微生物及其在制备生物肥料中的应用、生物肥料及其应用

摘要

本发明提供的微生物及其在制备生物肥料中的应用、生物肥料及其应用，与现有技术中的用于生物肥料中的微生物以及生物肥料相比，由于其中的微生物属于绿色木霉，其能够产生丰富的菌丝，高效的表达β-1,4-葡聚糖水解酶、几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶等高活性的特殊酶系，产生挥发性或非挥发性抑制病原菌生长的活性物质，因此，将该微生物用于生物肥料的制备，并将生物肥料用于作物生长时，能够较好的改善土壤的理化性质，从而从根本上解决提高作物产量，使农业生产持续化发展的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及生物肥料领域，具体而言，涉及微生物及其在制备生物肥料中的应用、生物肥料及其应用。 

背景技术

在农业生产中，为了提高产量，化肥被大量使用，随之产生了多种环境污染的问题。生物肥料由于不会对环境产生污染，是一种绿色高效的肥料，在农作物培养中得到了快速的发展和广泛的应用。 

相关技术中，生物肥料的研究主要集中在如何提高土壤中营养元素的利用率方面。例如共生固氮的根瘤菌剂的研究，自生、联合固氮菌、多种芽胞杆菌、光合细菌，以及纤维分解菌、乳酸菌、酵母菌等菌剂的研究。 

上述生物肥料中含有的微生物大多数还是传统的固氮、解磷、解钾细菌，虽然能够提高作物对土壤中营养元素的利用率，但是不具有改善土壤理化性质的作用。而由于化肥的大量使用，导致土壤理化性质劣化，比如土壤酸化、板结、肥力下降等，使其不再适合作物的生长需求，仅仅考虑如何提高土壤中营养元素的利用率还是不能从根本上解决提高作物产量，使农业生产持续化发展的问题。 

发明内容

本发明的目的在于提供微生物及其在制备生物肥料中的应用、生物肥料及其应用，以解决上述的问题。 

在本发明的实施例中第一方面提供了一种微生物，保藏号为：CGMCC No.8434，保藏名称为：绿色木霉PF1(Trichoderma viride)，保藏日期为：2013年11月5日。 

在本发明的实施例中第二方面提供了上述微生物在生物肥料制备中的应用。 

在本发明的实施例中第三方面提供了一种生物肥料，包括上述微生物。 

具体地，所述微生物以其孢子悬浮液的形式存在于所述生物肥料中；所述孢子悬浮液中活孢子的浓度为3.0-5.0×10¹⁰cfu/ml。 

进一步地，所述生物肥料还包括腐熟有机质。 

具体地，所述生物肥料由以下重量份的原料制得：所述微生物的孢子悬浮液：20-45份，腐熟有机质：15-25份。 

更具体地，所述生物肥料还包括1-4重量份的水溶性甲壳素。 

进一步更具体地，所述生物肥料还包括2-5重量份的黄腐酸钾。 

优选地，所述生物肥料由以下重量份的原料制得：所述微生物的孢子悬浮液：30份，所述腐熟有机质：20份，所述水溶性甲壳素：1.5份，所述黄腐酸钾：3.5份。 

在本发明的实施例中第四方面提供了上述生物肥料在改善土壤理化性质中的应用。 

本发明上述实施例的提供的微生物及其在制备生物肥料中的应用、生物肥料及其应用，与现有技术中的用于生物肥料中的微生物以及生物肥料相比，由于其中的微生物属于绿色木霉，能够产生丰富的菌丝，高效的表达β-1,4-葡聚糖水解酶、几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶等高活性的特殊酶系，产生挥发性或非挥发性抑制病原菌生长的活性物质，因此，将该微生物用于生物肥料的制备，并将生物肥料用于作物生长时，能够较好的改善土壤的理化性质，从而从根本上解决提高作物产量，使农业生产持续化发展的问题。 

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。 

在农业生产中，长期大量的施用化肥，虽然在一定时间和程度上提高了作物的产量，但是，过多的使用会导致土壤有机质含量降低，土壤养分供应不平衡，环境污染，土壤酸化，有效态的微量元素下降，土壤酶的种类和数量明显减少，土壤生物间的养分竞争激烈，土壤生物群落稳定性降低等问题。从而随着化肥的不断使用，使用量呈现逐步上升的趋势，但是化肥的利用率却呈现逐步下降的趋势，主要原因就是因为长期使用化肥，改变了土壤结构，使其不再适应作物的生长需求。这样，不仅不能有效的提高作物产量和经济效益，同时，由于化肥不能被完全吸收利用，带来的农业污染也会导致湖泊与海洋富营养化，以及因土壤淋溶所导致的地下水的污染。因此，化肥使用不当，特别是施用氮肥不当，不仅可使土壤的理化性质变劣，而且促使可以产生植物毒素的真菌发育，由此引发了一系列的生态环境问题如土壤酸化、板结、肥力下降，地下水硝酸盐含量超标，大气污染、水体富营养化等。 

为了减少化肥的使用量，降低其对环境的污染，以及改善土壤的理化性质，使其适合作物的生长，从根本上解决提高作物产量， 使农业生产持续化发展的问题，本发明实施例提供了一种微生物（以下简称本微生物），该微生物于2013年11月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为：CGMCC No.8434，保藏名称为：绿色木霉PF1(Trichoderma viride)。 

本微生物为绿色木霉（Trichoderma viride），相关技术中，还没有发现将绿色木霉菌株用于生物肥料中，并用于改善土壤的理化性质。 

将该微生物用于制备生物肥料，将生物肥料施加在作物生长的土壤中，从而改善了土壤的理化性质，进而提高了作物的产量。 

本发明实施例提供的生物肥料包括本微生物，且以孢子悬浮液的形式存在。其中，孢子悬浮液中活孢子的浓度为3.0-5.0×10¹⁰cfu/ml。 

本发明实施例提供的生物肥料还包括腐熟有机质。 

本发明实施例提供的生物肥料中的原料具有如下作用： 

本微生物属于木霉，具有木霉的特征，木霉是一种非常具有土壤改善潜力的菌株，分布广泛，生长势旺盛。其土壤改善机制多种多样，由于其具有丰富的菌丝，可以附着和交绕土壤微粒，从而可以提高土壤稳定性和通透性，打破土壤板结；同时本微生物还可高效表达β-1,4-葡聚糖水解酶、几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶等高活性的特殊酶系，分泌丰富的胞外高分子多糖和糖蛋白，从而改善土壤理化性质，促进土壤养分的释放和植物根系对营养成分的吸收，促进植物根系生长；产生挥发性或非挥发性抑制病原菌生长的活性物质，如粘帚毒素、煤尼毒素及胜肽素等抑制有害微生物的生长，β-1,4-葡聚糖水解酶和几丁质酶对植物病原真菌的细胞壁具有强烈的水解作用，引起病原体的崩解并抑制病原菌孢子和芽孢的萌发。 另外，本微生物适应性极强，在4℃～42℃之间和多种土壤环境下均可快速生长，可以快速占领空间位点和营养资源。 

甲壳素具有“植物疫苗”的作用，连续使用可以诱导农作物自身产生抗性因子，增强植物的抗病、抗倒、抗低温等抗逆能力。甲壳素还具有化肥缓释剂的作用,可以提高化肥利用率，降低病害发生率，显著减少农药使用量。 

黄腐酸钾具有高负载量及生理活性，其可以与Cu、Fe、Mn、Zn、Co等微量元素螯合，生成稳定的可溶于水的螯合物，以利于动植物的吸收和利用,使其更好地为植物利用，激发植物微观生物活性，能够缓释肥料，提高植物对营养的吸收，促进植物发芽生长，加速沉淀分解，增强抗涝性。 

本发明实施例中，通过优选制备生物肥料的原料及重量份数的比例，使得到的生物肥料用于作物生长时，能够较好的改善土壤的理化性质，从而从根本上解决提高作物产量，使农业生产持续化发展的问题。 

实施例1，本微生物的筛选 

1、土样采集 

土壤标本采自山东省寿光市。选好采样地点后，铲去表土层2～3cm，取3～10cm深层土壤约10g，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。 

2、分离纯化：梯度稀释平板划线法 

倒平板：将灭完菌的固体培养基加热融化，在无菌室的操作台中倒入培养皿中，每个培养皿倒入15-20毫升，在酒精灯火焰边操作，此时应注意不要将锥形瓶口碰到培养皿外壁。倒完后将盖上盖子的培养皿放在操作台上静置约15分钟，待培养皿中的固体培养基凝固后，将培养皿叠在一起，放在无菌操作台上备用。向盛有90ml蒸馏水的锥形瓶要加入玻璃珠，然后高压蒸汽灭菌20分钟。 

称取土样10g，在无菌台的酒精灯火焰旁加入到锥形瓶中。在温室下摇床旋转30分钟破碎土样后，在数显恒温水浴锅里80℃水浴保温20分钟。振荡摇匀，静置后，取上清液1.0mL加入到盛有9.0mL无菌水的试管中，振荡摇匀，再取1.0mL加入到另一支盛有9mL的试管中，依次将土样稀释到浓度为10^-2、10^-3、10^-4。然后用移液枪取50uL加入到盛有KMB培养基、NA培养基和高氏1号培养基的无菌培养皿中，涂布均匀，于30℃的恒温箱中培养以分别分离土壤中的真菌、细菌和放线菌。根据培养皿中长出的菌落形态，在酒精灯火焰上灼烧接种环，待其在火焰旁冷却后，右手手指握住接种环，尽量挑取形态有差异的菌落，挑取出单一菌落，左手握琼脂平板，在火焰附近稍抬起培养皿盖，右手持接种环伸入皿内，在平板上沿“S”字形划线。划线时，使接种环与平板表面呈30-40度角轻轻接触，以腕力使接种环在琼脂表面做轻快的滑动，不要划破琼脂表面，接种环不要离开琼脂表面，划线结尾不要与开头处重合。接种后，将被接种的平板放入恒温箱中培养。细菌和真菌37℃培养，放线菌28℃培养。 

3、初筛：采用琼脂移块对峙法 

将在PDA斜面上培养的枯萎病菌，用生理盐水将其制成单孢子悬液。取0.1mL孢子悬液加在PDA平板上，均匀涂布制成含菌平板。28℃恒温箱中培养，待病原菌长好以后用打孔器打取含菌琼脂块，将其放到PDA培养基平板的中心位置，将分离出的待测菌株，分别接种到离枯萎病菌约20mm的对称位置，每个平板上接种四个待测菌株。30℃培养72h观察抑菌活性，根据抑菌带的有无确定待测菌株的拮抗活性，获得有活性菌株。 

4、复筛 

为确定初筛拮抗菌株的可靠性和定量比较其拮抗性能大小，对初筛中获得的拮抗菌株进行复筛。复筛在NA培养基上完成，复筛方法同初筛，只是在每个平板上只验证一个真菌的拮抗活性。并根据抑菌带的大小确定菌株的拮抗性能的大小。获得具有最高的抑菌活性的菌株为本微生物。 

5、活性菌株的鉴定 

结合本领域常规的真菌鉴定的方法：①形态学观察法；②基因分析方法；③分析研究脂肪酸特征的色谱方法，确定筛选得到的微生物为本微生物绿色木霉PF1。 

6、本微生物的传代培养 

将本微生物在PDA培养基中传代培养，28℃，培养5天传一代，每一代培养物均进行淀粉酶和蛋白酶活力测定，并与原始菌株的酶活力做对比，以此作为考察菌株遗传稳定性的指标。其中，采 用a-淀粉酶活力测定方法测定本微生物的淀粉酶活力，采用福林-酚法测定本微生物的蛋白酶活力。结果如下表所示。 

从表中可以看出，将筛选出的本微生物菌株连续转接10代，得到稳定遗传的菌株。 

实施例2，本微生物孢子悬浮液的制备 

具体按照如下方法进行制备： 

将冷藏保存的本微生物菌种在PDA培养基平板（马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL）上转接3代；然后用接种环挑取第3代菌落边缘菌丝，转接于PDB液体培养基（马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL）中，于25℃～30℃，最适温度为28℃，120rpm，的条件下培养10天，得到本微生物的发酵液。将得到的发酵液经100μm筛过滤得到孢子悬浮液，活孢子浓度为3.0-5.0×10¹⁰cfu/ml。 

实施例3，腐熟有机质的制备方法 

本发明实施例中，腐熟有机质可以具体按照如下方法进行制备： 

将1000kg由作物秸秆、树叶、杂草、锯末、酒糟、糠醛渣等有机废弃物中的一种或几种组成的干基原料用水浇湿浇透，使有原料的含水量达到50-60%时，将5kg酵素菌粉，与上述含水量为50-60%的原料混匀，堆成宽2米、高1米、长度不限的条形堆，并用塑料布盖好。24小时后，使条形堆内温度达到60-70℃，48小时后，使条形堆内温度达到80-90℃，6-7天后，使条形堆内的温度自然下降，9-10天后，结束发酵，得到腐熟有机质。 

为了提高腐熟有机质的保质期，本发明实施例中，采用上述方法，发酵以后得到的腐熟有机质在阴凉处风干，然后用袋子装好备用。 

如本领域技术人员可以理解的，腐熟有机质还可以按照传统的有机废弃物沤制的方法获得， 

实施例4，包含本微生物的生物肥料及其制备方法 

包含实施例2得到的本微生物的孢子悬浮液，以及本领域制备生物肥料时常规使用的有机质和无机肥。 

如本领域技术人员可以理解的，按照本领域常规的生物肥料的制备方法制备而得。 

实施例5，包含本微生物的生物肥料及其制备方法 

包含本微生物的生物肥料由以下重量份的原料制得：实施例2得到的本微生物的孢子悬浮液：20g，实施例3得到的腐熟有机质：20g。 

将上述原料按照配比混合均匀，即得含有本微生物的生物肥料。 

实施例6，包含本微生物的生物肥料及其制备方法 

包含本微生物的生物肥料由以下重量份的原料制得：实施例2得到的本微生物的孢子悬浮液：45g，实施例3得到的腐熟有机质：15g，水溶性甲壳素3g。 

将上述原料按照配比混合均匀，即得含有本微生物的生物肥料。 

实施例7，包含本微生物的生物肥料及其制备方法 

包含本微生物的生物肥料由以下重量份的原料制得：实施例2得到的本微生物的孢子悬浮液：25g，实施例3得到的腐熟有机质：25g，水溶性甲壳素1g，黄腐酸钾5g。 

将上述原料按照配比混合均匀，即得含有本微生物的生物肥料。 

实施例8，包含本微生物的生物肥料及其制备方法 

包含本微生物的生物肥料由以下重量份的原料制得：实施例2得到的本微生物的孢子悬浮液：35g，实施例3得到的腐熟有机质：18g，水溶性甲壳素4g，黄腐酸钾2g。 

将上述原料按照配比混合均匀，即得含有本微生物的生物肥料。 

实施例9，包含本微生物的生物肥料及其制备方法 

包含本微生物的生物肥料由以下重量份的原料制得：实施例2得到的本微生物的孢子悬浮液：30g，实施例3得到的腐熟有机质：20g，水溶性甲壳素1.5g，黄腐酸钾3.5g。 

将上述原料按照配比混合均匀，即得含有本微生物的生物肥料。 

本发明实施例10-14以上述实施例制备得到的生物肥料为例，叙述生物肥料在改善土壤理化性质，提供农作物生长所必需的营养物质，促进植物根系生长，提高作物产量中的应用。 

实施例10，生物肥料在提高济麦22产量及改善土壤理化性质中的应用 

本发明实施例提供的应用在中国山东省招远市进行试验。 

将试验作物分为三个组：对照组（CK,不施基肥）；试验一组（施加本发明实施例5提供的生物肥料作为基肥，100kg/亩）；试验二组（施加生物肥料作为基肥，150kg/亩）。施肥方式和其他田间管理方式均一致，且按照常规的方式。 

每组作物所占的面积为100m²，每组设置三个重复，结果取平均值。小麦收获后按照本领域的常规方法测定土壤容重、土壤孔隙度和pH值，结果如表1所示。 

表1生物肥料对小麦产量及土壤理化性质的影响 

从表1可以看出，施用生物肥料后土壤容重显著下降，土壤孔隙度显著增加，pH值显著上升，且接近中性，土壤酸化状况得到逆转，可见，施加生物肥料后的土壤理化性质更加适于小麦生长，当施加本发明实施例5提供的生物肥料的量不同时，土壤理化性质的改变也会有所差别。从表1还可以看出，相对于对照组，施加本发明实施例8提供的生物肥料的小麦产量明显增加。 

实施例11，生物肥料在提高甜瓜产量以及改善土壤理化性质中的应用 

土壤养分是土壤理化性质的重要方面，是作物生长的基础。本发明实施例提供的应用在中国山东省招远市进行试验。 

本发明实施例提供的应用在中国山东省招远市进行试验。 

将试验作物分为三个组：对照组（CK,不施基肥）；试验一组（施加有机肥作为基肥，100kg/亩）；试验二组（施加本发明实施例8提供的生物肥料作为基肥，100kg/亩）。施肥方式和其他田间管理方式均一致，且按照常规的方式。 

每组作物所占的面积为100m²，每组设置三个重复，结果取平均值。甜瓜收获后按照本领域的常规方法测定甜瓜产量和土壤养分含量，结果如表2所示。 

表2生物肥料在提高甜瓜产量以及改善土壤理化性质中的应用 

从表2可以看出，与对照组相比，施加本发明实施例8提供的生物肥料后，土壤中的养分含量显著提高，增加了土壤的肥力，有利于作物在该土壤中生长，并提高其产量。 

从表2还可以看出，与对照组相比，施加本发明实施例9提供的生物肥料后，甜瓜的产量得到了明显的提高。 

实施例12，生物肥料在提高香瓜根际微生物数量中的应用 

本发明实施例提供的应用在中国山东省招远市进行试验。 

本实施例中，将试验作物分为三个组：对照组（CK,不施基肥）；试验一组（施加有机肥作为基肥，100kg/亩）；试验二组（施加本发明实施例9提供的生物肥料作为基肥，100kg/亩）。施肥方式和其他田间管理方式均一致，且按照常规的方式。 

每组作物所占的面积为100m²，每组设置三个重复，结果取平均值。香瓜收获后按照本领域的常规方法测定香瓜根际微生物数量，结果如表3所示。 

表3生物肥料在提高香瓜根际微生物数量中的应用 

从表3可以看出，与对照组相比，施加有机肥及本发明实施例9提供的生物肥料后，土壤中的微生物数量得到了提高，施加本发明实施例9提供的生物肥料后，土壤中的微生物数量提高的更多。土壤中的微生物可以调节植株的生长、抑制病原微生物的生长及繁殖，可以保持和提高土壤肥力，并且在土壤的能量转化和物质循环等方面具有重要作用，是土壤质量的重要指标。 

实施例13，生物肥料在提高西瓜产量中的应用 

本发明实施例提供的应用在中国山东省招远市进行试验。 

将试验作物分为四个组：对照组（CK,不施基肥）；生物肥料组（施加本发明实施例7提供的生物肥料作为基肥，100kg/亩）；有机肥组（施加有机肥作为基肥，100kg/亩）；化肥组（施加化肥作为基肥，100kg/亩）。施肥方式和其他田间管理方式均一致，且按照常规的方式。 

每组作物所占的面积为100m²，每组设置三个重复，结果取平均值。西瓜收获后按照本领域的常规方法测定西瓜产量，结果如表4所示。 

表4生物肥料在提高西瓜产量中的应用 

从表4可以看出，使用本发明实施例7提供的生物肥料、有机肥和化肥的西瓜产量比对照组的西瓜产量有显著的提高，使用生物肥料的西瓜产量比施用化肥或有机肥的西瓜产量也有显著增加。 

实施例14，生物肥料在提高黄瓜叶片大小及其中养分含量中的应用 

本发明实施例提供的应用在中国山东省招远市进行试验。 

将试验作物分为四个组：对照组（CK,不施基肥）；生物肥料组（施加本发明实施例9提供的生物肥料作为基肥，100kg/亩）；有机肥组（施加有机肥作为基肥，100kg/亩）；化肥组（施加化肥作为基肥，100kg/亩）。施肥方式和其他田间管理方式均一致，且按照常规的方式。 

每组作物所占的面积为30m²，每组设置三个重复，结果取平均值。黄瓜生长期1个月后，按照本领域的常规方法测定黄瓜叶片的大小、叶片干重及其中养分的含量，结果如表5所示。 

表5生物肥料在提高黄瓜叶片大小及其中养分含量中的应用 

从表5可以看出，使用本发明实施例9提供的生物肥料和有机肥、化肥的黄瓜的叶片大小、叶片干重以及叶片中N、P、K含量均比对照组有显著的提高，且使用生物肥料的黄瓜的叶片大小、叶片干重以及N、P、K含量比施用化肥或有机肥的也有显著提高。 

上述实施例10-14以本发明实施例提供的生物肥料为例，对本发明提供的生物肥料在改善土壤理化性质中的应用做了说明。 

上述实施例1-14中用到的原料均为市售产品，包括化肥、有机肥等。 

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。