一种水母溶血毒素粗提物的制备方法

摘要

本发明涉及海洋生物技术领域，本发明提供了一种水母溶血毒素粗提物的制备方法，以鲜活水母口腕为原料，利用物理刺激方法，通过短时剧烈振荡来激发刺丝囊，使得多数刺丝囊集中发射，排出囊中毒液，然后离心收集上清，粗提水母溶血毒素。本发明的方法操作简便、耗时较现有技术缩短2-3天，非毒素类杂质蛋白引入少且不含心血管活性，而溶血活性更强，有利于溶血组分的进一步纯化。

说明书

技术领域

本发明涉及海洋生物技术领域，具体涉及一种水母溶血毒素粗提物的制备方法。 

背景技术

水母毒素是一类毒性强烈的肽类毒素，具有心血管、溶血、神经、肝脏、皮肤与肌肉、蛋白酶等多重生物活性，是导致水母蜇伤系列症状的主要原因。 

溶血毒素是水母毒素的重要组分，是研究报道最多的一类水母毒素，其丰度较高，在水母捕食、防御过程中发挥重要作用，具有较高的研究价值。 

由于水母毒素具有热不稳定、易粘附等特点，加之用于分离纯化的毒素粗提物制备方法的局限性，水母溶血毒素成分的纯化和鉴定工作进展较慢，总体上滞后于其他常见有毒生物溶血毒素。 

水母毒素粗提物制备主要有两种方法：一种是以水母口腕部组织（触手、口腕的混合物）为原料，利用水母组织易自溶的特点，低温（4℃）下搅拌自溶3-4天，离心收集上清经透析即为毒素粗提物（Xiao L,He Q,Guo Y,et al.,Cyanea capillata tentacle-only extract as a potential alternative of nematocyst venom:Its cardiovascular toxicity and tolerance to isolation and purification procedures[J].Toxicon.2009,53(1):146–152）；另一种是切取水母触手、口腕或整个口腕部组织，低温自溶3-4天后，离心收集沉淀，洗涤沉淀并收集其中的刺丝囊，再通过超声或研磨破碎刺丝囊，离心收集上清经透析后为毒素粗提物样品（Marino A,Crupi R,Rizzo G,Morabito R,Musci G,La Spada G.2007.The unusual toxicity and stability properties of crude venom from isolatednematocysts of Pelagia noctiluca(Cnidaria,Scyphozoa).Cell Mol Biol(Noisy-le-grand).53Suppl:OL994-1002.）。 

综上所述，这两种方法均需经过组织自溶，耗时较长。前者操作相对简易，但必然引入大量非毒素类组织蛋白；后者所制毒素粗提物较前者纯净，但操作环节较多，期间刺丝囊发射率高、损耗大，所获毒素蛋白量很小。总的来说，这两种制备水母毒素粗提物的方法均存在局限性，难以满足后续毒 素组分离纯化的需要。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简便、耗时较短、杂质较少且活性更强的水母溶血毒素粗提物的制备方法。 

本发明的主要技术方案是：以鲜活水母口腕（不含触手）为原料，利用物理刺激方法，通过短时剧烈振荡来激发刺丝囊，使得多数刺丝囊集中发射，排出囊中毒液，然后离心收集上清，粗提水母溶血毒素的方法。 

本发明提供了一种水母溶血毒素粗提物的制备方法，包括以下步骤：A、以鲜活水母不含触手的口腕组织为原料，加入PBS（Phosphate Buffer Solution，磷酸盐缓冲液）清洗； 

B、振荡：加入与步骤A的口腕组织等体积的PBS，在涡旋振荡器上以转速2000-3200rpm，最优为3200rpm，振荡1-5min，最优为2min； 

C、过滤：步骤B得到的内容物以100-500目，最优为300目筛网过滤，收集滤液； 

D、透析：步骤C得到的滤液置于截留分子量为1000Da透析袋中，4℃下用预冷的PBS透析6-24h，最优为8h，然后4℃下3000-10000×g离心10-30min，最优为10000×g离心10min，收集上清液，即得水母溶血毒素粗提物。 

所述的步骤A中，挑选有活力、口腕发达的水母个体，以尼龙丝手抄网捕捞，捕捞的鲜活水母置于盛有海水的容器中，直至其恢复自然活动形态；分离不含触手的口腕组织，剪取口腕组织，分装到离心管中。 

所述的步骤A中，加入与口腕组织等体积的PBS，摇动离心管，将上层清洗液倾尽。 

上述步骤中，PBS缓冲液是指磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Solution）。 

上述步骤中，预冷的PBS缓冲液中的预冷为常规技术，最优的为：使用的PBS缓冲液需经过孔径为0.20μm的微孔滤膜过滤，于4℃预冷。 

本发明的方法操作简便、耗时较现有技术缩短2-3天，非毒素类杂质蛋白引入少且不含心血管活性，而溶血活性更强，有利于溶血组分的进一步纯化。 

附图说明

图1是本发明的方法与自溶法所制水母毒素粗提物SDS-PAGE电泳图； 

图2是本发明的方法与自溶法所制水母毒素粗提物溶血活性比较； 

图3是本发明的方法与自溶法所制水母毒素粗提物心血管活性比较。 

具体实施方式

现结合附图和实施例，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

实施例1 

本发明的方法（简称快速法）制备水母溶血毒素粗提物 

PBS配制：称取8g NaCl、0.2g KCl、3.63g Na₂HPO₄·6H₂O和0.24g KH₂PO₄，溶于900mL蒸馏水中，用盐酸调节pH值至7.4，加蒸馏水定容至1L，最后用孔径为0.20μm的微孔滤膜过滤，于4℃预冷。 

1．水母采集：发形霞水母（Cyanea capillata）采自浙江省舟山市嵊泗县。挑选活力较好且口腕发达的水母个体，以手抄网捕捞。首先将捕获的水母放入盛有海水的水箱中静置10min，待其恢复自然活动状态。 

2．口腕分离：剔除口腕处杂质，仔细区分触手和口腕等不同组织，准确剪取口腕，置于50ml离心管中，每管新鲜口腕组织约20ml。 

3．清洗：加入20mlPBS，轻柔摆动离心管清洗口腕组织，将上层清洗液轻轻倾尽。 

4．振荡：加入20ml PBS，于涡旋振荡器上以转速3200rpm连续振荡2min。 

5．过滤：管中内容物以300目筛网过滤2次，收集滤液。 

6．透析：将滤液置于1000Da透析袋中，4℃下用预冷的PBS透析8h，然后4℃下10000×g离心10min，收集上清液，即为快速法所制水母溶血毒素粗提物。 

实施例2 

现有技术的自溶法制备水母毒素粗提物 

发形霞水母采自浙江省舟山市嵊泗县。取口腕部组织（触手、口腕的混合物）100g，加入等体积预冷的3.34％人工海水100mL，自溶4天，磁力 搅拌器每日搅拌2次，每次10min；100目细胞筛网过滤3次，滤液10000×g离心3次，每次10min，收集上清液；将上清液置于截留分子量为1000Da的透析袋中，4℃下用预冷的PBS透析8h，然后4℃下10000×g离心10min，上清液即水母毒素粗提物（TE,tentacle extract）。（人工海水配制：称取NaCl 28g，MgCl₂·6H₂O 5g，KCl 0.8g，CaCl₂1.033g，加蒸馏水至1L，混匀后用孔径为0.20μm的微孔滤膜过滤，于4℃预冷。） 

实施例3 

自溶法与快速法所制水母毒素粗提物比较 

1、蛋白质纯度比较 

将快制法和自溶法所制毒素粗提物及蛋白分子量标准参照物（Marker）进行SDS-PAGE电泳，分别采用5％积层胶和12％分离胶，单孔上样20μl（蛋白总量20μg），积层胶和分离胶电压分别采用80v和160v，电泳结束后以考马斯亮蓝G250快速染色20min，0.25mol/L KCl溶液脱色至底色透明。 

结果如图1所示，与自溶法相比，快速法所制水母溶血毒素粗提物中高丰度的大分子量组织蛋白含量明显减少，提示本发明方法能有效降低非毒素类杂质蛋白的引入，利于后续的毒素分离纯化。 

2、溶血活性比较 

麻醉雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（购自第二军医大学实验动物中心）尾静脉取血，等体积50U肝素生理盐水抗凝，PBS漂洗数次，每次漂洗后1000×g离心5min弃上清，至上清清亮。红细胞与PBS按体积比1:200（0.5％）稀释成红细胞悬液。0.5ml离心管中先加入红细胞悬液0.1ml，然后分别加入0.1ml快制法和自溶法所制水母毒素粗提物，反应总体积达到0.2ml，另设等体积阴性对照组（PBS）和阳性对照组（SDS，十二烷基磺酸钠）。37℃水浴30min，1000×g离心5min后，各吸取0.15ml上清液于96孔板中，用酶标仪检测A₄₁₅，溶血分数=[(样品管A₄₁₅)－(阴性对照A₄₁₅)]/[(阳性对照A₄₁₅)－(阴性对照A₄₁₅)]×100%。 

结果如图2所示，快速法与自溶法所制水母毒素粗提物的溶血活性均呈现剂量依赖性，半数溶血分数（HU₅₀）分别为70μg/mL、216μg/mL，表明快速法制备的毒素粗提物具有更强的溶血活性。 

3、心血管活性比较 

麻醉SD大鼠（购自第二军医大学实验动物中心）股动脉插管，连接MPA-2000生理记录仪（上海奥尔科特生物科技有限公司）监测大鼠血压，颈外静脉插管给予毒素粗提物（0.2mg/ml，5ml/kg，1mg/kg），观察大鼠血压变化，检测两法所制水母毒素粗提物的心血管毒性。 

结果见图3，快速法所制水母溶血毒素粗提物对大鼠血压无明显影响，而自溶法所制粗提物有显著的心血管活性，能引起大鼠血压快速下降。 

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。