一株丛赤壳属真菌及其在制备菌纹木中的应用

摘要

本发明公开了一株丛赤壳属真菌（

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种侵染时间短，色泽及纹理美观，对木质基材料物理力学强度无影响的丛赤壳属真菌菌株及其在制备菌纹木中的应用。

背景技术

木材的真菌色变长期以来被视为木材的缺陷，降低了木材的价值，实际上真菌的色变，如线条、染色等，具有自然天成、独一无二的特点，具有唯一性的自然美，当腐朽不严重时可以作为木材的一种奇妙的修饰。若利用这种带有自然线条或色彩的木材制作工艺品，如花瓶、耳环、钢笔、贴木单板等，可提高木材的附加价值。带有天然花纹和色泽的菌纹木在市场，尤其装饰、装修、工艺品市场将会受到欢迎。

但是天然获得的菌纹木仍存在以下不足：1、原料不易获得，带有很强的偶然性，因为天然菌纹木在自然界中只有在具有可形成菌纹木的菌种存在时才有可能形成，所以只有少部分林中的枯枝倒木中能找到少量菌纹木；2、天然菌纹木形成的时间长，受到很多气候、环境因素的影响，如干燥、寒冷、缺氧、阳光强烈、其他微生物干扰等；3、天然菌纹木在自然条件下形成，易受到虫害或其他真菌侵染，使木材不完整或形成不美观的腐朽或变色。

因此，有必要分离、改良一种侵染时间短，色泽及纹理美观，对木质基材料物理力学强度无影响的菌株，用其对木质基材料进行侵染处理制备菌纹木，以满足装饰、装修、工艺品制作的需要。

发明内容

本发明要解决的第一技术问题在于提供一种侵染时间短，色泽及纹理美观，对木质基材料物理力学强度无影响的真菌菌株。

本发明要解决的第二技术问题在于提供所述真菌菌株在制备菌纹木中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案。

除非另有说明外，本发明中所采用的百分数均为体积百分数。

一株丛赤壳属真菌菌株（Nectria rigidiuscula），命名为J12WU，经鉴定为丛赤壳属的一种真菌（Nectria rigidiuscula）的一个株系，是从腐朽的树桩、倒木或枯枝中分离得到，已于2012年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100080），其保藏编号为CGMCC No：5963。

一种用所述丛赤壳属真菌菌株（Nectria rigidiuscula）J12WU制备菌纹木的方法，包括菌株活化与扩繁、接菌培养工序，具体包括以下步骤：

A、菌株活化与扩繁：将丛赤壳属真菌菌株J12WU接种到活化与扩繁培养基上，在22~30℃下培养7~15天至生长旺盛的菌落形成，得活化与扩繁菌株；

活化与扩繁培养基为PDA培养基、PDA液态培养基、MA培养基、OA培养基中的任一种；

B、接菌培养：将待接种的木质基材料灭菌后，与活化及扩繁后的菌株充分接触，在22~30℃下培养1周或以上，即得菌纹木。

本发明的有益效果包括以下几个方面。

1、本发明所述菌株对木质基材料的侵染效果好，在非常短的时间内即可在木质基材料表面产生彩色染色花纹。采用固体接菌法，在处理后的第2周，基材表面即有染色花纹产生。采用液体接菌法，在处理后的第1周，基材表面即有染色花纹产生。

2、本发明所述菌株及菌纹木的制备方法对木质基材料的物理力学性能，如质量、硬度、强度等无影响。接菌处理后的第4周，电镜扫描结果显示，真菌对木材细胞的损伤轻微，表明菌纹木的质量、硬度、强度等与健康正常材均无显著差别。

3、本发明所述菌纹木的制备方法技术路线合理、操作流程简单、原料易得、成功率高，有利于大规模生产和推广应用。

附图说明

图1为实施例2中西南桤木处理4周后横切面的表面的花纹。

图2为实施例2中西南桤木处理4周后横切面的表面的花纹。

图3为实施例2中西南桤木处理4周后纵切面的表面的花纹。

图4为实施例5中西南桤木处理后横切面表层花纹处扫描电镜图。

图5为实施例5中西南桤木处理后弦切面靠近花纹处扫描电镜图。

具体实施方式           

下面对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换，均落入本发明的保护范围。

一株丛赤壳属真菌菌株（Nectria rigidiuscula）J12WU，于2012年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100080），其保藏编号为CGMCC No：5963。

所述菌株能够在木质基材料表面形成彩色的线状、带状、块状、团状、点状花纹中的任一种或几种。

所述菌株在木质基材料表面形成红色系的线状、带状、块状、团状或点状花纹中的任一种或几种的概率更高，高于其他色系的花纹的形成概率。

所述菌株在接种到木质基材料后的第1周即能在木质基材料的表面产生枚红色、大红色、暗红色、棕红色的染色花纹。

所述菌株在接种到木质基材料第1周后，所产生的花纹能深入木块达0.05~0.09cm。

所述菌株是通过下述具体步骤获得的：

A、标本采集：在腐朽树桩、倒木或枯枝中，采集具有彩色的线状、带状、块状、团状或点状花纹中的任一种或几种的木质基材料组织，连带其上面生长的真菌子实体，保存备用；

B、菌株分离与筛选：将采集的木质基材料组织，连带其上面生长的真菌子实体破碎、消毒后，置于富集培养基中在22~30℃黑暗中静置培养7~15天至长出菌丝；富集培养基为PDA培养基、MA培养基、OA培养基中的任一种；

然后将向四周周围呈发散状、疏松的丝状、大红色、边缘平整、甚至形成粘液状鲜黄色分生孢子的菌落挑取，接种至增殖培养基中在22~30℃黑暗中静置培养5~12天至菌落长出；增殖培养基为PDA培养基、MA培养基、OA培养基中的任一种；

C、菌种保存：挑取增殖培养基中生长旺盛者接种至保存培养基中，在22~30℃黑暗中静置培养5~12天，于4℃冰箱中冻存；保存培养基为PDA培养基、MA培养基、OA培养基中的任一种；

PDA培养基成分以g/L计为：马铃薯160~240、葡萄糖10~20、琼脂14~20、自然pH；

PDA培养基成分以g/L计优选为：马铃薯200、葡萄糖15、琼脂17、pH 6.5~7.0；

MA培养基成分以g/L计为：麦芽膏21~28、琼脂14~20、PH6.0~7.5；

MA培养基成分以g/L计优选为：麦芽膏25、琼脂17、PH6.5~7.0；

OA培养基成分以g/L计为：燕麦片27~33、琼脂14~20、PH6.0~7.5；

OA培养基成分以g/L优选为：燕麦片30、琼脂17、PH6.5~7.0。

步骤A所述的标本采集是在温暖潮湿的阔叶林、针叶林或针阔叶混交林中进行。

步骤A所述的标本采集优选在温暖潮湿的阔叶林中进行。

步骤A所述的木质基材料组织，连带其上面生长的真菌子实体采集后需冷藏保存备用，冷藏温度为4℃。

步骤A所述的标本采集优选在杨柳科杨属、桦木科桤属、桦木属、蔷薇科樱桃属、木棉科轻木属或壳斗科栎属树种的腐朽树桩、倒木或枯枝中，采集具有彩色的线状、带状、块状、团状或点状花纹中的任一种或几种的木质基材料组织，连带其上面生长的真菌子实体，保存备用。

所述杨属树种优选毛白杨。

所述桦木属树种优选西南桦。

所述桤属树种优选西南桤木。

步骤B所述的破碎，是用解剖刀将木质基材料组织，连带其上面生长的真菌子实体切成0.3~0.7cm×0.3~0.7cm×0.3~0.7cm的小块。

步骤B所述的消毒，是用75%酒精浸泡消毒10~15s，再用0.1%升汞浸泡消毒3~7min，再用灭菌蒸馏水清洗3次。

步骤B所述的富集培养的条件优选：26℃黑暗静置培养10天。

步骤B所述的菌株分离与筛选是从富集培养基中将菌落大红色，圆周状发散生长，具轮纹；具大量大红色气生菌丝，疏松，边缘平整，边缘菌丝下沉于培养基内生长，甚至已形成鲜黄色粘液状分生孢子团的菌落挑取，接种至增殖培养基中。

步骤B所述的增殖培养的条件优选：26℃黑暗静置培养9天。

步骤C所述的保存培养的条件优选：26℃黑暗静置培养9天。

一种用所述的丛赤壳属真菌菌株（Nectria rigidiuscula）J12WU制备菌纹木的方法，包括菌株活化与扩繁、接菌培养工序，具体包括以下步骤：

A、菌株活化与扩繁：将丛赤壳属真菌菌株J12WU接种到活化与扩繁培养基上，在22~30℃下培养7~15天至生长旺盛的菌落形成，得活化与扩繁菌株；活化与扩繁培养基为PDA培养基、PDA液态培养基、MA培养基、OA培养基中的任一种；

B、接菌培养：将待接种的木质基材料灭菌后，与活化与扩繁后的菌株充分接触，在22~30℃下培养1周或以上，即得菌纹木。

所述的制备方法，还可以包括后处理步骤，将接菌培养后得到的菌纹木刮去表面的菌丝，洗净后干燥至含水率8~10%。

PDA液态培养基成分以g/L计为：马铃薯160~240、葡萄糖10~20、自然PH。

PDA液态培养基成分以g/L计优选为：马铃薯200、葡萄糖15、PH 6.5~7.0。

步骤B所述的木质基材料为原木、实木块、木板、木皮、木薄片、木棒、异形木制品中的任一种或几种。

步骤B所述的木质基材料的树种可以为任意树种。

步骤B所述的木质基材料的树种优选自杨柳科杨属、桦木科桤属、桦木属、蔷薇科樱桃属、木棉科轻木属或壳斗科栎属树种。

步骤B所述的木质基材料的树种更优选自毛白杨、西南桦、西南桤木、思茅松。

步骤B所述的木质基材料在接种前，可根据需要加工成任意的形状。

步骤B所述的灭菌，是将木质基材料在高压蒸汽式灭菌器中，在121℃下灭菌处理20分钟以上。

步骤B所述的灭菌，是将木质基材料置于培养瓶中，将蛭石倒入培养瓶中至覆盖木质基材料，加少量水使木质基材料及蛭石湿润，盖上瓶盖，置于高压蒸汽式灭菌器中，在121℃灭菌60分钟。

步骤B所述的将待接种的木质基材料与活化及扩繁后的菌株充分接触，在固体接菌时是将含有菌落的培养基切成与待接种木质基材料大小、形状相近的菌块，将至少一块菌块贴在木质基材料表面。

所述菌块的尺寸和形状优选为边长1~4cm的三角形、方形、多边形或面积相近的圆形。

所述菌块的总面积在2cm²以上。

步骤B所述的将待接种的木质基材料与活化及扩繁后的菌株充分接触，在液体接菌时，是将待接种的木质基材料浸入含有菌落的培养液中，且/或将成团的菌丝体夹取置于木质基材料的表面或附近。

所述菌丝体的夹取量与木质基材料的体积比为0.1~0.5：1。

所述菌丝体的夹取量的总体积在1cm³以上。

实施例1 

——丛赤壳属真菌（Nectria rigidiuscula）J12WU的获得、鉴定与保藏。

（1）丛赤壳属真菌（Nectria rigidiuscula）J12WU的获得与鉴定。

本发明所述的丛赤壳属真菌，是从西南桤木的腐朽的树桩、倒木或枯枝中分离得到。样品采自云南省昆明市金殿公园蕨壑云深景点，采集已腐朽的且在木质部出现红色系花纹的树桩、树枝样品100g，连带其上面生长的真菌子实体，在4℃冷藏保存备用。

将采集的已腐朽树桩样品，以解剖刀切成0.3~0.5cm×0.3~0.5cm×0.3~0.5cm的小块，用75%酒精浸泡消毒10~15s，再用0.1%升汞浸泡消毒5min，再用灭菌蒸馏水清洗3次。接于PDA培养基中，26℃±2℃黑暗静置培养10天，至菌落长出。

然向四周周围发散状、疏松的丝状、大红色、边缘平整、甚至形成粘液状鲜黄色分生孢子的菌落挑取，接种至增殖培养基中在26℃±2℃黑暗静置培养9天，至菌落长出。增殖培养基为PDA培养基。待菌落长出后，挑取长势旺盛者至保存培养基中，保存培养，保存培养基为PDA培养基，保存培养的条件为在26℃±2℃黑暗静置培养9天。

PDA培养基成分以g/L计为：马铃薯200、葡萄糖15、琼脂17、pH 6.5~7.0。

对上述分离的菌株J12WU，通过生物学特性观察，进行进一步的形态鉴定，实验结果记录如下。

A、形态特征：在PDA培养基上培养7天，菌落直径约4.9cm，生长速度较慢；菌落大红色，圆周状发散生长，具轮纹；具大量气生菌丝，疏松，边缘平整，边缘菌丝下沉于培养基内生长，于中央部位形成鲜黄色粘液状分生孢子团。具镰刀形及卵圆形分生孢子，成熟镰刀形孢子产自瓶型分生孢子梗，具6-9分隔，形状弯曲，向两尖端端逐渐变为窄细，中间细胞为深色，尖端两细胞颜色变为透明长60-80μm×宽7-12μm，卵圆形分生孢子长5-7μm×宽3-4μm。

B、培养特征：在PDA培养基上培养7天左右即可于中央部位形成鲜黄色粘液状分生孢子团。以液体马铃薯培养基在摇床上培养7天，其菌丝体呈直径为0.1~0.5cm形状不规则的小颗粒，培养液大红色。在木块上接种培养期间也形成大红色菌落及鲜黄色粘液状分生孢子团。

C、菌株的稳定性：该菌生长温度范围在3~35℃，适宜生长温度为20~30℃，生长PH值在5.5~7.5，最适宜PH值为6.5~7.2。

D、5.8S rDNA序列分析：对该菌株进行5.8S rDNA序列测定，以菌株J12WU的总DNA为模板，在引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）的引导下PCR扩增该菌株的5.8S rDNA序列，PCR反应体系为：2μlDNA模版、1.5μl引物ITS1、1.5μl引物ITS4、Taqmix22μl、去离子水20μl，共50ul。PCR反应程序： a、94℃4min；b、94℃1min，50℃45s，72℃1min，35个循环；c、72℃10min。

将PCR反应产物送到生物公司测序得ITS序列，经复检，在美国国家生物技术信息中心（NCBI）中比对，比对结果表明，菌株J12WU与丛赤壳属真菌（Nectria rigidiuscula）的5.8S rDNA序列的相似性达到了99％。通过序列比对和形态特征将菌株J12WU鉴定为丛赤壳属真菌（Nectria rigidiuscula）。本发明所述的菌株J12WU其5.8S rDNA序列如序列表所示。

（2）丛赤壳属真菌（Nectria rigidiuscula）J12WU的保藏。

通过上述鉴定结果，确认菌株J12WU为丛赤壳属真菌（Nectria rigidiuscula） 的一个株系，编号命名为J12WU，于2012年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100080），其保藏编号为CGMCC No：5963。

实施例2 

——由丛赤壳属真菌（Nectria rigidiuscula）J12WU制备菌纹木。

（1）菌纹木制备。

首先，将丛赤壳属真菌（Nectria rigidiuscula）J12WU接种到PDA液态培养基上，在26℃±2℃下黑暗摇床培养9天，形成红色的菌丝体及其菌丝体孢子悬浮液。

PDA液态培养基成分以g/L计为：马铃薯200、葡萄糖15、pH6.5~7.0。

然后，将待接种的西南桤木原木锯成2cm×2cm×2cm的方形木块（共计12块），分别装在底面直径6cm高11cm的培养瓶中。接着，将蛭石倒入培养瓶中至覆盖木块，加少量水使木块及蛭石湿润，盖上瓶盖，置于高压蒸汽式灭菌器中，在 121℃灭菌40分钟。

夹取木块放入菌悬液中沾上菌丝或孢子后，放入一并经过消毒的蛭石中，并将成团的菌丝体夹取置于木块表面，所夹菌丝体积与木块体积的比值约为0.3:1。在26℃±2℃下黑暗培养，1周后取出其中6块木块，4周后取出剩余6块木块。最后，将木块刮去表面的菌丝，洗净后干燥至含水率10%，得菌纹木。

（2）结果观察。

分别将接种1周及4周的木块用BenQ Scanner 5560扫描仪在2400分辨率下扫描后劈开木块观察。

侵染深度：在接种的第1周内，木块表面即出现花纹，到第1周结束时，深入木块超过0.07cm。在接种到第4周结束时，深入木块超过0.09cm。

花纹的颜色和类型：到第1周结束时，木块表面形成玫瑰红色的无规则、不均匀的团块状、线状染色；到第4周结束时，木块表面形成面积更大颜色更深的玫瑰红色的连续的无规则、不均匀的团状组合成似抽象花纹状的花边装饰的染色。

实施例3

——由丛赤壳属真菌（Nectria rigidiuscula）J12WU制备菌纹木。

（1）菌纹木制备。

首先，将丛赤壳属真菌（Nectria rigidiuscula）J12WU接种到PDA液态培养基上，在28±2℃下黑暗摇床培养7天，形成红色的菌丝体及其菌丝体孢子悬浮液。

     PDA液态培养基成分以g/L计为：马铃薯160、葡萄糖20、pH7.0~7.5。

     然后，将待接种的西南桤木原木锯成2cm×2cm×3cm的方形木块（共计40块，按照GB1931-1991《木材含水率测定方法》烘至绝干，用精确到0.001的电子天秤称每一木块的绝干质量），分别装在底面直径6cm高11cm的培养瓶中。接着，将蛭石倒入培养瓶中至覆盖木块，加少量水使木块及蛭石湿润，盖上瓶盖，置于高压蒸汽式灭菌器中，在 121℃灭菌40分钟。

夹取木块放入菌悬液中沾上菌丝或孢子后，放入一并经过消毒的蛭石中，并将成团的菌丝体夹取置于木块表面，所夹菌丝体积与木块体积的比值约为0.5:1。在25℃±2℃下黑暗培养4周。最后，将木块刮去表面的菌丝，洗净后干燥至含水率8%，得菌纹木。

（2）结果观察。

侵染深度：取其中10块劈开观察侵染深度。木块表面遍布花纹，花纹深入木块超过0.1cm。

花纹的颜色和类型：到第4周结束时，木块表面形成玫瑰红色的不均匀的团状染色，团块边缘呈曲线，组合成无规则的连片的花纹状染色。

实施例4

——由丛赤壳属真菌（Nectria rigidiuscula）J12WU制备菌纹木。

（1）菌纹木制备。

首先，将丛赤壳属真菌（Nectria rigidiuscula）J12WU接种到PDA液态培养基上，在24℃±2℃下黑暗摇床培养15天，形成红色的菌丝体及其菌丝体孢子悬浮液。

     PDA液态培养基成分以g/L计为：马铃薯240、葡萄糖10、pH6.5~7.0。

     然后，将待接种的西南桤木原木锯成7cm×5cm×5cm的方形木块（共计40块），分别装在底面直径10cm高12cm的培养瓶中。接着，将蛭石倒入培养瓶中至覆盖木块，加少量水使木块及蛭石湿润，盖上瓶盖，置于高压蒸汽式灭菌器中，在 121℃灭菌60分钟。

夹取木块放入菌悬液中沾上菌丝或孢子后，放入一并经过消毒的蛭石中，并将成团的菌丝体夹取置于木块表面，所夹菌丝体积与木块体积的比值约为0.1:1。在28℃±2℃下黑暗培养4周。最后，将木块刮去表面的菌丝，洗净后干燥至含水率9%，得菌纹木。

（2）结果观察。

侵染深度：取其中10块木块劈开观察侵染深度。木块表面遍布花纹，花纹深入木块超过0.09cm。

花纹的颜色和类型：到第4周结束时，木块表面形成玫瑰红色的不均匀无规则的染色，组合成各种抽象花纹状的图案。

实施例5  

——菌纹木表面花纹面积百分率。

实验材料：接种后的实施例2中的菌纹木，接种时间分别为1周和4周。

实验方法：分别将接种后的实施例2中的接种时间分别为1周和4周的菌纹木的花纹面，用BenQ Scanner 5560扫描仪在2400分辨率下扫描后，所得图片以Scion Image Software软件进行统计分析。

实验结果：接种1周和4周后菌纹木表面带线及染色花纹面积百分率分别为63.17%和81.02%。

实施例6  

——菌纹木的质量损失率。

实验材料：实施例3中的接种4周后的菌纹木。

实验方法：按照GB1931-1991《木材含水率测定方法》将实施例3中的接种4周后的菌纹木（未劈开的30块）烘至绝干，用精确到0.001的电子天秤称木块质量，得到菌纹木木块的绝干质量。按下式计算菌纹木的质量损失率。

质量损失率=（接种前木块绝干质量-菌纹木木块绝干质量）÷接种前木块绝干质量×100%。

以30块木块的质量损失率的平均值为菌纹木平均质量损失率。

实验结果：接种4周后菌纹木的平均质量损失率为2.01%。

实施例7

——菌纹木的表面硬度损失率。

实验材料：接种后的实施例4中的菌纹木与同树种健康材。

实验方法：按照GB/T 1941-2009 《木材硬度试验方法》对未处理的西南桤木健康材及实施例4所得的菌纹木（未劈开的30块）进行表面硬度测试。按下式计算菌纹木的平均表面硬度损失率。

平均表面硬度损失率=（未处理健康材表面硬度平均值-菌纹木表面硬度平均值）÷未处理健康材表面硬度平均值×100%。

实验结果：接种4周后菌纹木的平均表面硬度损失率为5.24%。

实施例8                                                                                                              

——菌纹木的顺纹抗压强度损失率。

实验材料：实施例6中的菌纹木和同树种健康材。

实验方法：将实施例6中的菌纹木（共计30块）和未处理的西南桤木健康材按照GB1931-1991《木材含水率测定方法》将木块烘至绝干。然后参照GB 1935-2009-T《木材顺纹抗压强度试验方法》，测定木块的顺纹抗压强度。按下式计算菌纹木的平均顺纹抗压强度损失率。

平均顺纹抗压强度损失率=（未处理健康材顺纹抗压强度平均值-菌纹木顺纹抗压强度平均值）÷未处理健康材顺纹抗压强度平均值×100%。

实验结果：接种4周后菌纹木的平均顺纹抗压强度损失率为6.39%。

实施例9

——菌纹木微观结构观察。

实验材料：实施例2中接种4周的菌纹木。

实验方法：将接种后的实施例2中的菌纹木锯成0.6cm×0.6cm×0.6cm的立方体，立方体至少一个表面含有花纹，置于恒温水浴锅中在80℃±5℃水煮至木块下沉。以切片机削平含花纹的表面，在真空装置中对含花纹的表面及其垂直面实施喷金，置于扫描电镜下观察拍照。

实验结果：菌丝体分布于菌纹木形成染色花纹的区域，染色花纹附近有少量菌丝，距花纹0.2cm外无菌丝分布；从菌丝体分布情况来看，菌丝体主要位于西南桤木的细胞腔中，通过细胞壁上的纹孔出入细胞腔，而西南桤木的各类细胞壁，尤其是木纤维的细胞壁结构完整，与无菌丝体分布区域未有明显差别。由于西南桤木的细胞壁结构完整无损，其木材的物理力学性质受到的影响极其轻微，与健康材几无差别。

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