微生物及其在制备生物肥料中的应用、生物肥料及其应用

摘要

本发明上述实施例提供的微生物及其在制备生物肥料中的应用、生物肥料及其应用，与现有技术中的用于生物肥料中的微生物以及生物肥料相比，由于其中的微生物为匍枝根霉PF102，因此，将该微生物用于生物肥料的制备，并将生物肥料用于作物培养时，不仅能够提高作物的产量，而且能够大大的降低作物的发病率以及由于发病导致的死亡率，同时还能够改善作物根际微生物数量、土壤容重、土壤孔隙度、植物叶子的长宽度、果实数量等生长状况。

说明书

技术领域

本发明涉及生物肥料领域，具体而言，涉及微生物及其在制备生物肥料中的应用、生物肥料及其应用。 

背景技术

近年来，随着人们环保意识的加强和对生活质量要求的提高，生物肥料由于不会对环境产生污染，是一种绿色高效的肥料，在农作物培养中得到了快速的发展和广泛的应用。 

相关技术中，生物肥料中常用的微生物有固氮菌：如根瘤菌；溶磷菌：如巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、腊祥芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌；解钾菌：如胶质芽孢杆菌。 

但是，含有上述微生物的生物肥料不能在提高作物产量的同时，有效的防治作物的致病菌。 

发明内容

本发明的目的在于提供微生物及其在制备生物肥料中的应用、生物肥料及其应用，以解决上述的问题。 

在本发明的实施例中第一方面提供了一种微生物，保藏号为：CGMCC No.8435，保藏名称为：匍枝根霉PF102(Rhizopus stolonifer)，保藏日期为：2013年11月5日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。 

在本发明的实施例中第二方面提供了上述微生物在生物肥料制备中的应用。 

在本发明的实施例中的第三方面提供了一种生物肥料，包括上述微生物或者源自所述微生物的突变体。 

进一步地，所述生物肥料还包括腐熟有机质。 

具体地，所述生物肥料由以下重量份的原料制得：所述微生物的孢子悬浮液：5-15份，腐熟有机质：30-50份；其中，所述孢子悬浮液的活孢子浓度为3.0-5.0×10¹⁰cfu/ml。 

具体地，所述生物肥料还包括2-4重量份的甲壳素。 

更具体地，所述生物肥料还包括1-3重量份的腐殖酸。 

进一步更具体地，所述生物肥料还包括3-10重量份的壳聚糖。 

优选地，所述生物肥料由以下重量份的原料制得：所述微生物的孢子悬浮液：10份，所述腐熟有机质：45份，所述甲壳素：3份，所述腐殖酸：2份，所述壳聚糖：10份。 

在本发明的实施例中的第四方面提供了上述生物肥料在提高作物产量以及防治作物病虫害中的应用。 

本发明上述实施例提供的微生物及其在制备生物肥料中的应用、生物肥料及其应用，与现有技术中的用于生物肥料中的微生物以及生物肥料相比，由于其中的微生物为匍枝根霉PF102，因此，将该微生物用于生物肥料的制备，并将生物肥料用于作物培养时，不仅能够提高作物的产量，而且能够大大的降低作物的发病率以及由于发病导致的死亡率，同时还能够改善作物根际微生物数量、土壤容重、土壤孔隙度、植物叶子的长宽度、果实数量等生长状况。 

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。 

生物肥料是一种集有机质、无机营养元素和微生物于一体的养分全面、肥效均衡持久的复合肥料。由于生物肥料不仅能提供作物生长发育所需的有机、无机营养，还可通过其中的微生物对有机物进行降解和营养转化，产生某些能够促进植物生长的生理活性物质；另外，由于生物肥料的原料为农作物秸秆、城市污泥、畜禽粪便等，发展生物肥料有利于缓解废弃物的处理压力。 

但是，相关技术中，生物肥料中的微生物大多不能在提高作物产量的同时，有效的防治农作物的致病菌。 

本发明为了解决上述问题，筛选得到了一种微生物（以下简称本微生物），该微生物于2013年11月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为：CGMCC No.8435，保藏名称为：匍枝根霉PF102(Rhizopus stolonifer)。 

本微生物属于匍枝根霉，相关技术中，还没有发现将匍枝根霉菌株用于生物肥料中，并用于防治作物的致病菌。 

将该微生物用于制备生物肥料，将生物肥料施加在作物生长的土壤中，从而提高作物的产量以及有效的防治作物的致病菌。 

本发明实施例提供的生物肥料包括本微生物，且以孢子悬浮液的形式存在。其中，孢子悬浮液,的活孢子浓度为3.0-5.0×10¹⁰cfu/ml。 

本发明实施例提供的生物肥料还包括腐熟有机质。 

本发明实施例提供的生物肥料中的原料具有如下作用： 

本微生物属于根霉，具有根霉的特征。根霉在快速繁殖过程中，可以产生维生素、氨基酸、糖化酶、蛋白酶、淀粉酶等多种生理活性物质，促进土壤中有机质的分解和土壤有效成分的释放。本微生物能够产生丰富的胞外活性物质，包括淀粉酶、蛋白酶、氨基酸类、核酸类、维生素、鞘脂类等多种化合物，它们具有分解有机质，抑制有害微生物，促进植物根系生长等作用；本微生物外分泌2种抑菌物质，即脂肽类抗生素表面活性素和多烯类，对多种病原菌有抑制活性，其代谢产物抗逆性强，既可防病，又能促进植株生长。其次，该微生物适应性很强，在4℃～42℃之间都可生长，繁殖速度惊人，这有利于它们快速占领空间资源和营养资源。此外，本微生物易于在人工条件下培养，可用于病原菌防治的种类很多。 

甲壳素具有“植物疫苗”的作用，连续使用可诱导农作物自身产生对病害的抗性因子，增强植物的抗病、抗倒、抗低温等抗逆能 力。甲壳素还可用作化肥缓释剂，提高化肥利用率，降低病害发生率，显著减少农药使用量。此外它还有极强叶面附着性能，可促根壮苗，促进果实成熟。 

壳聚糖可诱导植物组织产生甲壳素酶,从而阻碍植物病原菌的增殖。经壳聚糖处理后的小麦和萝卜可明显减少病虫的侵害，产量有显著的提高。用壳聚糖还可以合成植物防治剂，它具有良好的杀虫机制，可抑制害虫的繁殖。 

腐殖酸可以缩小气孔的开张度，减少水分蒸腾,使植株和土壤保持较多的水分,同时促进根系发育，提高根系活力，使作物吸收较多的水分和养料。提高植物体的多种酶活性和叶绿素含量，使新陈代谢旺盛，光合作用加强,糖分和干物质增多，从而达到提高作物产量、改善品质、提高抗寒、抗病等抗逆能力的效果。 

本发明实施例中，通过优选制备生物肥料的原料及重量份数的比例，使得到的生物肥料用于作物生长时，不仅能够大幅度提高作物的产量，而且能够大大的降低作物的发病率以及由于发病导致的死亡率，同时还能够改善作物根际微生物数量、土壤容重、土壤孔隙度、植物叶子的长宽度、果实数量等生长状况。 

实施例1，本微生物的筛选 

1、材料 

供试土壤：从山东省寿光市同一连作黄瓜种植温室中，拨开表土采集3-15cm的根际土壤，每样约100g。把土壤样品分别编号、装袋,带回实验室4℃冰箱保存。 

供试培养基：PDA培养基、孟加拉红培养基。 

2、土壤悬浮液的制备 

将土壤样品放入已灭菌的研钵内，在无菌操作台内研磨至颗粒均匀。采用10倍比稀释法,先称取1g研磨好的土壤，放入装有99mL无菌水的三角瓶中充分振荡30min,制成10-2的土壤稀释液，再取出1mL加到9mL无菌水中充分振荡制成10-3的稀释液，以此类推，制成10-4的稀释液备用。 

3、平板接种 

采用平板涂布法，分别取10^-2、10^-3、10^-4的稀释液0.1mL加入PDA培养基和孟加拉红培养基中，用玻璃涂布棒将稀释液均匀的涂开，于28℃恒温培养箱中培养，各土样重复3次，各稀释度重复2次。 

4、本微生物的纯化与保存 

观察菌落生长情况并记录原始培养结果。根据微生物在培养基上的生长特性和菌落形态，挑取单菌落，分离纯化微生物。经过多次重复上述操作，得到纯化的本微生物，然后保存于-80℃冰箱中。 

5、本微生物的鉴定 

结合本领域常规的真菌鉴定的方法：①形态学观察法；②基因分析方法；③分析研究脂肪酸特征的色谱方法，确定本微生物为匍枝根霉PF102。 

6、本微生物的传代培养 

将本微生物在PDA培养基中传代培养，28℃，培养5天传一代，每一代培养物均进行淀粉酶和蛋白酶活力测定，并与原始菌株的酶活力做对比，以此作为考察菌株遗传稳定性的指标。其中，采用a-淀粉酶活力测定方法测定本微生物的淀粉酶活力，采用福林-酚法测定本微生物的蛋白酶活力。结果如下表所示。 

从表中可以看出，将筛选出的本微生物菌株连续转接10代，得到稳定遗传的菌株。 

实施例2，本微生物对作物病菌的抑制作用 

供试致病菌：尖孢镰刀菌黄瓜转化型、灰霉、大丽轮枝菌、黄瓜枯萎病菌、立枯丝核菌（其中，尖孢镰刀菌黄瓜转化型会导致黄瓜枯萎病，灰霉会导致叶片的灰霉病，大丽轮枝菌会导致作物黄萎病，立枯丝核菌会导致纹枯病）。 

供试培养基：PDA培养基、PDB培养基、孟加拉红培养基。 

本发明实施例中，采用微生物生长速率法测定本微生物无菌发酵滤液的抑菌活性。 

将上述保藏的本微生物接种到PDB培养基中，于25℃，160r/min的条件下培养8d后用0.45μm的微孔滤膜过滤得无菌发酵滤液。按1﹕4的体积比例将滤液与冷却至50-60℃的灭菌的PDA培养基混匀，制备无菌发酵滤液平板；然后将致病菌菌饼（一般直径为7mm）置于平板中央，以PDA培养基平板为空白对照，于25℃条件下暗培养，培养6-7天后，用十字交叉法测量菌落直径，按下式计算相对抑菌率。以D1表示PDA培养基平板上得到的菌落直径，以D2表示无菌发酵滤液平板上得到的菌落直径，以D3表示致病菌菌饼直径。 

本微生物对供试致病菌的相对抑菌率如表1所示： 

表1本微生物对供试致病菌的相对抑菌率 

实施例3，本微生物孢子悬浮液的制备 

具体按照如下方法进行制备： 

将冷藏保存的本微生物菌种在PDA培养基平板（马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL）上转接3代；然后用接种环挑取第3代菌落边缘菌丝，转接于PDB液体培养基（马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL）中，于25℃～30℃，最适温度为28℃，120rpm，的条件下培养10天，得到本微生物的发酵液。将得到的发酵液经100μm筛过滤得到孢子悬浮液，活孢子浓度为3.0_-5.0×10¹⁰cfu/ml。 

实施例4，腐熟有机质的制备方法 

本发明实施例中，腐熟有机质可以具体按照如下方法进行制备： 

将1000kg由作物秸秆、树叶、杂草、锯末、酒糟、糠醛渣等有机废弃物中的一种或几种组成的干基原料用水浇湿浇透，使有原料的含水量达到50-60%时，将5kg酵素菌粉，与上述含水量为 50-60%的原料混匀，堆成宽2米、高1米、长度不限的条形堆，并用塑料布盖好。24小时后，使条形堆内温度达到60-70℃，48小时后，使条形堆内温度达到80-90℃，6-7天后，使条形堆内的温度自然下降，9-10天后，结束发酵，得到腐熟有机质。 

为了提高腐熟有机质的保质期，本发明实施例中，采用上述方法，发酵以后得到的腐熟有机质在阴凉处风干，然后用袋子装好备用。 

如本领域技术人员可以理解的，腐熟有机质还可以按照传统的有机废弃物沤制的方法获得， 

实施例5，包含本微生物的生物肥料及其制备方法 

包含实施例3得到的本微生物的孢子悬浮液，以及本领域制备生物肥料时常规使用的有机质和无机肥。 

如本领域技术人员可以理解的，按照本领域常规的生物肥料的制备方法制备而得。 

实施例6，包含本微生物的生物肥料及其制备方法 

包含本微生物的生物肥料由以下重量份的原料制得：实施例3得到的本微生物的孢子悬浮液：5g，实施例4得到的腐熟有机质：40g。 

将上述原料按照配比混合均匀，即得含有本微生物的生物肥料。 

实施例7，包含本微生物的生物肥料及其制备方法 

实施例3得到的本微生物的孢子悬浮液：15g，实施例4得到的腐熟有机质：30g，甲壳素：2g。 

将上述原料按照配比混合均匀，即得含有本微生物的生物肥料。 

实施例8，包含本微生物的生物肥料及其制备方法 

实施例3得到的本微生物的孢子悬浮液：10g，实施例4得到的腐熟有机质：50g，甲壳素：4g，腐殖酸：3g。 

将上述原料按照配比混合均匀，即得含有本微生物的生物肥料。 

实施例9，包含本微生物的生物肥料及其制备方法 

实施例3得到的本微生物的孢子悬浮液：12g，实施例4得到的腐熟有机质：40g，甲壳素：3g，腐殖酸：1g，壳聚糖：3g。 

将上述原料按照配比混合均匀，即得含有本微生物的生物肥料。 

实施例10，包含本微生物的生物肥料及其制备方法 

实施例3得到的本微生物的孢子悬浮液：10g，实施例4得到的腐熟有机质：45g，甲壳素：3g，腐殖酸：2g，壳聚糖：10g。 

将上述原料按照配比混合均匀，即得含有本微生物的生物肥料。 

本发明实施例11-17以上述实施例制备得到的生物肥料为例，叙述生物肥料在提高作物的产量以及在防治作物致病菌中的应用。 

实施例11，生物肥料对红皮果蔗的影响 

将试验作物分为四个组：对照组（CK,不施基肥）；有机肥组（施加有机肥作为基肥，100kg/亩）；化肥组（施加化肥作为基肥，100kg/亩）；生物肥料组（施加本发明实施例5提供的生物肥料作为基肥，100kg/亩）。施肥方式和其他田间管理方式均一致，且按照常规的方式。 

每组作物所占的面积为30m²，每组设置三个重复，结果取平均值。红皮果蔗的生长状况和产量如表2所示。 

表2生物肥料对红皮果蔗的生长状况及产量的影响 

从表2中可以看出，使用本发明实施例5提供的生物肥料、有机肥和化肥的红皮果蔗的生长状况及产量比对照有明显的提高，而其中，本发明实施例9提供的生物肥料作为基肥时，红皮果蔗达到最好的生长状况以及亩增产量最大。 

实施例12，生物肥料对玉米的影响 

将试验作物分为2个组：对照组（CK,不施基肥）；生物肥料组（施加本发明实施例8提供的生物肥料作为基肥，100kg/亩）。施肥方式和其他田间管理方式均一致，且按照常规的方式。 

每组作物所占的面积为30m²，每组设置三个重复，结果取平均值。玉米的生长状况和产量如表3所示。 

表3生物肥料对玉米的生长状况及产量的影响 

从表3可以看出，使用本发明实施例8提供的生物肥料的玉米的生长状况及产量比对照有明显的提高。 

实施例13，生物肥料对黄瓜根际微生物数量的影响 

将试验作物分为两个组：对照组（CK,不施肥）；生物肥料组（定植前施加本发明实施例9提供的生物肥料，100kg/亩）。施肥方式和其他田间管理方式均一致，且按照常规的方式。 

每组作物所占的面积为30m²，每组设置三个重复，结果取平均值。黄瓜根际微生物的种类和数量如表4所示。 

表4生物肥料对黄瓜根际微生物数量的影响 

从表4可以看出，本发明实施例9提供的生物肥料的施加提高了黄瓜根际土壤中的微生物数量，增加了微生物多样性。 

实施例14，生物肥料对小麦产量及土壤容重和孔隙度的影响 

将试验作物分为3个组：对照组（CK,不施基肥）；试验组一（施加本发明实施例10提供的生物肥料作为基肥，100kg/亩）；试验组二（施加本发明实施例10提供的生物肥料作为基肥，150kg/亩）；施肥方式和其他田间管理方式均一致，且按照常规的方式。 

每组作物所占的面积100m²，每组设置三个重复，结果取平均值。小麦收获后测定土壤理化性质和小麦产量，结果如表5所示， 

表5生物肥料对小麦产量及土壤容重和孔隙度的影响 

从表5中可以看出，与对照组相比，使用本发明实施例10提供的生物肥料后，土壤容重显著下降，土壤孔隙度显著增加，pH值明显 增加且接近中性，土壤酸化状况得到改善，适于小麦生长，小麦产量明显增加。 

实施例15，生物肥料对辣椒的生长状况及产量的影响 

将试验作物分为两个组：对照组（CK,不施肥）；生物肥料组（定植前施加本发明实施例10提供的生物肥料，100kg/亩）。施肥方式和其他田间管理方式均一致，且按照常规的方式。 

每组作物所占的面积为20m²，每组设置三个重复，结果取平均值。生物肥料对辣椒的生长状况及产量的影响如表6所示。 

表6生物肥料对辣椒的生长状况及产量的影响 

从表6可以看出，与对照组相比，使用本发明实施例10提供的生物肥料的辣椒的生长状况有明显改善，产量有显著提高。 

实施例16，生物肥料在防治黄瓜枯萎病中的应用 

将试验作物分为三个组：对照组（CK,不施肥）；市售生物肥料组（定植前施加生物肥料，100kg/亩）；本发明实施例7提供的生物肥料组（定植前施加生物肥料，100kg/亩）。施肥方式和其他田间管理方式均一致，且按照常规的方式。 

每组作物所占的面积为30m²，每组设置三个重复，结果取平均值。黄瓜枯萎病的防治效果及产量的变化如表7所示。 

表7黄瓜枯萎病的防治效果及产量的变化 

从表7可以看出，使用本发明的生物肥料对黄瓜枯萎病的防治效果及产量比使用市售的生物肥料均有明显的提高。 

实施例17，生物肥料在防治青椒白粉病中的应用 

将试验作物分为三个组：对照组（CK,不施肥）；市售生物肥料组（定植前施加生物肥料，100kg/亩）；本发明实施例6提供的生物肥料组（定植前施加生物肥料，100kg/亩）。施肥方式和其他田间管理方式均一致，且按照常规的方式。 

每组作物所占的面积为30m²，每组设置三个重复，结果取平均值。青椒白粉病的防治效果及产量的变化如表8所示。 

表8青椒白粉病的防治效果及产量的变化 

从表8可以看出，使用本发明的生物肥料对青椒白粉病的防治效果及产量比使用市售的生物肥料均有明显的提高。 

上述实施例11-17以本发明实施例提供的生物肥料为例，对本发明提供的生物肥料在改善土壤理化性质中的应用做了说明。 

上述实施例1-18中用到的原料均为市售产品，包括化肥、有机肥等。 

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。