述1中确定的与诱发堵塞关键菌相互拮抗的农用微生物菌：内生芽孢杆菌。

①分别在LB培养基中培养诱发堵塞关键菌、抗重茬菌剂和内生芽孢杆菌菌剂，同时间放入37度恒温摇床上24小时培养，得到诱发堵塞关键菌菌液、抗重茬菌菌液、内生芽孢杆菌菌液。

②分别取5ml诱发堵塞关键菌菌液、抗重茬菌菌液、内生芽孢杆菌菌液离心（转速16000/min；10min）取上清液，稀释1000倍，加入到BIOLOG-Eco板中；

再将诱发堵塞关键菌菌液、抗重茬菌菌液、内生芽孢杆菌菌液等体积混合，稀释1000倍，注入到BIOLOG-Eco板中。

③生态板每隔12小时测试一次，利用自动测试仪器测试碳源利用情况。用AWCD（average well color development）值来反映微生物群落对微孔板上碳源的利用情况，计算公式如下：

AWCD=∑(C-R)/n

其中C为每一个孔里的颜色变化（光密度），R为微孔板上空白孔的光密度，n为碳源的数量。

④分析AWCD（average well color development）值，确定菌拮抗性。

通过分析发现内生芽孢杆菌、抗重茬菌菌液、诱发堵塞关键菌混合使用对碳源的利用程度都要小于单独使用菌时对碳源的利用，可以得出，抗重茬菌剂、内生芽孢杆菌剂对诱发堵塞关键菌的生长有抑制作用。

综合以上两种筛选办法，选取抗重茬菌剂、内生芽孢杆菌剂均可作为拮抗性菌，用以清除再生水滴灌系统灌水器生物堵塞。

三、施加拮抗菌剂配合管道冲洗清除灌水器堵塞

1、清除堵塞

1）施加菌剂

将适量内生芽孢杆菌菌剂（也称为绿康微经济类作物菌剂，购自中农绿康(北京)生物技术有限公司）接种到液体LB培养基中，37度培养24h，得到内生芽孢杆菌菌液；将内生芽孢杆菌菌液以终浓度为10⁹CFU/mL加入灌溉水中，通过施肥罐施加到堵塞处进行反应。

内生芽孢杆菌菌剂施加模式为每两天一次，连续施加两次，每次施加时间为15min。

2）冲洗管道

在每次施加内生芽孢杆菌后，待拮抗菌剂反应24h后，对滴灌管用水冲洗，冲洗流速为0.45m/s，冲洗时间为10min。

施加拮抗菌剂后，脱落的堵塞物质会增加灌水器堵塞风险，需及时排出系统，即需对系统进行冲洗。

2、检测

清除堵塞后通水，在不同的通水时间持续观测该灌水器的流量动态变化过程，从而判断堵塞清除效果。

通过称重法每天测量灌水器的出水重量进而得出其流量：流量=出水重量/（出水时间×水密度）。

相对额定流量=（堵塞灌水器的流量/未堵塞灌水器的流量）×100%

堵塞清除效果如图2所示，a、b、c、d分别代表四个堵塞灌水器，可以看出，绝大多数已堵塞灌水器的流量恢复至最初额定流量，其余灌水器堵塞程度也有较大改善，可恢复至额定流量的70%以上。

抗重茬菌剂按照上述方法试验，结果无显著差异，也可以达到疏通灌水器的作用。