一种针对前列腺癌不同类型血清标志物进行同时检测的微流控电化学生物传感系统

摘要

本发明提供一种针对前列腺癌不同类型的血清标志物进行同时检测的微流控电化学生物传感系统，包括：用于依次运输样品溶液，样品洗脱液，信号探针溶液，信号探针洗脱液以及电化学检测缓冲溶液的连续进样单元，样品溶液中含有针对前列腺癌的蛋白类标志物和/或miRNA类标志物；由一个或多个微通道网络组成的微流控芯片，该微流控芯片覆盖在电极阵列上形成一个通道系统，电极阵列的表面上固定有与样品溶液相互作用的抗体和/或捕获探针，所述通道系统与连续进样单元连接；以及为连续进样单元提供动力的动力系统。本发明创造性地提供了一种能够同时检测与前列腺癌疾病密切相关的不同类型血清标志物的灵敏度高且成本低的微流控电化学生物传感系统。

说明书

技术领域

本发明涉及微流控电化学生物传感系统领域，更具体地涉及一种针对前列腺癌不同类型血清标志物进行同时检测的微流控电化学生物传感系统。 

背景技术

前列腺癌（prostate cancer）是男性生殖系统最常见的恶性肿瘤，在欧美国家已经成为男性的第一高发的肿瘤。前列腺癌是一种老年性疾病，随着中国人口平均寿命的增加，前列腺癌已成为我国老年男性的巨大威胁。前列腺特异性抗原（PSA）作为前列腺癌的诊断标志物是迄今为止临床上最有效的前列腺癌早期诊断指标。但PSA的特异性尚不够好，一些前列腺的良性病变同样会使其升高。这种假阳性问题通常会导致不必要的穿刺活检，给患者带来极大的身体、精神和经济的多重负担。癌症的早期检测和筛查主要依赖基于高特异性肿瘤标志物的血清学检测。然而，现有的血清学检测技术在分析速度、检测成本和特异性方面均存在明显的不足。常用的以PSA为标志物进行检测的酶联免疫检测（ELISA）以及化学发光和时间分辨荧光技术存在实验操作步骤繁琐，仪器设备体积大且昂贵等缺点。已发现的有效肿瘤标志物种类尚不够多，且其特异性普遍不够高，目前只有PSA等少数肿瘤标志物通过了美国食品药品管理局（FDA）的认证，但其仍然存在假阳性率偏高的问题。鉴于当前全新肿瘤标志物的筛选速度和有效性难以满足临床的迫切需求，如何通过现有肿瘤标志物的联合检测来提高特异性就显得异常重要。 

除PSA以外，研究者在血液和尿液中发现了一批具有很好应用前景的前列腺癌的新型标志物，覆盖多种不同的生物分子水平（蛋白、DNA、RNA、小分子），有望在前列腺癌的早期检测中发挥重要作用。微小RNA（microRNA或miRNA）是当前分子生物学研究的新热点，它不但在肿瘤的发生、生长、侵袭和转移等过程中起着重要的调控作用，其表达谱还可为肿瘤的诊疗及预 后监测提供新的手段。自用于前列腺癌检测的循环miRNA-141的报道之后，研究者又发现miR-21和miR-221同样可用于前列腺癌的检测。此类microRNA标志物的发现，为前列腺癌的诊断提供了一个新的方向，具有特异性好、灵敏度高且可进行血清筛查的优势。 

目前癌症组合标志物的研究往往停留在蛋白或基因等单一分子水平上，在临床上很难达到很好的特异性。这在很大程度上是由于受到检测技术的局限，因此发展能同时实现对多个分子水平的靶标检测方法就显得尤为重要。值得主要的是，肿瘤标志物检测目前成本仍然较高，如前列腺癌标志物PSA检测在我国大约100元左右一次，在多指标联合检测时费用还会大大增加。由于早期筛查涉及人群面广量大，且需要同时覆盖发达和欠发达地区，价格就会成为一个制约因素。发展中国家的社会发展迫切需要廉价优质的疾病诊疗新技术，而常规生物检测技术往往是由发达国家开发的昂贵技术，因此特别呼吁科学家们从全新角度来思考这个问题。 

电化学传感器是一种在廉价、易用方面具有独特优势的生物检测方法。它建立在成熟的电子工业基础上，可以制成轻便的手持式检测装置，低能耗且易于集成化，被认为是在时效、成本等有较高限定要求的场合进行检测的首选技术之一，特别适用于大规模的普查工作，以及在基层医疗机构进行低成本的测试。 

电化学生物传感器就是利用生物化学反应所特有的专一性，选择性地识别特定的待测物质，并将其生化反应转换成电信号输出的一种装置。电化学检测方法本身具有一些独特的优点，包括：检测快速、灵敏度高、选择性高，仪器简便，易于微型化、集成化、且能耗低，适用于现场检测等。但传统的碳电极或金电极等三电极系统不仅分析通量低，成本也较高，难以满足现阶段的高通量和低成本检测的要求。近来印刷技术、光刻技术的快速发展极大的促进了高通量和一次性电极的开发，但长时间的样品孵育和耗时、繁琐的清洗步骤限制了这类电化学生物传感器进一步的应用。针对以上问题，微流控芯片技术可予以有效解决。 

微流控芯片分析是以分析化学和生物化学为基础，以微机电加工技术为依托，以微通道网络结构为特征，把试样的采集、预处理、分离、反应和检测等部分集成在几个平方厘米的范围内，从而快速、高效的完成样品的处理 和检测。因微通道的深、宽均在微米级，故可有效的将待检测的目标物和传感界面固定的捕获探针限制在微米尺度范围内相互作用，大大提高了分子间的识别能力。另外，界面科学与纳米科学的快速发展则为研制器件化的微尺度电化学生物传感器提供了前所未有的机遇。 

Rusling等人（Chikkaveeraiah,B.V.;Mani,V.;Patel,V.;Gutkind,J.S.;Rusling,J.F.,Microfluidic electrochemical immunoarray for ultrasensitive detection of two cancer biomarker proteins in serum.Biosens.Bioelectron.,2011,26,4477-4483）利用印刷电极阵列与微通道结构在机械螺丝和有机玻璃夹具的固定下完成了芯片传感器的可逆封合，虽然实现了超灵敏的标志物检测，但每次样品测试均要重新组装和拆卸传感器件，并重复沿微通道插入对电极和参比电极，该工作量大，繁琐。并且这种方法只能同时对前列腺癌的两种蛋白标志物PSA和IL-6进行检测。 

因此，一种能够同时检测与前列腺癌疾病密切相关的不同类型血清标志物的灵敏度高的且成本低的系统亟待开发。 

发明内容

本发明的目的是提供一种针对前列腺癌不同类型血清标志物进行同时检测的微流控电化学生物传感系统，从而解决现有技术中前列腺癌疾病检测技术的步骤繁琐，仪器设备体积大，价格昂贵，特异性不高且无法同时实现对多种标志物进行检测的缺陷。 

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案： 

提供一种针对前列腺癌不同类型的血清标志物进行同时检测的微流控电化学生物传感系统，包括：用于依次运输样品溶液，样品洗脱液，信号探针溶液，信号探针洗脱液以及电化学检测缓冲溶液的连续进样单元，所述样品溶液中含有针对前列腺癌的蛋白类标志物和/或miRNA类标志物；由一个或多个微通道网络组成的微流控芯片，所述微流控芯片覆盖在电极阵列上形成一个通道系统，所述电极阵列的表面上固定有与所述样品溶液相互作用的抗体和/或捕获探针，所述通道系统与所述连续进样单元连接；以及为所述连续进样单元提供动力的动力系统。 

其中，所述连续进样单元在动力系统的作用下，将样品溶液，样品洗脱 液，信号探针溶液，信号探针洗脱液以及电化学检测缓冲溶液依次通入所述微流控芯片的微通道网络，并与固定在所述电极阵列表面的抗体和/或核酸捕获探针相互作用，产生可供电化学设备检测的信号，一次性读出不同捕获探针修饰的电极阵列表面的电化学信号；所述前列腺癌不同类型的血清标志物包括蛋白类标志物和miRNA类标志物。 

所述蛋白类标志物包括前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）、前列腺特异性膜抗原（prostate specific membrane antigen，PSMA）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）或血小板因子-4（platelet factor-4，PF-4）。 

固定在所述电极阵列表面的抗体包括：单克隆鼠抗前列腺特异性抗原抗体（PSA-Ab）、单克隆鼠抗前列腺特异性膜抗原抗体（PSMA-Ab）、单克隆白细胞介素-6抗体（IL-6-Ab）或单克隆血小板因子-4抗体（PF-4-Ab）。 

所述miRNA类标志物包括miR21、miR141或miR221。 

所述固定在所述电极阵列表面的核酸捕获探针包括分别与miR21、miR141或miR221对应的单链核酸探针及发夹结构和DNA四面体纳米结构探针。 

所述单链核酸探针包括分别针对miR21、miR141或miR221的完全匹配探针，单碱基不匹配探针以及阴性对照探针。其中，单碱基不匹配探针是用来考察核酸杂交特异性避免假阳性信号，阴性对照探针则是用来考察背景信号。 

所述DNA四面体纳米结构探针包括分别针对miR21、miR141或miR221的完全匹配探针，单碱基不匹配探针以及阴性对照探针。其中，单碱基不匹配探针是用来考察核酸杂交特异性避免假阳性信号，阴性对照探针则是用来考察背景信号。 

所述微流控芯片与电极阵列通过等离子体清洗以及加热键合处理后形成无漏液的完全密封的可逆或不可逆的所述通道系统，以保证流体的正常传送。无需机械螺丝和上下夹板任何外界的作用力，可同时实现一个或多个网络单元的检测工作。 

所述连续进样单元由具有贯穿通道的小管形成，所述先导洗脱液，样品溶液，样品洗脱液，信号探针溶液，信号探针洗脱液和电化学检测缓冲溶液彼此之间通过空气泡间隔依次通过所述贯穿通道通入所述微流控芯片的微通 道网络。 

所述动力系统由连接在微流控芯片的下游的注射泵或注射器形成，提供作为流体驱动力的真空负压，以实现连续进样单元内不同功能溶液的自动传送。 

所述电极阵列是是由丝网印刷技术制备的碳电极阵列或金电极阵列，或者是在碳电极表面直接电化学沉积纳米金属颗粒制备的电极阵列或由光刻技术制备的平面电极阵列。各电极阵列表面可固定不同的捕获探针，包括但不限于抗体与核酸。 

所述样品溶液，样品洗脱液，信号探针溶液，信号探针洗脱液和电化学检测缓冲溶液之间依次由长度为0.5cm以上的空气泡间隔开，以防止进样和上样过程中因压力的快速变化导致空气塞被挤压或溶液的不连续分散以至前后溶液混合，形成交叉污染。 

本发明中的微流控芯片的微通道网络是以稠密的弯曲微通道设计为基础，完整的覆盖单个三电极体系，包括工作电极，对电极和参比电极，以引导微尺度的流体均匀流经电极表面，同时不受电极表面材料亲、疏水性的影响，而宽的微通道内流体会非连续流经疏水性表面则会造成传感界面不均一。该微通道网络单元也适合公用一对参比和对电极的多工作电极体系。 

本发明创造性地将平面电极阵列，微流控芯片技术以及连续进样单元三种技术结合在一起形成了一种针对前列腺癌不同类型血清标志物进行同时检测的微流控电化学生物传感系统，将分别与目标抗原和目标miRNA相结合的单抗和核酸探针固定在阵列印刷电极表面，形成空间上相互独立的传感界面单元，实现了针对前列腺癌疾病包括蛋白和miRNA在内的不同类型肿瘤标志物的同时检测。 

本发明相对现有技术具有的有益效果如下： 

1）可同时检测针对前列腺癌的蛋白类和miRNA类等不同类型的多种肿瘤标志物； 

2）该系统操作简单，所需时间短，样品消耗量少，灵敏度高； 

3）本系统所涉及的器件制作简单，成本低，便于携带，易于集成化和微型化； 

4）本系统在使用时与多通道电化学工作站相连，可实现四通道甚至更高 通道如八、十六通道的同时检测，具体可同时检测4种标志物，8种标志物以及16种标志物，方便快捷，通量高，且同步性好，显著提高了检测效率； 

5）通过将免疫分析技术、DNA纳米技术和微流控芯片技术的结合实现了前列腺癌多种肿瘤标志物的特异性识别，对前列腺癌的诊断、分类、预后判断以及治疗具有重要指导意义。 

附图说明

图1是根据本发明的一个优选实施例的微流控电化学生物传感系统的立体结构示意图； 

图2是如图1所示的微流控电化学生物传感系统的剖面图； 

图3是基于4个三电极体系的微流控电化学生物传感器的形成的流程示意图； 

图4是不同浓度的人类前列腺癌标志物PSA在图1中所示的微流控电化学生物传感系统上检测的结果图； 

图5是不同浓度的人类前列腺癌标志物PSMA在图1中所示的微流控电化学生物传感系统上检测的结果图； 

图6是不同浓度的人类前列腺癌标志物IL-6在图1中所示的微流控电化学生物传感系统上检测的结果图； 

图7是不同浓度的人类前列腺癌标志物PF-4在图1中所示的微流控电化学生物传感系统上检测的结果图； 

图8是不同浓度的人类前列腺癌标志物miR21在图1中所示的微流控电化学生物传感系统上检测的结果图。 

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。 

如图1-图2所示，是根据本发明的一个优选实施例的针对前列腺癌不同类型的血清标志物进行同时检测的微流控电化学生物传感系统，该系统包括：用于运输不同功能溶液的连续进样单元1，由四个微通道网络21组成的微流控芯片2，通过所述微流控芯片2覆盖的电极阵列3，以及连接在微流控芯片 2下游的动力系统4。 

其中，连续进样单元1由透明的塑料小管11形成，提供一贯穿通道供各种功能溶液依次通入微流控芯片2的微通道网络21，各种功能溶液通过空气泡13彼此间隔形成不同的功能溶液区带12。优选地，空气泡13的长度需保持在0.5厘米以上，以防止进样和上样过程中因压力的快速变化导致空气泡13被挤压或溶液的不连续分散以至前后溶液混合，形成交叉污染。 

如图2所示，本实施例中优选微流控芯片2由四个蛇形微通道网络21制成，电极阵列3由四个三电极体系的印刷电极组成。其中，该四个三电极体系的工作电极a，b，c，d上可分别固定不同的捕获探针，本发明提供的优选实施例如下表1所示： 

表1 

其中，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4分别是PSA-Ab、PSMA-Ab、IL-6-Ab、PF-4-Ab中的任意一种，没有特异性指定；BSA为小牛血清白蛋白，为阴性对照；ssDNA-P为单链DNA探针，ssDNA-C为对照组单链DNA探针；TSP为DNA四面体纳米结构探针，TSP-C为对照组DNA四面体纳米结构探针。 

参见图3，示出了该微流控芯片2与电极阵列3的表面处理和键合过程。其中，电极阵列3具体由工作电极31，对电极32，参比电极33，以及电极印刷银导线34组成。首先，同时对含有微通道网络21的聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片2和被PDMS框选择性保护的电极阵列3进行等离子体处理；之后，移除保护工作电极表面抗体活性的PDMS框，使PDMS通道层和电极阵列层对齐键合。由于经等离子体处理后的芯片表面和电极阵列表面均产生了大量的 含氧官能团，界面的含氧基团可以发生交联反应而形成不可逆的芯片键合，无需机械螺丝和上下夹板任何外界的作用力。 

动力系统4作为连续进样单元1的动力源连接于微流控芯片2的下游，本优选实施例中选用一次性的注射器41，在使用时通过将注射器41的推柄拉至一定高度后用小木条或金属棒固定，从而在整个流道中形成真空负压，该负压作为流体驱动力进而实现连续进样单元1中各种功能溶液区带12的自动传送。为了保证真空负压的顺利形成，注射器41通过一段形变能力强且口径匹配的活塞式橡胶小管42与微流控芯片2的出口端连接。其中，活塞式橡胶小管42设计有可调的阀门，从而控制整个流道的开和关。而注射器41与橡胶小管42，橡胶小管42与微流控芯片2的出口端之间进一步通过合适的小管连接。 

实施例1 

本实施例是采用如图1所示的微流控电化学生物传感系统用于前列腺癌疾病多种蛋白类标志物的同时快速检测。步骤如下，首先将10-50μg/mL的PSA-Ab、PSMA-Ab、IL-6-Ab分别固定在电极阵列表面形成阵列电化学传感界面。通过1mL规格注射器连续手动抽取avidin-HRP、水、缓冲（0.01M磷酸盐，0.14M NaCl，2.7mM KCl，pH7.2），biotin-PSA、biotin-PSMA和biotin-IL-6的混合物，一定浓度的PSA、PSMA和IL-6抗原混合物溶液，各功能溶液区带之间分别间隔有0.5-1cm长的空气泡，各溶液区带体积在1-20μL；然后分别将制备好的芯片传感器、连续进样单元、真空系统连接成整体，注射泵的抽取流速调节到10-20μL/min，当看到传送单元内的溶液区带开始流向芯片传感器时，暂停抽取，快速调节流速到2-5μL/min。在溶液区带连续流通的过程中，电极界面固定的PSA-Ab、PSMA-Ab、IL-6-Ab依次结合样品区带中的0-500ng/mLPSA、PSMA和IL-6，10-20μg/mL生物素标记的二抗biotin-PSA、biotin-PSMA和biotin-IL-6，形成夹心结构后与信号探针溶液区带中的avidin-HRP偶联。经缓冲溶液和水洗脱掉未结合的探针复合物后，直接在进样口滴加20μL TMB溶液，无动力进样，将电极连接到电化学工作站进行安培检测，HRP酶催化TMB溶液中的H2O2循环放大电化学信号，获得图4，图5，图6的实验结果。 

实施例2 

本实施例是采用如图1所示的微流控电化学生物传感系统用于前列腺癌疾病包括蛋白和miRNA在内的不同类型肿瘤标志物的同时快速检测。步骤如下，首先将10-50μg/mL的PF-4-Ab和0-2μM的DNA四面体纳米结构探针固定在电极阵列表面（组装核酸探针的电极需先通过电化学氧化还原方法直接在电极表面沉积一层纳米金，或直接印刷纳米金层）形成阵列电化学传感界面。然后通过1mL规格注射器连续手动抽取avidin-HRP、水、缓冲液（0.01M磷酸盐，0.14M NaCl，2.7mM KCl，pH7.2））、生物素修饰的二抗biotin-PF-4和与miR21部分互补的信号探针链biotin-miR21的混合物，和一定浓度的PF-4、miR21的混合物溶液区带，区带之间间隔有0.5-1cm长的空气泡，其中各溶液区带的体积在1-20μL；分别将制备好的芯片传感器、连续进样单元、真空系统连接成整体，注射泵的抽取流速调节到10-20μL/min，当看到传送单元内的溶液区带开始流向芯片传感器时，暂停抽取，快速调节流速到2-5μL/min。在溶液区带的连续流通的过程中，电极界面固定的PF-4-Ab、DNA四面体纳米结构探针依次结合样品溶液区带中的0-500ng/mL PF-4和0-1nM的miR21，10-20μg/mL生物素标记的二抗biotin-PF-4、和biotin-miR21，形成夹心结构后与信号探针溶液区带中的avidin-HRP偶联。经缓冲溶液和水洗脱掉未结合的探针复合物后，直接在进样口滴加20μL TMB溶液，无动力进样，将电极连接到电化学工作站进行安培检测，HRP酶催化TMB溶液中的H2O2循环放大电化学信号，获得图7-图8的实验结果。 

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。