植物绿色组织特异性表达启动子pGreen及其应用

摘要

本发明公开了一种植物绿色组织特异性表达启动子pGreen，其为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。该植物绿色组织特异性表达启动子pGreen包含烟草花椰菜病毒35S启动子的增强子序列和玉米的10kDa光系统蛋白II（photosystem II10kDa）基因（GenBank ID：EU961665）的部分启动子序列。本发明还公开了上述植物绿色组织特异性表达启动子pGreen在制备具有抗虫能力的转基因植物的应用。本发明还公开了上述植物绿色组织特异性表达启动子pGreen在提高植物抗虫活性中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种在植物绿色组织中驱动基因表达的启 动子及其应用。

背景技术

随着世界人口的不断增加，人们对农产品的需求也日益增大，作为生命能源供应的粮 食尤为重要，如水稻和玉米等。然而在农业生产中，人类赖以生存的粮食和经济作物极易 受到虫害的侵袭而减产或使得农产品品质下降甚至产生对人体有毒、有害的物质，造成较 大损失。在现代农业中，使用化学杀虫剂是减少虫草害的重要方法。但是，化学杀虫剂的 长期、大量使用不仅令生产成本增高，还给生态环境和人畜安全带来一系列危害。

当今，人们对食物安全性和环保性日益重视，减少甚至杜绝化学农药的使用是农业生 产的新要求。培育转基因抗虫作物成为一种有效的途径。这种新的技术从1996年开始在 世界范围内大规模地应用。目前，世界上应用最为广泛的抗虫基因是Bt（Bacillus  thuringiensis）杀虫基因^[1，2]。2010年全球转基因作物种植面积达到1.48亿hm²,占全球耕地 总面积的10%，其中39%是转入Bt杀虫基因^[3]。转基因抗虫作物的种植可以大幅度减少杀 虫剂的使用量，这不仅大大降低了农民的种植成本，而且对保护人类健康和生态环境都有 积极的意义。

随着对转Bt基因作物的进一步的研究和广泛的应用，问题也日益凸显，主要体现在两 方面，一是害虫对转基因作物产生抗性；二是转基因作物食用安全性问题，尤其是水稻， 它作为全球一半以上人口的口粮，公众对转基因水稻的食用安全性更是存在着顾虑和质 疑。目前用于转基因抗虫的Bt杀虫蛋白中Cry(Crystal Protein，Cry)蛋白是目前研究最深入、 应用最广泛的Bt杀虫毒素，但目前已发现多种害虫对其产生了抗性^[4-7]；而VIP(Vegetative  Insecticidal Protein，VIP)杀虫蛋白是一种与ICPs完全不同的新型杀虫蛋白，对于扩大杀虫 谱、延缓害虫抗性都具有深远意义^[8,9]。这些基因资源都已成为构建抗虫农作物新品种的 重要武器。但是这些基因在转基因植株中多利用组成型的启动子驱动其表达，这种表达方 式由于违背了植物的自然生理活动规律，不仅可能达不到转基因的目的，甚至对转基因植 物自身的生理活动造成了极大伤害^[10-12]。

针对以上问题，人们做了诸多研究以延缓昆虫抗性、提高杀虫活性并最大限度地降低 转基因作物的安全隐患问题，例如堆叠多种杀虫基因，或使用组织特异性启动子。启动子 （promoter）是一段位于结构基因5’端上游调控基因表达的DNA序列，有组成型表达、诱 导型表达和组织特异型表达3种类型。组织特异型表达的启动子现在被认为是对目的基因 实现高量表达的重要途径，也是培育高效、安全的转基因作物的首选^[13]。

绿色组织特异启动子是高等植物组织特异性启动子中的一种，驱动外源基因在茎叶等 绿色组织中特异表达，它既可以用于以茎叶为主要收获产物的作物，使蛋白质产物富集于 茎叶中，减少宿主植物无谓的物质能量消耗，改善光合作用特性；也可以用于以种子、果 实为主要收获产物的作物，让抗虫、抗除草剂等外源基因只在茎叶部分而不在种子果实等 器官中表达，解除人们对转基因作物食品安全性的顾虑^[14]。同时，植物来源的启动子不会 造成基因的逃逸。鉴于此，绿色组织特异性启动子在植物基因工程研究中具有广泛的应用 前景。

上文中涉及的参考文献具体如下：

[1]Grochulski P,L Masson,S Borisova,M Pusztai-Carey,J L Schwartz,R Brousseau and M  Cygler.(1995)Bacillus-Thuringiensis Cry1a(a)Insecticidal Toxin-Crystal-Structure and  Channel Formation.J Mol Biol254(3)：447-464（苏云金芽孢杆菌Cry1a（a）杀虫毒素晶 体结构和孔道形成）；

[2]Vaeck M,A Reynaerts,H Hofie,S Jansens,MD Beukeleer,C Dean,M Zabeau,MV  Montagu,J Leemans.(1987)Transgenic plants protected from insect attack.Nature328:33-37 （转基因植物能防止害虫侵害）；

[3]James C.(2010)A global overview of biotech(GM)crops:Adoption,impact and future  prospects.GM Crops1(1):8-2（关于生物技术农作物的一个全球性回顾：应用，影响和前 景）；

[4]Matten SR,G P Head and HD Quemada.(2008)How governmental regulation can help or  hinder the integration of Bt crops into IPM programs.In:J.Romeis,A.M.Shelton and G.G. Kennedy(Eds.),Integration of Insect-Resistant Genetically Modified Crops within IPM  Programs.New York,Springer:27-39（政府调控如何帮助或阻止Bt作物整合进入害虫综合 治理系统）；

[5]Huang F,B R Leonard and D A Andow.(2007)Sugarcane borer(Lepidoptera:Crambidae) resistance to transgenic Bacillus thuringiensis maize.J Econ Entomol100(1):164-171（甘蔗螟 虫（鳞翅目：草螟科）对转苏云金芽孢杆菌基因玉米的抗性）；

[6]Downes S,T Parker and R Mahon.(2010)Incipient Resistance of Helicoverpa punctigera  to the Cry2Ab Bt Toxin in Bollgard II Cotton.PLoS One5(9):e12567（棉铃虫对Bollgard II 棉中Bt毒素Cry2Ab的初期抗性）；

[7]Van Rensburg J B J.(2007)First report of field resistance by stem borer,Busseola fusca (Fuller)to Bt-transgenic maize.S African J Plant Soil24:147-151（关于二化螟，玉米楷夜蛾 对转基因Bt玉米的田间抗性的首例报告）；

[8]Estruch J J,G W Warren,M A Mullins,G J Nye,J A Craig and M G Koziel.(1996)Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities  against lepidopteran insects.Proc Natl Acad Sci USA93(11):5389-5394（一种新型的具有对 鳞翅目昆虫的光谱杀虫活性的苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3A）；

[9]Lee M K,F S Walters,H Hart,H Palekar and J S Chen.(2003)The mode of action of the  Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A differs from that of Cry1Ab  delta-endotoxin.Appl Environ Microbiol69(8):4648-4657（苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白 Vip3A的作用模式与δ-内毒素Cry1Ab不同）；

[10]Karlowski WM and AM Hirsch.(2003)The over-expression of an alfalfa RING-H2 gene  induces pleiotropic effects on plant growth and development.Plant Mol Biol52:121-133（一 个αRING-H2基因的过表达对植物生长发育的多效性影响）；

[11]Miyao M and H Fukayama.(2003)Metabolic consequences of overproduction of  phosphoenolpyruvate carboxylase in C3plants.Arch Biochem Biophys414:197-203（过生 产磷酸烯醇丙酮酸羧化酶在C3植物中的代谢后果）；

[12]Chem M,H A Fitzgerald,P E Canlas,D A Navarre and P C Ronald.(2005) Overexpression of a rice NPR1 homolog leads to constitutive activation of defense response and  hypersensitivity to light.Mol Plant Microbe Interact18:511-520（一个水稻NPR1同源基因 的过表达导致防御反应和光敏性的基本激活）；

[13]Liu J J and A K Ekramoddoulah.(2003)Root-specific expression of a western white pine  PR10gene is mediated by different promoter regions in transgenic tobacco.Plant Mol Biol52: 103-120（在转基因烟草中由不同启动子区域调控的一个西方白松PR10基因在根的特异 表达）；

[14]Wang M,X-J Wang,Q-L Tang,Z-X Wang and Y-Q Wang.(2010)Research Progress on  Plant Green Tissue Specific Promoter.J Agricul Sci Tech12(2):33-37（王淼，王旭静，唐巧 玲，王志兴和王育青。(2010)高等植物绿色组织特异表达启动子研究进展。中国农业科技 导报12（2）：33-37.）

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种植物绿色组织特异性表达启动子pGreen及其应 用植物绿色组织特异性表达启动子pGreen及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种植物绿色组织特异性表达启动子pGreen，为 SEQ ID NO:1（即，序列表NO1）所示的核苷酸序列。

当然，该启动子pGreen也可以为满足以下任意一个条件的启动子：

在严格条件下能与SEQ ID NO:1所示序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；

与SEQ ID NO:1所示序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。

作为本发明的植物绿色组织特异性表达启动子pGreen的改进：植物绿色组织特异性表 达启动子pGreen包含烟草花椰菜病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV)35S启动子的增强子 序列（NCBI Reference Sequence:NC_001497.1）和玉米的10kDa光系统蛋白II（photosystem  II10kDa）基因（GenBank ID：EU961665）的部分启动子序列（具体为TIGR maize  database(http://maize.jcvi.org/)中的AZM5_84822genome序列中EU961665基因上游 -471bp～-41bp的序列）。

备注说明：上述增强子序列和启动子序列在SEQ ID NO:1中为带有不同下划线的序列。

作为本发明的植物绿色组织特异性表达启动子pGreen的进一步改进：玉米的10kDa光 系统蛋白II（photosystem II10kDa）基因（GenBank ID：EU961665）的部分启动子序列为 以下任一：

1）SEQ ID NO:2（即，序列表NO2）所示的核苷酸序列；

2）SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经替换、缺失或增加一个或几个核苷酸，且具有相 同功能的核苷酸序列；

3）由SEQ ID NO:2产生的具有控制基因在植物绿色组织特异表达的DNA功能片段。

本发明还提供了一种表达盒，利用上述植物绿色组织特异性表达启动子pGreen与目的 基因连接所构建而得。

本发明还提供了一种植物表达载体，利用上述植物绿色组织特异性表达启动子pGreen 构建而得。

作为本发明的植物表达载体的改进：植物表达载体为pCambia1300-p35S-G6- pGreen-Cry1Ac。

本发明还同时提供了上述植物绿色组织特异性表达启动子pGreen在制备具有抗虫能 力的转基因植物的应用。植物为水稻、玉米、棉花、小麦、大豆或高粱。

本发明还同时提供了上述植物绿色组织特异性表达启动子pGreen在提高植物抗虫活 性中的应用。植物为水稻、玉米、棉花、小麦、大豆或高粱。

备注说明：本发明中玉米绿色组织特异表达启动子的来历：水稻中photosystemII 10-kDa的蛋白基因名为D540，玉米中与水稻D540的同源基因为GenBank ID：EU961665， 该基因上游的部分启动子序列被发明人分离出来，也可以在植物绿色组织中特异性表达， 该段启动子为TIGR maize database(http://maize.jcvi.org/)中的AZM5_84822genome序列中 EU961665基因上游-471bp～-41bp的序列。发明人在这段启动子上游又加上了35S增强子序 列，从而形成了在植物绿色组织中高效特异表达的启动子pGreen。

本发明目的在于提供一种由玉米的10kDa光系统蛋白II（photosystem II10kDa）基 因（GenBank ID：EU961665）的部分启动子序列（见SEQ ID NO:2）并添加CaMV（35S） 启动子的增强子序列而得的启动子，其DNA序列为SEQ ID NO：1。该启动子驱动基因 在植物茎、叶等绿色组织特异、高效表达，而在胚和胚乳中不表达或表达量极低至可检测 水平以下，命名为pGreen。

本发明另一目的在于提供该启动子在制备转基因植物以及提高植物抗虫和/或抗除草 剂活性中的应用。

本发明涉及分离、改良和应用一种包含玉米的10kDa光系统蛋白II（photosystem II10 kDa）基因（GenBank ID：EU961665）的部分启动子序列的DNA片段，该片段包含调控 基因在植物茎、叶等绿色组织中特异表达的调控原件。其中所述片段如序列表SEQ ID  NO:1和/或SEQ ID NO:2所示，或基本上相当于SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的 DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的序列的亚片段。

本领域技术人员可以将本发明启动子用于构建绿色组织特异表达的表达载体。此外还 可以将目的基因与本发明的启动子连接构建表达盒，进一步可将该表达盒导入植物表达载 体，获得绿色组织特异表达的重组表达载体。因此，本发明还包括由上述启动子构建的表 达载体、表达盒，以及含有上述表达盒的重组载体。

本发明的启动子可以用于制备转基因植物。例如，通过农杆菌介导、基因枪法或花粉 管通道等方式获得转基因植物，从而可以通过引入抗虫、抗除草剂、抗病等基因，培育出 抗虫、抗除草剂、抗病等植物，提高植物抗虫、抗除草剂、抗病活性。植物可以是水稻、 玉米、棉花、小麦、大豆、高粱等。这些植物转基因技术是已经现有的技术。这些被转入 植物的抗性基因可以是现有的或/和根据现有基因改良的或/和新发现的基因。

本发明提供了一种可以增强植物转基因安全性的方法。这种方法包括将上述具有启动 子功能的DNA片段和需要的功能基因连接转入植物，由于该启动子不在胚和胚乳中表达 或表达量极低至可检测水平以下，避免了转基因作物可能产生的食品安全问题。

本发明能够进一步提供或应用利用上述具有启动子功能的DNA片段获得的转基因植 株和相应的种子，可以用有性杂交的方式将本发明的启动子转入其它的植株。

在本发明实施例中，利用SEQ ID NO:1所述启动子pGreen构建得到植物表达载体 pCambia1300-p35S-G6-pGreen-Cry1Ac（如图1b所示），通过农杆菌介导的遗传转化方法 将所述载体转化水稻品种，可以获得对棉铃虫幼虫和除草剂草甘膦均具有良好抗性的植 株。且外源的杀虫蛋白在转基因水稻茎、叶特异性表达，而在其种子中不表达或表达量极 低至可检测量以下。

本发明的启动子为绿色组织特异表达，可以用于基因在绿色组织特异表达的研究。

本发明适用于所有植物，包括单子叶和双子叶植物。即，包括水稻、玉米、棉花、小 麦、大豆、高粱等粮食作物和经济作物。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是本发明实施例1中载体示意图；

a：初始载体pCambial 1300结构示意图；

b：植物转化载体pCambial 1300-p35S-G6-pGreen-Cry1Ac的T-DNA结构示意图；

c：植物转化载体pCambial 1300-p35S-G6-pZmUbi-Cry1Ac的T-DNA结构示意图。 其中Ubi表示玉米ZmUbi启动子，35S表示花椰菜花叶病毒CaMV的35S启动子，pGreen 表示本发明提供的绿色组织特异性启动子。

图2是转基因和非转基因水稻对棉铃虫一龄幼虫的生物测定图；

A：携带pGreen启动子的转基因水稻，对棉铃虫一龄幼虫有很好的抗性；

B：非转基因亲本水稻“秀水-134”作为阴性对照。

图3是转基因水稻对草甘膦的抗性检测图；具体为：对温室水培长至约15cm的秧苗喷 施稀释100倍的41%草甘膦水剂，7天后拍照；A1、A2是转pCambial  1300-p35S-G6-pGreen-Cry1Ac抗虫抗除草剂水稻，CK是非转基因亲本水稻。

图4是通过棉铃虫生物测定和Western blot分析筛选出抗虫基因表达量高的转基因株 系，重新提取叶片和种子的可溶性蛋白测定融合蛋白表达水平图；

M，预染蛋白marker；+，阳性对照，pET28a-Del-Cry1Ac-Cry1Ie表达载体表达的蛋 白；-，阴性对照，非转基因植株“秀水-134”;1，2和3分别表示携带pGreen启动子的不 同转基因株系；4和5分别表示携带ZmUbi启动子的不同转基因株系；L，代表从植株叶 片中提取的蛋白；S，代表从植株种子中提取的蛋白。携带pGreen的株系种子中检测不到 抗虫蛋白，而ZmUbi株系中可以检测到。

图5是转基因水稻T₁代S20株系单棵植株叶片、种子中抗虫蛋白表达分析图；

a：随机选取株系S20中10棵植株提取叶片可溶性蛋白进行Western Blot检测；M,预 染蛋白marker；+，原核菌株表达阳性蛋白；-，非转基因植株“秀水-134”作为阴性对照；

b：选取编号为7,8,9的植株提取叶片和种子中的可溶性蛋白进行检测；L，表示从植 株叶片中提取的蛋白；S，表示从种子中提取的蛋白；M和+同上；-，从非转基因水稻种 子中提取的蛋白。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。 在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均 属于本发明的范围。

若未特别指明，本发明以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为本领域技 术人员所熟知的常规方法。

实施例1：植物表达双元载体构建

选取cry1Ac（已公开基因，GenBank:AY225453.1）抗虫基因为研究对象，分别用本 发明的绿色组织特异启动子pGreen（序列见SEQ ID NO：1）和组成型启动子ZmUbi(Zea  mays Ubiquitin-1)（作为对照）驱动抗虫基因表达，以抗草甘膦基因G6（专利申请号： 200610052573.4）作为筛选标记基因，构建双元表达载体。

具体如下：

1）、对pCambia1300（Cambia,Australia；图1.a）载体进行改造：

将原有的抗潮霉素基因替换为抗草甘膦基因G6，改造过的载体可以用HindKpn进Ⅰ行酶切，以它作为构建T-DNA的基础载体pCambia1300-p35S-G6。

具体为：首先用PCR方法分别扩增玉米ubi基因和G6基因，通过PCR一方面在ZmUbi 启动子基因两端分别加上HindIII和BamHI酶切位点，另一方面在G6基因两端分别加上 BamHI和XhoI+SacI位点。然后将PCR获得的ubi基因和G6基因顺次克隆入通用载体 pMD19-T（Takara，Japan）载体中。用HindIII和XhoI酶切上述所得的载体，从而获得 pZmUbi-G6片段。接着，将载体pCambia 1300上的潮霉素抗性基因用XhoI酶切去除，将 酶切后的载体回收后末端补平，与同样末端补平的片段pZmUbi-G6连接，得到基础载体 pCambia 1300-p35S-G6。

2）、根据基因在水稻中表达密码偏好性合成抗虫基因（Sangon Biotech ,上海）：

用正向5’-ACGGGATCCATGGATAACAATCCGAACATC和反向5’- ACGGAGCTCCTATTCCTCCATAAGGAG引物（下划线部分分别为BamHI和SacI酶切位点） 扩增Cry1Ac基因；

扩增体系50μl：

第一步95℃ 2min；第二步95℃ 30s→60℃ 30s→72℃ 3min 循环30次；第三步 72℃ 7min延伸反应；最后降温至4℃结束。

对上述所得到的PCR产物进行酶切，回收片段并连接到PMD-19T载体（Takara，Japan） 上，用大肠杆菌TG1感受态细胞转化克隆，用BamHI和SacI酶切得到基因Cry1Ac片段。

3）、在玉米的10kDa光系统蛋白II（photosystem II 10 kDa）基因（GenBank ID： EU961665）的部分启动子序列上游（5‘端）添加CaMV（35S）增强子，命名为pGreen （序列见SEQ ID NO：1），该改造的启动子pGreen由上海生工合成，合成基因用HindⅢ 和BamHI进行酶切并回收片段。

4）、用HindIII和KpnI酶切pCambia1300-G6载体，得预酶切的载体；

把启动子（即，pGreen）、Cry1Ac基因和预酶切的载体以三段连接的方式进行连接， 得到载体pCambial1300-p35S-G6-pGreen-Cry1Ac，以下简作pGreen-Cry1Ac（图1.b）。

5）、以玉米ZmUbi启动子替代步骤4）中的启动子（即，pGreen），其余完全同步骤 4），获得pCambial1300-p35S-G6-pZmUbi-Cry1Ac载体(图1.c)，以下简作pUbi-Cry1Ac。

实施例2：农杆菌介导的水稻转化

农杆菌介导的水稻转化借鉴Hiei等和Nishimura等的实验方法(Hiei et al.,1994; Nishimura et al.,2007)。以抗草甘膦基因G6为筛选标记。用分别携带pGreen-Cry1Ac和 pUbi-Cry1Ac的农杆菌LBA4404（一种农杆菌携带pGreen-Cry1Ac，一种农杆菌携带 pUbi-Cry1Ac）侵染诱导得到的新鲜愈伤，共培养三天后，用无菌水反复冲洗愈伤，并用 加200mg/L Timentin的无菌水120rpm，28℃摇一小时，然后用灭菌滤纸吸干愈伤表面水分， 转入含2mM草甘膦(Sigma,USA)和100mg/L Timentin的筛选培养基上进行筛选，筛选周期 为三周，共筛选两次。可以观察到新鲜有活力的抗性愈伤长出；将筛选得到的抗性愈伤转 入预分化培养基，预分化1周后，转入干燥皿中干燥3三天，然后把抗性愈伤转入分化培养 基分化得到水稻幼苗；待幼苗长至3—4cm时转入含有0.1mM草甘膦的生根培养基中培养； 根生长完全后，打开培养瓶盖练苗3—4天，移栽到温室用营养液培养。

备注说明：上述培养基及相应的培养方法在“Hiei et al.,1994;Nishimura et al.,2007” 等文献中有明确告知。

实施例3：T₀代转基因水稻分析

1.转基因水稻幼苗对棉铃虫的抗性检测

用携带特异启动子pGreen和ZmUbi启动子的农杆菌侵染愈伤分别获得226和159个 转基因株系。以“秀水-134”非转基因植株作为对照，用一龄棉铃虫（H.armigera）幼虫对 非转基因和所有转基因水稻株系幼苗叶片进行生物测定。待测植株生长期为3-5子叶时， 取1-2片叶子置于铺有一层滤纸的75mm培养皿上，滤纸上加200ul的无菌水保湿，温室 培养，48小时后观察结果。同非转基因植株对照相比，转基因株系对棉铃虫有很好的抗 性（图2）。其中，含有特异启动子pGreen的株系中抗棉铃虫的有156株，69.03%；含 有ZmUbi启动子的株系抗棉铃虫的有97株，占其总株数的61.01%。

2.转基因植株抗草甘膦生物活性的测定

取生物测定为阳性的含pGreen启动子的转基因水稻植株，以非转基因水稻“秀水 -134”作为阴性对照（即，CK），将水稻植入水培液中，待秧苗长至15cm左右时，喷施草 甘膦除草剂（将41%水剂稀释100倍），喷后7天观察植株生长情况。发现7天后，对照 植株死亡，而转基因水稻生长情况良好（如图3）。

水稻水培储备液

1）储备液1

NH₄NO₃     91.6g/L

CaCl₂      88.6g/L

2）储备液2

NaH₂PO₄·2H₂O  40.3g/L

K₂SO₄          71.4g/L

3)储备液3

MgSO₄·7H₂O 324g/L

4）微量元素储备液

以上试剂分别溶解，然后加50ml浓硫酸，加水至1L。

每4L水稻培养液配方：

加水至4L，调PH4.5-5.0。

3.含不同启动子的转基因株系叶片和种子蛋白表达水平对比

为进一步研究pGreen启动子和ZmUbi启动子的组织表达特异性，分别从叶片和种子 中提取蛋白，继续用Western blot分析。转基因与非转基因水稻叶片中的可溶性总蛋白按 照TRIzol(Invitrogen,USA)程序来提取。而种子中的可溶性总蛋白采用磷酸盐缓冲液 （PBS）来提取。蛋白样品首先用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来分离，然后转到 纤维素膜上，兔抗Cry1Ac的血清作为一抗，羊抗兔交联的辣根过氧化酶(Promega,USA)作 为二抗，TMB(Promega,USA)作为显色液，最低可见蛋白表达量为1ng。结果显示含有 ZmUbi启动子的株系在叶片和种子中都有表达，并且表达水平一致。而携带pGreen启动 子的株系，抗虫蛋白只在叶片中有表达，在种子中却检测不到（图4）。

实施例4：T₁代转基因水稻株系分析

在含pGreen启动子的转基因株系中，选取综合考虑转基因植株农艺性状、抗虫和抗 草甘膦活性均较好且T-DNA呈单拷贝插入的优秀株系S20为进一步研究对象。

1.S20株系对二化螟和稻纵卷叶螟的抗性

将转基因水稻S20株系T1代和对照非转基因水稻亲本种在浙江大学华家池校区实验 田中，待植株长到15cm左右，喷施草甘膦杀死分离出来没有外源基因转入的植株。从播 种到成熟全生育期不喷施防螟虫的农药，任其自然发展，从分蘖期开始观察和记录鳞翅目 害虫稻纵卷叶螟和二化螟对水稻的危害。统计结果显示，对照14%受到稻纵卷叶螟的危 害，8%受到水稻二化螟的危害，而S20没有受到这两种害虫的危害。由此说明转基因株 系S20对这两种鳞翅目害虫有很好的抗性。

2.S20株系抗虫蛋白表达水平测定

为了研究转基因水稻T₁代S20株系中单棵植株抗虫蛋白表达量是否一致，在实验田 中随机采取10棵植株的叶片和种子，Western blot分析融合基因表达蛋白水平。Western blot 方法如实施例3第3条所述。结果发现，10株水稻叶片的蛋白表达量大致相同（图5a）， 并且抗虫蛋白仍然只在叶片中检测得到而在种子中检测不到（图5b）。因此，转基因株系 S20表达抗虫基因表达蛋白在不同植株中呈现稳定性和组织特异性。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明 不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直 接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江大学

 

<120> 植物绿色组织特异性表达启动子pGreen及其应用

 

<160> 2

 

 

<210> 1

<211> 953

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 植物绿色组织特异性表达启动子pGreen

 

<400> 1

atggtggagc acgacactct cgtctactcc aagaatatca aagatacagt ctcagaagac    60

caaagggcta ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatcgg gaaacctcct cggattccat    120

tgcccagcta tctgtcactt catcaaaagg acagtagaaa aggaaggtgg cacctacaaa    180

tgccatcatt gcgataaagg aaaggctatc gttcaagatg cctctgccga cagtggtccc    240

aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct    300

tcaaagcaag tggattgatg tgataacttt ccgtaggaag caaaaatcat ccgaaacttt    360

gagagataaa agtctgcacc ctggtgagct gggcaccaca ggtcgttctt gattgatcct    420

ttttcatggc aaagcaaagc acactcgatc ctccatcaca aaaaatcccc tcccattccc    480

caccccaccc tagcgcgagg ccgtagtacg aatccagcgg cggagtacgt ccacacgaaa    540

tccagagaga ggggataagg ttccggggcc agccaaagcc atatcgtggt gcagccactg    600

gcgcgccgcc acgtggggcg gcggtggtca cacctgcgct ccgtcccggc attatcgcca    660

gggcttggcg ccacagctag tatattggct agcttttggc tcggcagcta acgacctgca    720

gccaaccatc taccagcgac tcagcgagcg agagcagcac ggtgcgtgcc acctagcctg    780

ctgccgcggc ctgtgtgtag atcactgtca gcttagctag ctgcttttcg tccggccccg    840

gtggccgggt gtggttctga cttctgagct gagtcgtcgt cgtgatcgtt cgtgcatgca    900

tgtccgcagg gattactgca cgcagctagc taggagcagc agcagcggcg gcg           953

 

 

<210> 2

<211> 628

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 玉米的10kDa 光系统蛋白II（photosystem II 10 kDa）基因（GenBank ID：EU961665）的部分启动子序列

 

<400> 2

actttccgta ggaagcaaaa atcatccgaa actttgagag ataaaagtct gcaccctggt     60

gagctgggca ccacaggtcg ttcttgattg atcctttttc atggcaaagc aaagcacact     120

cgatcctcca tcacaaaaaa tcccctccca ttccccaccc caccctagcg cgaggccgta     180

gtacgaatcc agcggcggag tacgtccaca cgaaatccag agagagggga taaggttccg     240

gggccagcca aagccatatc gtggtgcagc cactggcgcg ccgccacgtg gggcggcggt     300

ggtcacacct gcgctccgtc ccggcattat cgccagggct tggcgccaca gctagtatat     360

tggctagctt ttggctcggc agctaacgac ctgcagccaa ccatctacca gcgactcagc     420

gagcgagagc agcacggtgc gtgccaccta gcctgctgcc gcggcctgtg tgtagatcac     480

tgtcagctta gctagctgct tttcgtccgg ccccggtggc cgggtgtggt tctgacttct     540

gagctgagtc gtcgtcgtga tcgttcgtgc atgcatgtcc gcagggatta ctgcacgcag     600

ctagctagga gcagcagcag cggcggcg                                        628