不规则趋化因子的中和抗体用于制备消除糖尿病心肾功能损害不良代谢记忆的药物的用途

摘要

本发明公开了不规则趋化因子（FKN）的中和抗体用于制备消除糖尿病心肾功能损害不良代谢记忆的药物的用途。本发明所述的不规则趋化因子的中和抗体用于制备消除糖尿病心肾功能损害不良代谢记忆的药物的用途，对于消除糖尿病心肾功能损害代谢记忆，保护糖尿病心肾靶器官的作用，具有积极的应用价值和临床意义。

说明书

技术领域

本发明涉及不规则趋化因子（Fractalkine，简称FKN）的中和抗体的新用途，尤其是涉及FKN用于制备消除糖尿病心肾功能损害不良代谢记忆的药物的用途。 

背景技术

目前，全球糖尿病患病率不断增加，其并发症的致死率和致残率居高不下，已成为危害人类健康的第三大慢性非传染性疾病。糖尿病患者若长期处于高血糖状态，即使随后血糖水平被降低，仍易于发生糖尿病相关并发症。糖尿病心肾功能损害是糖尿病常见的并发症。 

糖尿病“代谢记忆”是指糖尿病患者若长期处于高血糖状态，即使随后血糖水平得到控制，仍不能阻止心、肾、视网膜等靶器官继续受损的并发症发生的现象。动物和临床实验均已经证实“代谢记忆”现象的存在。20多年前Kern发现早期血糖控制不良的实验犬即使在后期将血糖控制良好, 糖尿病视网膜病变的发病率与血糖一直控制不良的糖尿病犬相当；Hammes等报告发病12周的糖尿病大鼠接受胰岛移植来控制血糖后，仍不能避免糖尿病视网膜病变的继续受损。DCCT/EDIC和UKPD两大临床研究证实1型和2型糖尿病患者均存在“代谢记忆”。“代谢记忆”现象的存在对糖尿病及其并发症的治疗提出了很大的挑战。消除“代谢记忆”可能是未来防止糖尿病并发症的重要方法，但是目前机制不明确，且无有效的治疗手段。 

多种分子信号途径可共同参与高血糖“代谢记忆”，在高血糖被控制后，这些途径仍继续起作用，介导糖尿病并发症的发生发展。氧化应激和硝化应激、炎症基因的持续高表达、晚期糖基化终产物的形成和沉积、表观遗传等因素均可能参与高血糖不良“代谢记忆”的发生和维持。临床研究发现1型糖尿病患者在血糖降至正常后，仍然存在血管内皮细胞功能受损。链尿佐菌素（streptozotocin，简称STZ）诱导的1型糖尿病大鼠在血糖升高6个月后再严格控制血糖7个月，视网膜氧化应激和3-硝基酪氨酸的水平仍持续升高，凋亡相关蛋白caspase-3的表达水平和重要炎症印记NF-κB的活性并不下降。表观遗传修饰可通过被持续表达与糖尿病血管并发症相关基因（促炎症基因和促纤维化基因等）参与“代谢记忆”的形成。目前并无有效消除糖尿病“代谢记忆”的治疗方法。虽然氧化应激可能在“代谢记忆”的发生起着重要的作用，理论上使用抗氧化剂应当有效，然而临床证实现有的抗氧化剂没有疗效。 

FKN是一种细胞趋化因子，以膜结合或可溶性分子的形式广泛存在于心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞及血液循环中，其功能的发挥依赖于与其特异性受体CX3CR1的结合。研究发现2型糖尿病患者血浆FKN水平和皮下脂肪FKN基因表达水平增加。CX3CR1基因多态性还与脂肪沉积和代谢有关，提示FKN可能参与糖尿病及其并发症的发生发展。我们最近发表的研究证实采用FKN中和抗体能有效改善心肌梗死和压力负荷诱导的心力衰竭小鼠的心功能。经文献检索，目前无关于FKN中和抗体治疗糖尿病心肾功能损害代谢记忆的研究报道。 

中和抗体（neutralizing antibody）指的是针对自然配体来中和自然配体或受体，从而阻断其与受体的结合或与自然配体的结合的抗体。目前靶向的中和抗体已经广泛用于肿瘤等多种疾病的治疗，例如血管生长因子（VEGF）中和抗体，重组人源化VEGF单克隆抗体BVZ是抗胃癌的代表性药物，肿瘤坏死因子alpha的中和抗体用于某些炎症疾病的治疗，显示了中和抗体在疾病靶向治疗中的光明前景。中和抗体的制备和评价已经有严格的行业标准，因此，不同生物制药公司可以制备出药效相当并达到临床应用标准的FKN中和抗体。一旦发现FKN中和抗体的新的适应症，则有望在临床上验证和推广。 

发明内容

本发明的目的是提供一种不规则趋化因子（FKN）的中和抗体用于制备消除糖尿病心肾功能损害不良代谢记忆的药物的用途，可作为消除糖尿病心肾功能损害不良“代谢记忆”进而防止糖尿病并发症（心肾等靶器官损害）的重要方法，解决目前因心肾功能损害不良“代谢记忆”的机制不明确而缺乏有效治疗手段的问题。 

采用STZ诱导胰岛功能受损导致血糖升高的方法建立1型糖尿病小鼠模型。让糖尿病小鼠维持高血糖4周后加用胰岛素治疗2周，比较治疗组与不治疗组的血糖水平、生存率及心肾功能，确认糖尿病“代谢记忆”的存在。另外比较胰岛素治疗2周组和FKN中和抗体治疗2周组糖尿病小鼠血糖、生存率及心肾功能，确认FKN中和抗体具有抑制心肾功能损害不良代谢记忆的制药疗效。 

本发明所述的不规则趋化因子（FKN）的中和抗体用于制备消除糖尿病心肾功能损害不良代谢记忆的药物的用途，对于消除糖尿病心肾功能损害代谢记忆，保护糖尿病心肾靶器官的作用，具有积极的应用价值和临床意义。 

附图说明

图1是各组小鼠（未治疗组、胰岛素治疗组、FKN中和抗体治疗组）的血糖水平比较图，显示胰岛素与FKN中和抗体对血糖水平的影响。 

图2是各组小鼠（胰岛素治疗组与非治疗组）的生存率图，显示FKN中和抗体降低代谢记忆所致的死亡率。 

图3是各组小鼠（对照组、糖尿病组、糖尿病+胰岛素组、糖尿病+FKN中和抗体组）的左心室短轴缩短率（FS）的比较图，显示FKN中和抗体抑制代谢记忆对心脏功能的损害。 

图4a是各组小鼠（对照组、糖尿病组、糖尿病+胰岛素组、糖尿病+FKN中和抗体组）的血清肌酐和尿肌酐水平比较图。 

图4b是各组小鼠（对照组、糖尿病组、糖尿病+胰岛素组、糖尿病+FKN中和抗体组）24小时尿微量蛋白含量比较图。 

具体实施方式

下面仅以实施例结合附图的方式对本发明做详细的说明。 

1. 实验目的 

观察FKN中和抗体对提高糖尿病动物生存率及改善心肾功能损害代谢记忆的治疗作用。

2. 实验材料 

甘精胰岛素，购自德国安万特制药有限公司，商品名为来得时（LANTUS）。

FKN中和抗体（TP233，Torrey Pines Biolabs，美国德克萨斯州休斯顿）。该FKN中和抗体可以中和重组及天然鼠源性FKN蛋白，其制备方法是通过表达小鼠FKN趋化因子区域的大肠杆菌作为免疫原，从而产生的多克隆抗体，成品为500微克的冻干粉，使用时采用PBS重溶为100μg/ml的FKN中和抗体溶液。 

基于本领域所熟知的中和抗体的制备方法和产品标准，本发明的实验也可采用其他不同生物制药公司的FKN中和抗体产品。 

3. 实验动物 

C57BL/6 雄性小鼠（11 -12周龄），体重约22-25 g，共100只。由南方医科大学实验动物中心提供。

4. 实验方法 

（1）1型糖尿病模型的建立及实验分组

一次性给予C57小鼠STZ（150 mg/kg）腹腔注射，3天后检测随机血糖，将血糖值大于等于20 mmol/L的小鼠纳入本研究实验。入选的1型糖尿病小鼠模型随机分为以下4组：对照组（未用STZ诱导）；糖尿病组；糖尿病+胰岛素组；糖尿病+FKN中和抗体组。每组10-40只。

（2）实验方法 

胰岛素治疗组在STZ注射后第5周开始加用甘精胰岛素，按照40 IU/kg/day的剂量给予小鼠背部皮下注射治疗2周；FKN中和抗体治疗组则在STZ注射后第5周开始加用FKN的中和抗体，按40 mg/kg/day的剂量给予腹腔注射2周。糖尿病组小鼠给予背部皮下注射等体积的生理盐水。STZ注射6周后进行各项指标的检测。

（3）观察指标 

血糖，治疗2周的生存率，超声心动图检测各组小鼠的心功能；检测各组小鼠血清和尿液肌酐水平和24小时尿微量蛋白含量，评估肾功能。

5. 实验结果 

A. 血糖分析

用STZ诱导1型糖尿病，第三天测血糖，三组之间的血糖水平相似。从第四周开始进行不同治疗，2周后（即STZ诱导后的第42天）测血糖，如图1所示，胰岛素治疗组（STZ胰岛素，n=15）较第3天时血糖明显降低 （P<0.001），而未治疗组（STZ， n=16）和FKN中和抗体治疗组（STZ FKN中和抗体，n=10）的血糖水平较第3天无下降。这些结果模拟了早期不控制血糖，在晚期分别控制和不控制血糖的临床情况。结果显示，STZ显著升高小鼠血糖，可持续至6周。后2周用胰岛素可较好控制血糖，而FKN中和抗体对血糖水平无明显影响（图1）。

B．生存分析 

用STZ诱导小鼠1型糖尿病4周后，治疗2周，观察小鼠的生存率（percent survival）。结果如图2所示，后期用胰岛素控制血糖后，胰岛素治疗组（STZ胰岛素）与非治疗组（STZ）的糖尿病小鼠的生存率相似，均无明显提高，而FKN中和抗体治疗组（STZ FKN中和抗体）的糖尿病小鼠死亡率显著低于未治疗及胰岛素治疗的糖尿病组，也就是生存率明显提高，表明后期用胰岛素控制血糖后对生存率无明显改善作用，而用FKN中和抗体则可明显减低小鼠死亡率。

C．超声心动图分析 

各组小鼠左心室短轴缩短率（FS）的比较。结果如图3所示，糖尿病组小鼠的FS较无糖尿病的对照组的FS明显下降，提示存在心功能损害；对比糖尿病组小鼠，FKN中和抗体治疗组小鼠的FS明显改善，而胰岛素治疗对FS无明显影响。图中*表示与糖尿病组比较，P<0.05。结果表明，胰岛素控制血糖后并不能阻止心功能的继续受损，而FKN中和抗体治疗可以减轻心功能受损。

D. 血清肌酐、尿液肌酐和尿微量蛋白分析 

结果如图4a所示，与无糖尿病的对照组小鼠相比，糖尿病小鼠血清肌酐和尿液肌酐水平明显升高；与糖尿病组小鼠比较，胰岛素治疗组血清肌酐和尿液肌酐水平均无明显下降，而FKN中和抗体治疗组小鼠血清肌酐和尿液肌酐水平均有明显下降。图中*表示与糖尿病组比较，P<0.05。

再如图4b所示，与糖尿病组小鼠比较，糖尿病小鼠24小时尿微量蛋白含量明显升高；与糖尿病组小鼠比较，胰岛素治疗组24小时尿微量蛋白含量无明显下降，而FKN中和抗体治疗组小鼠24小时尿微量蛋白含量明显下降。图中*表示与糖尿病组比较，P<0.05。结果表明，胰岛素控制血糖后并不能阻止肾功能的继续受损，而FKN中和抗体治疗可以减轻肾脏功能受损。 

以上在糖尿病代谢记忆小鼠模型中的实验结果表明：FKN中和抗体能有效消除糖尿病动物心肾功能损害代谢记忆，有效改善糖尿病动物的心肾功能（保护心肾靶器官），降低糖尿病死亡率（提高糖尿病生存率）。而胰岛素的有效降糖治疗则无此作用。