金黄色葡萄球菌SpA5突变体及其制备方法和应用

摘要

本发明属于生物技术领域，涉及一种金黄色葡萄球菌SpA5突变体蛋白以及包含该突变体蛋白的载体、工程菌、组合物或试剂盒，以及该突变体蛋白的应用和制备、发酵和纯化方法。本发明的SpA5蛋白能够有效激发机体引起保护性免疫应答，从而抵御金黄色葡萄球菌感染，免疫原性强，安全无毒性，且安全有效、质量可控。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种金黄色葡萄球菌SpA5突变体蛋白。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)，以下简称金葡菌，有“嗜肉菌”的别称。 作为革兰氏阳性菌的代表，它是引起医院感染和社区感染的一种重要致病菌。感染以急性、 化脓性炎症为特征，局部感染可引起皮肤和软组织等的化脓性感染，经久不愈；全身感染可 导致骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、肺炎、脓毒血症等严重感染及并发症，死亡率高达 20％。同时，金葡菌的外毒素还可引起食物中毒、烫伤样皮肤综合征和中毒性休克综合征等 全身致死性感染。因此，加强对金葡菌感染的免疫防治研究，研制安全、有效的新型金葡菌 基因工程疫苗将对有效控制金葡菌耐药性蔓延和临床金葡菌广泛感染具有重要的战略及现实 意义。

随着抗生素长期、广泛地使用，细菌耐药性问题日益突出，作为典型代表的耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）自1961年被首次发现 至今，目前已成为全球ICU病房、术后感染、烧伤、战创伤等感染率最高的医院內感染病原 菌之一。同时，因其致病性强、传播途径广泛、易暴发流行，且呈多重耐药性发展而成为临 床上治疗的难点，被称为“第一超级细菌”。

绝大多数SA临床分离株都能表达SpA。SpA分子量为55kDa，定位于细胞壁上。SpA 前体包含一N端信号肽及一C端筛选信号以使其共价结合于细胞壁上。成熟肽的N端部分包 含5个56-61个氨基酸残基的Ig结合结构域，卷曲成三个α螺旋束。这些结构域能结合于哺 乳动物IgG，破坏抗体的调理吞噬作用；亦能与VH3型的B细胞受体结合，使B细胞死亡， 破坏获得性及天然免疫反应。因而，诱导机体产生针对SpA的抗体，阻断MRSA的免疫逃逸 机制是抗MRSA疫苗的一个重要选择。但由于SpA具备抗体结合能力，以天然SpA作为抗 原无法实现预期目标，需要对其进行突变去除其抗体结合活性，同时保留其免疫原性。

金黄色葡萄球菌ATCC国际标准株MRSA-252菌株的SpA蛋白前体（命名为SpA（252）， SEQ ID NO:5）包括516个氨基酸，其中前36个氨基酸构成信号肽序列；第37～327位氨基 酸构成EDABC五个Ig结合结构域，共包括291个氨基酸（命名为SpA5（252））。Ig结合结 构域是SpA的活性区域，也是研究的重点。Kim HK等曾对S.aureus Newman菌株的SpA的 Ig结合结构域进行突变，以期获得免疫活性高的疫苗，取得了一定的效果（Nontoxigenic protein A vaccine for methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in mice.J Exp Med.2010 Aug 30;207(9):1863-70）。

发明内容

本发明的目的是提供一种SA的SpA5突变体以及包含该突变体的组合物，作为SA新的 疫苗候选物。

在本发明的一个方面，提供一种SpA5突变体重组蛋白，所述蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1～4。

在本发明的第二个方面，提供编码本发明的SpA5蛋白的核苷酸序列，以及包含所述核 苷酸序列的载体和宿主。

在本发明的第三个方面，提供一种制备本发明的SpA5蛋白的方法。

在本发明的第四个方面，提供一种发酵SpA5基因工程菌的方法，用于制备SpA5蛋白。

在本发明的第五个方面，提供一种纯化本发明的SpA5蛋白的方法。

在本发明的第六个方面，提供本发明的SpA5蛋白作为抗原的应用，以及SpA5蛋白在制 备用于检测、预防或治疗SA感染的生物制品中的应用。

在本发明的第七个方面，提供由本发明的SpA5蛋白免疫产生的多克隆抗体以及所述多 克隆抗体在制备用于检测、预防或治疗SA感染的生物制品中的应用。

在本发明的第八个方面，提供包含本发明的SpA5蛋白的组合物或试剂盒，优选地，所 述组合物是疫苗。

根据实验结果，以本发明的SpA5蛋白作为抗原能够有效激发机体引起保护性免疫应答， 从而抵御金黄色葡萄球菌感染，免疫原性强，安全无毒性，且安全有效、质量可控。

附图说明

图1、pGEX系列载体的图谱。

图2、实施例2所示目的蛋白诱导表达的10%SDS-PAGE实验结果。各泳道分别为：1： SpA(55KD)；M：蛋白中蛋白质分子量标准（170、130、100、70、55、40、35、25、15）KD； 2：SpA5wt（33KD）；3：SpA5ref(KKAA,33KD)；4：SpA5(KKAA,33KD)；5：SpA5(KKVV, 33KD)；6：SpA5(RRAA,33KD)；7：SpA5(RRVV,33KD)。

图3、SpA5工程菌在四种培养基中的生长曲线。

图4、SpA5在M9和TB培养基中的表达情况；其中，1：蛋白质分子量标准；2：M9培养 基中表达情况；3：TB培养基中的表达情况。

图5、不同IPTG浓度对SpA5蛋白表达的影响；1：蛋白质分子量标准；2：0.1mM；3： 0.2mM；4：0.5mM；5：1mM。

图6、不同接种量在诱导以前细菌生长曲线。

图7、SpA5基因工程菌不同接种量对蛋白表达的影响；1：蛋白质分子量标准；2：5%；3： 10%；4：15%。

图8、不同氧浓度下SpA5工程菌生长曲线。

图9、PO₂不同浓度时，SpA5蛋白的表达情况；1：蛋白质分子量标准；2：25%；3：45%； 4：65%。

图10、不同浓度的甘油对SpA5蛋白表达的影响；1：蛋白质分子量标准；2：5ml/L；3： 10ml/L；4：15ml/L。

图11、在不同诱导温度和时间时目的蛋白表达的情况；1：蛋白质分子量标准；2：诱导 0h；3：诱导2h；4：诱导4h；5：诱导6h；6：诱导8h；7：诱导10h。

图12、25L SpA5工程菌发酵生长曲线。

图13、25L SpA5工程菌发酵时SpA5蛋白表达情况；1：蛋白质分子量标准；2：诱导0h； 3：诱导1h；4：诱导2h；5：诱导3h；6：诱导4h；7：诱导5h。

图14、GST-琼脂糖凝胶4B纯化目的蛋白的结果：M：蛋白质分子量标准；1：结合于填 料上的GST-SpA5融合蛋白；2：流穿；3：酶切洗脱后残存于填料上的SpA5及GST；4：酶 切洗脱后的目的蛋白SpA5。

图15、SP HP层析纯化SpA5蛋白色谱图，出现两个洗脱峰：第一峰与第二峰。

图16、SP HP层析纯化SpA5蛋白电泳图；M：蛋白质分子量标准；1：样品；2：流穿； 3：第一峰；4：第二峰（1M NaCl洗脱）。

图17、MMC层析纯化SpA5蛋白色谱图。

图18、MMC层析纯化SpA5蛋白电泳图；M：蛋白质分子量标准；1：进样样品；2：流 穿样品；3：30%B液洗脱样品；4：100%B液洗脱样品。

图19、Phenyl HP层析纯化SpA5蛋白色谱图。

图20、Phenyl HP层析纯化SpA5蛋白电泳图；M：蛋白质分子量标准；1：洗脱管A1； 2：洗脱管A2；3：洗脱管A3；4：洗脱管A4；5：流穿样品。

图21、SP HP层析（样品电导4.755ms/cm）纯化SpA5蛋白色谱图。

图22、SP HP层析（样品电导4.755ms/cm）纯化SpA5蛋白电泳图；M：蛋白质分子量标 准；1：样品；2：流穿；3：洗脱管1；4：洗脱管2；5：洗脱管3；6：洗脱管4。

图23、SP HP层析（样品电导11.622ms/cm）纯化SpA5蛋白色谱图。

图24、SP HP层析（样品电导11.622ms/cm）纯化SpA5蛋白电泳图；M：蛋白质分子量标 准；1：流穿；2：F2。

图25、硫酸铵沉淀SpA5条件的选择；1：2M(NH₄)₂SO₄沉淀；2：2M(NH₄)₂SO₄上清；3： 1.6M(NH₄)₂SO₄上清；4：1.6M(NH₄)₂SO₄沉淀。

图26、SpA突变体精纯化结果；M：蛋白质分子量标准；1：SpA；2：SpA5ref(KKAA)； 3：SpA5(KKAA)；4：SpA5(KKVV)；5：SpA5(RRAA)；6：SpA5(RRVV)。

图27、放大后SP HP层析（批次Ⅰ）纯化SpA5蛋白色谱图。

图28、放大后Q HP层析（批次Ⅰ）纯化SpA5蛋白色谱图。

图29、放大后（批次Ⅰ）纯化SpA5蛋白电泳图；M：蛋白质分子量标准；1：纯化前样 品；2：流穿样品；3：SP HP洗脱样品；4：(NH₄)₂SO₄沉淀复溶样品；5：G25洗脱样品；6： Q HP流穿样品。

图30、放大后SP HP（批次Ⅱ）纯化SpA5蛋白色谱图。

图31、放大后Q HP（批次Ⅱ）纯化SpA5蛋白色谱图。

图32、放大后（批次Ⅱ）纯化SpA5蛋白电泳图；M：蛋白质分子量标准；1：纯化前样 品；2：SP HP洗脱样品；3：(NH₄)₂SO₄沉淀复溶样品；4：G25洗脱样品；5：Q HP流穿样品。

图33、放大后SP HP（批次Ⅲ）纯化SpA5蛋白色谱图。

图34、放大后Q HP（批次Ⅲ）纯化SpA5蛋白色谱图。

图35、放大后（批次Ⅲ）纯化SpA5蛋白电泳图；M：蛋白质分子量标准；1：纯化前样 品；2：流穿样品；3：SP HP洗脱样品；4：G25洗脱样品；5：Q HP流穿样品。

图36、SpA5(KKAA)突变体HPLC检测结果；主峰保留时间13.282分；主峰面积比率98.2%。

图37、ELISA检测SpA及各SpA5蛋白与人IgG的结合能力（平均值±stdev，n=12）。

图38、酶切纯化后的F(ab)₂片段；1：F(ab)₂；M：蛋白分子量标准；2：抗体。

图39、ELISA检测各SpA5蛋白免疫家兔后产生的抗体F(ab)₂片段对SpA与人IgG结合 能力的降低情况（平均值±stdev，n=5）。

图40、免疫SpA及各SpA5蛋白后，小鼠脾B淋巴细胞凋亡诱导情况。

图41、磷酸铝吸附SpA5前后10%SDS-PAGE结果；1：吸附磷酸铝后离心上清： SpA5ref(KKAA)；2：吸附磷酸铝后离心上清SpA5(KKAA)；3：吸附磷酸铝后离心上清SpA5 (RRVV)；4：蛋白原液（以SpA5(KKAA)作对照）。

具体实施方式

本发明内容基于现有技术，克隆并突变了金黄色葡萄球菌ATCC国际标准株MRSA 252 菌株的SpA蛋白的Ig结合结构域，通过活性检测发现，本发明的SpA5蛋白比对比文件提供 的SpA突变蛋白的活性更高。

本发明中，发明人将SpA（252）（SEQ ID NO:5）的第43Q、44Q、96Q、97Q、162Q、 163Q、220Q、221Q、278Q、279Q同时替换成K或R，将第70D、71D、131D、132D、189D、 190D、247D、248D、305D、306D同时替换成A或V，并进行修饰，得到本发明的四个SpA5 蛋白：SpA5(KKAA)（SEQ ID NO.1）、SpA5(RRAA)（SEQ ID NO.2）、SpA5(KKVV)（SEQ ID NO.3）和SpA5(RRVV)（SEQ ID NO.4）。四个蛋白中第6-296位氨基酸来自于SpA（252）， 前5个氨基酸（GPLGS，SEQ ID NO.8）为来自表达载体的修饰的氨基酸，这5个氨基酸的 编码序列优选为gggcccctgggatcc（SEQ ID NO.13）。

因此，在本发明中，申请人提供编码SEQ ID NO.1-4中任何一个SpA5蛋白的核苷酸序 列。在已知蛋白质氨基酸序列的情况下，本领域技术人员完全可以根据需要设计合适的编码 所述氨基酸序列的核苷酸序列，并使其表达。

在一种优选的实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.9-12所示。

在另一方面，本发明提供包括编码本发明SpA5蛋白的核苷酸的载体或宿主。

所述载体可以是任何适于蛋白表达的载体。在本发明的优选实施方式中，所述载体是表 达载体pGEX或pET系列载体，更优选是表达载体pGEX-6P-2。pGEX系列载体的图谱如图 1所示。

本发明优选采用的pGEX-6p-2载体其主要特点是载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱 甘肽-S-转移酶（GST），所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签是蛋白纯化的标 记。与其它融合载体相比，pGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的 加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。

所述宿主可以是本领域技术人员已知的任何表达细胞，优选为大肠杆菌XL1-Blue。

在另一方面，本发明提供一种制备SpA5蛋白的方法，所述方法可以是化学合成法或核 苷酸表达法。本领域技术人员根据SpA5蛋白的序列和本领域常识完全可以知道如何制备本 发明的SpA5蛋白。

在另一方面，本发明提供一种SpA5基因工程菌的发酵工艺，所述工艺包括将一定量的 种子菌接种于含有甘油和一定溶氧量的发酵培养基中，经诱导剂诱导一定时间而表达重组蛋 白。优选地，所述工艺涉及培养基、种子菌接种量、培养基中的甘油量、溶氧量、诱导剂种 类、诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间几方面因素；进一步优选地，所述培养基可以是动物 源性TB、动物源性M9、植物源性TB、植物源性M9，优选为动物源性TB；所述种子菌的 接种量是5%～15%，优选为10%；所述甘油量为5-15ml/L培养基，优选为10ml/L培养基； 所述溶氧量是25%～65%，优选为45%；所述诱导剂可以是乳糖或IPTG，优选为IPTG；所述 诱导剂的浓度是100μmol/L-1mmol/L培养基，优选为200μmol/L培养基；所述诱导温度为 16～37℃，优选为30℃；所述诱导时间为1～6小时，优选为5小时。

在所述发酵工艺的一种具体实施方式中，基础培养基选用动物源性TB培养基，其中甘 油量是10ml/L；发酵开始时，加入种子菌的比例是10%；在发酵过程中溶氧浓度始终保持在 45%左右；诱导时，温度调为30℃、IPTG浓度为0.2mM、诱导5h。

在另一方面，本发明还提供一种在发酵宿主后纯化SpA5蛋白的方法，所述方法包括依 次进行的亲和层析、阳离子交换层析、硫酸铵沉淀、脱盐和阴离子交换层析五个步骤。其中， 亲和层析为GST亲和层析结合Prescission蛋白酶（PP酶）酶切，优选使用GST琼脂糖凝胶 4B层析；所述阳离子交换层析使用填料为SP HP、Capto MMC、Phenyl HP，优选SP HP； 所述脱盐步骤使用G25；所述阴离子交换层析使用Q HP。

所述阳离子交换层析使用的平衡缓冲液是10-20mM PB，pH6.5-7.5，优选地，所述平衡 缓冲液是20mM PB，pH7.0；阳离子交换层析使用的洗脱缓冲液是10-20mM PB+0.3-1.5M NaCl，pH6.5-7.5，优选地，所述洗脱缓冲液是20mM PB+1M NaCl，pH7.0。优选地，所述 洗脱缓冲液的洗脱程序是以0-50%洗脱缓冲液，5个柱体积进行洗脱。

所述硫酸铵沉淀步骤包括4℃条件下，将样品与3M(NH₄)₂SO₄按1:2～1.4:1.6（V/V）比 例混合后搅拌10min，6000r/min，离心20min；优选地，样品与硫酸铵的比例是1.4:1.6。

所述阴离子交换层析使用的平衡缓冲液是5-15mM His+0.01-0.05%泊洛沙姆 188+0.9%NaCl，pH5-7；优选地是10mM His+0.01%泊洛沙姆188+0.9%NaCl，pH6.0。

优选地，在进行亲和层析之前，需要对基因工程菌破菌，以将蛋白从菌体中释放出来。

在另一方面，本发明提供SpA5蛋白在检测、预防或治疗SA感染中的应用，或在制备用 于检测、预防或治疗SA感染的制剂中的应用。优选地，所述制剂是疫苗。

在另一方面，本发明还提供SpA5蛋白免疫产生的抗体，所述抗体为多克隆抗体，能够 用于与SA感染相关疾病的检测、预防和治疗，或用于制备相应的制剂。

在另一方面，本发明还提供包含本发明的SpA5蛋白的组合物或试剂盒。这样的组合物 可以是试剂、药物（如疫苗），用于预防、检测或治疗SA感染。这样的试剂盒可以是检测试 剂盒或治疗试剂盒等本领域已知的任何形式试剂盒。

实施例

本部分实施例所使用的试剂、菌株等如下所示；中未明确标注生产商的化学试剂等为本 领域常规化学或生物学商店均可以购买的。

1.菌株

金黄色葡萄球菌ATCC国际标准株MRSA-252由美国ATCC提供；

宿主菌株XL1-blue大肠杆菌为美国安捷伦公司产品。

2.质粒

质粒pGEX-6p-2为美国GE Healthcare公司产品。

3.试剂

primeSTAR HS DNA聚合酶、DNA分子量标准、限制性内切酶BamH I和Not I、蛋白 分子量标准、DNA连接酶为大连TakaRa公司产品；

质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；

琼脂粉、吐温-20等其余试剂均为国内市场购买；

MH培养基：购自北京奥博星生物技术有限责任公司（牛肉粉2.0g  可溶性淀粉1.5g  酸 水解酪蛋白17.5g），加水至1L，pH值7.4±0.2；

MH平板：MH培养基加入琼脂糖至终浓度为1.5g/100mL；

PBS（磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g（国产分析纯），磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)2.9g（国产 分析纯），氯化钠(NaCl)8.0g（国产分析纯），氯化钾(KCl)0.2g，加水至1000mL，pH7.4）；

20mM PB缓冲液：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)2.9g，氯化钾 (KCl)0.2g，加水至1000mL，pH7.0；

氨苄西林、卡那霉素（华北制药）；

5×蛋白质上样缓冲液（250mM Tris-HCl（pH6.8）10％（W/V）SDS 0.5％（W/V）溴 酚蓝50％（V/V）甘油5％（W/V）β-巯基乙醇）；

谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B（美国GE Healthcare公司）；

磷酸铝佐剂：美国GENERAL CHEMICAL公司(20mg/ml)；

疫苗蛋白稀释液（组氨酸（美国Merck公司，药用级）10mM、NaCl 0.9%（四川科伦， 注射用生理盐水）、泊洛沙姆188（美国Merck公司，药用级）0.01%、pH6.0），无热原。

实施例1：序列合成

以MRSA252基因组(GI:49240382)为模板获得SpA碱基序列及氨基酸序列（SpA（252）， SEQ ID NO.5），将其中的EDABC五个结构域(即SEQ ID NO.5的37aa-327aa，命名为 SpA5(252))的碱基依据大肠杆菌偏好性在网站http://people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html上 进行稀有密码子分析并优化，对每个结构域内的4个氨基酸进行点突变，合成编码SpA5 (KKAA)、SpA5(RRAA)、SpA5(KKVV)、SpA5(RRVV)四种蛋白第6-296位氨基酸的核苷酸序 列，以BamHI和NotI作为双酶切位点装载到表达载体pGEX-6P-2上，然后转化宿主菌 XL-1Blue（由上海捷瑞生物技术有限公司直接完成）。四种SpA5蛋白对应的核苷酸序列分别 见SEQ ID NO.9-12，其中核苷酸序列中第16-891位核苷酸为基于SpA5（252）的编码序列 进行密码子优化的核苷酸序列。

以同样的方法，合成SpA5(252)的核苷酸序列，装载至表达载体并转化宿主菌。

为了便于与文献报道的SpA突变体比较，也按文献报道（Nontoxigenic protein A vaccine for  methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in mice.Kim HK,Cheng AG,Kim HY, Missiakas DM,Schneewind O.J Exp Med.2010 Aug30;207(9):1863-70）的氨基酸序列SpA5ref 合成了编码SpA5ref(KKAA)（SEQ ID NO.6）的第6-301位氨基酸的核苷酸序列，并用上述 方法将核苷酸序列装载至表达载体pGEX-6P-2中，转化宿主菌。

在本实施例中，所有合成基因在插入BamHI位点后，转化至宿主菌，通过这些重组工程 菌表达并用PP酶（美国GE公司）酶切（切后在其N端保留了载体的五个氨基酸GPLGS（SEQ  ID NO.8）），将得到用于下列实验的蛋白：本发明的SpA5(KKAA)、SpA5(RRAA)、 SpA5(RRVV)、SpA5(KKVV)，对比蛋白SpA5wt（序列为SEQ ID NO.7，即SpA5（252）核 苷酸序列在装载至pGEX-6P-2载体、转化至XL-1Blue菌表达并经PP酶酶切后的产物，比 SpA5（252）的N端多了GPLGS五个氨基酸，）和SpA5ref(KKAA)。

实施例2：各蛋白在大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定

1)目的蛋白诱导表达

①取各重组工程菌培养液100μL，加入至10mL的氨苄西林浓度为100μg/mL的LB培养 基中，80rpm37℃过夜培养。分别取过夜培养的菌液400μL加入至20mL的氨苄西林浓度为 100μg/mL的LB培养基中，37℃培养2～3h，转速220rpm；二次活化至OD600nm为0.8-1.0 时，加入IPTG，使其终浓度为200μM，再置于摇床30℃诱导表达3h，然后16℃过夜诱导表 达。

②将诱导表达后的菌液取出，以10000rpm离心5min，弃去上清，加入1mL PBS混匀， 超声（功率300瓦）裂解10min(工作6秒，休息9秒)，然后4℃14000×g离心15min，分离 上清和沉淀。

2)处理上清

上清结合：取谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B（美国GE Healthcare公司）20μl，用PBS洗涤3 次后，将准备好的上清加入至谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B中，室温结合1h。在4℃下以14000rpm 离心3min后，使用PBS-0.25%吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。

用PP酶（Prescission蛋白酶，美国GE公司）进行酶切洗脱：PP酶的使用按厂家推荐的 方法进行。由于所使用的PP酶带有GST标签，以利于去除PP酶。酶切完成后，离心收集上 清。取上清16μl，加入4μl5×蛋白质上样缓冲液，煮沸5min，14000rpm离心3min。

3)10%SDS-PAGE

电泳结果如图2所示。其中泳道1的SpA（252）(1.5μg)蛋白购自Invitrogen公司（美国） （REC PROTEIN A10-1100）。由图可知，目的蛋白已被顺利纯化。

实施例3、工程菌的发酵

1、发酵条件的确定

1）检测培养基对工程菌生长与目的蛋白表达的影响

通过实施例2所述的培养方法在摇瓶中测试四种培养基：

植物源性改良TB（磷酸二氢钾2.3g、十二水磷酸氢二钠13g、甘油5ml、酵母提取物24g、 大豆蛋白胨12g、硫酸镁1g，加水至1L）；

动物源性改良TB（磷酸二氢钾2.3g、十二水磷酸氢二钠13g、甘油5ml、酵母提取物24g、 动物源胰蛋白胨12g、硫酸镁1g，加水至1L）；

植物源性M9-CAA（磷酸氢二钠15.6g、磷酸二氢钾4.3g、氯化铵1g、硫酸镁1g、氯化 钠0.67g、葡萄糖5g、大豆蛋白胨3.6g、植物源酵母粉4g、酸水解酪蛋白6g，加水至1L）；

动物源性M9-CAA（磷酸氢二钠15.6g、磷酸二氢钾4.3g、氯化铵1g、硫酸镁1g、氯化 钠0.67g、葡萄糖5g、动物胰蛋白胨3.6g、动物源酵母粉4g、酸水解酪蛋白6g，加水至1L）。

SpA5(KKAA)工程菌，接种于Amp⁺（100μg/mL）LB平板上，37℃孵育16～20h，挑取单 菌落接种于10ml的Amp⁺LB培养基中，置于摇床中，37℃、200rpm摇到OD₆₀₀大约2左右 时，按1:100分别接种于100ml四种培养基中，37℃、200rpm摇14小时，每2小时取样测 OD₆₀₀，其结果见图3。

由图可知：植物源性培养基均差于动物源性，工程菌都是大约8h时就生长减缓，而在动 物源性培养基中就长势很好，一直处于对数期，且TB好于M9，故选用动物源培养基（动物 源性改良TB和M9-CAA以下简称TB、M9）。

将新鲜SpA5工程菌菌液（OD₆₀₀大约2）按1:100分别接种于100mlTB和M9培养基中， 37℃、200rpm摇至OD₆₀₀＝0.8左右，加入1mM IPTG，25℃诱导12h。将100ml菌液离心， 弃上清，称重TB：2.4g、M9:1.5g。以1g:10ml加PBS超声（功率300瓦）裂解10min(工作 6秒，休息9秒)破菌，结合GST4B（具体描述见实施例4），进行10%SDS-PAGE，结果如图 4所示：

如图4所示：考察单位目的蛋白表达量，TB培养基好于M9培养基，且单位菌湿重TB 大于M9，故SpA5工程菌发酵用基础培养基选用TB培养基。

2）IPTG浓度对目的蛋白表达的影响

考察不同终浓度的IPTG对目的蛋白表达水平的影响。将IPTG的终浓度分别设为0.1mM、 0.2mM、0.5mM、1mM，对其进行比较选出最佳浓度。将新鲜SpA5工程菌菌液（OD₆₀₀大约 2）按1:100分别接种于四个100ml TB培养基中，37℃、200rpm摇至OD₆₀₀0.8左右，分别加 入IPTG，使其浓度分别对应上述四个浓度（一瓶一个浓度），25℃诱导12h。将四瓶菌液分 别离心，弃上清，以1g:10ml加入PBS，超声（功率300瓦）裂解10min(工作6秒，休息9 秒)破菌，结合GST4B，进行10%SDS-PAGE，结果如图5所示。

如图5所示：IPTG终浓度为0.2mM时蛋白表达明显好于0.1mM，与0.5mM、1mM时的 蛋白表达基本相同，所以选择0.2mM为发酵用IPTG终浓度。

3）种子菌的不同接种量对工程菌的生长和目的蛋白表达的影响

研究5%、10%、15%三种不同种子菌接种量对发酵的影响，通过细菌生长曲线、单位蛋 白表达量来确定最佳接种量。当种子菌OD₆₀₀在2左右时，倒入发酵罐内开始计时，每1小 时取样测OD₆₀₀，直到诱导前结束，绘制工程菌前期生长期曲线（图6），可判断细菌生长速 度快慢。诱导结束后取样后，按照之前方法处理，进行10%SDS-PAGE，判断单位目的蛋白 表达量（图7）。

由图6可见，5%接种量细菌生长最慢而且最高OD₆₀₀较另两种接种量低很多，而10%与 15%接种量则相差不大。

由图7可见，不同接种量单位目的蛋白表达量不同，表达最好的是5%接种量，其次是 10%，但相差不大，15%最差。

综上所述：5%接种量表达最好，但生长速度慢，最终细菌得率少；15%接种量生长速度 快，但表达量最差；10%接种量的表达量与5%相差不多，而且生长速度也与15%相差不多， 所以选择10%接种量作为发酵接种量。

4）氧浓度对工程菌生长和目的蛋白表达的影响

此工程菌是兼性需氧菌，氧浓度的高低对细菌生长影响很大，所以在发酵过程中对溶氧 的控制就显得特别重要。本实验分别考察溶氧在25%、45%、65%时细菌的生长情况（图8） 和目的蛋白表达量（图9）。

从细菌生长情况可知：45%溶氧条件下，细菌是长得最好的；从单位蛋白表达量来看， 45%溶氧条件下，表达也是最好的，所以溶氧浓度选择45%。

5）甘油用量的确定

在不同菌量时诱导，会影响SpA5的表达量；而发酵时培养基中甘油的量会直接影响菌 量的多少。当罐内甘油消耗完，细菌停止生长，在短时间内pH值和溶氧值迅速上升，此时 应马上加IPTG开始诱导。所以甘油的多少直接决定诱导时机。通过研究5ml/L、10ml/L、15 ml/L的甘油量对目的蛋白表达的影响和最终湿重得率来确定最佳诱导时机。

图10是三个不同甘油量对应的单位目的蛋白表达量，由图可知：5ml/L甘油浓度时，表 达量最高；10ml/L其次，但相差不多；而15ml/L相差较大。但是在甘油浓度为5ml/L时，最 后菌体湿重低很多；10ml/L与15ml/L相差不多，所以最终确定甘油量加10ml/L。

6）不同的诱导温度和时间对目的蛋白表达的影响

考察30℃、25℃、16℃三个不同诱导温度对蛋白表达的影响，以及达到最大表达量时所 用的时间。在诱导后每2h取样，诱导10h，处理样品，进行10%SDS-PAGE，其结果如图11 所示：

由电泳图可知：30℃时，单位诱导表达量是最高的，且达到最大表达所用时间是最短的， 4h-6h之间的表达差异不大。而25℃、16℃时单位表达量就不如30℃，且表达时间长。故诱 导温度和时间选用30℃、5h。

根据上述研究，最终确定了本发明的SpA5工程菌的优选发酵工艺：

（1）基础培养基选用动物源性TB培养基，其中甘油量是10ml/L；

（2）发酵开始时，种子菌的接种量的比例是10%；

（3）在发酵过程中溶氧浓度始终保持在45%左右；

（4）诱导时，温度调为30℃，IPTG浓度为0.2mM、诱导5h。

2、工程菌发酵工艺放大

按照上述的优化条件对发酵规模进行扩大（25L），并得到SpA5工程菌生长曲线（图12） 和单位蛋白表达电泳图（图13）。

由图12可知，工艺放大后，整个生长曲线比较标准，前期细菌生长较快，后期诱导时曲 线较平稳，最终获得菌密度（OD₆₀₀）达48，单位菌湿重50g/L。

由图13可知，从单位目的蛋白表达看：表达量随时间的延长有明显增加，5h表达量最 高。

综上所述：SpA5工程菌发酵工艺放大成功，完全符合预期结果。本发明的发酵工艺可适 用于大范围的工业生产应用。

本实施例中使用的工程菌是SpA5（KKAA），其它工程菌的发酵工艺与本菌一样。

实施例4：SpA5蛋白的制备和纯化

1、破菌制备上清

将实施例1中构建的各重组工程菌发酵，离心收集菌体。将菌体200-500g与20mmol/L PB， pH7.0缓冲液按重量:体积比1:10比例混匀悬浮，4℃预冷。

高压匀浆：使用蒸馏水冲洗高压匀浆机（高压匀质机APV-1000，丹麦An Invernsys Group） 管道，低温循环系统开启预冷至1-4℃备用。将预冷的悬浮菌液加入高压匀浆机，压力维持在 60-80Mpa破菌3-5次，取破菌液涂片进行结晶紫染色，油镜下每个视野下未破碎菌小于2个 视为破菌完全（破菌率大于90%）。

高速离心：破菌后的液体装入离心桶（Beckman，美国），4℃，10,000-15,000g离心 15-30min，收集上清。

2、GST-琼脂糖凝胶4B亲和层析纯化

向每升上清中加入200ml GST填料，20～25℃时结合4h以上，结合过程采用垂直旋转或 搅拌的方法以促进目标蛋白与GST填料的结合。将上述结合目标蛋白的GST填料采用PBS 洗涤5个体积以除去未与GST填料结合的杂蛋白。然后按每100ml GST填料加入20ml的 Prescission protease酶（PP酶），在20～25℃条件下酶切6小时后抽滤并收集滤液，获得酶 切除GST标签后的目的蛋白，进行10%SDS-PAGE分析，结果如图14所示。图14所示的是 SpA5（KKAA）蛋白的纯化结果图，其它SpA5蛋白的纯化结果与SpA5(KKAA)相似。

3、阳离子交换层析纯化

重组SpA5各突变体蛋白的理论等电点大于8。因此，首先选用了GE公司常见的阳离子 交换层析填料SP HP（强阳离子交换）、MMC及Phenyl HP进行精纯化，再使用Q HP对精纯 化后的SpA5去内毒素。层析精纯工艺包括：

（1）层析填料的选择

比较采用SP HP、MMC及Phenyl HP对SpA5蛋白的纯化效果。使用的样品为上述获得 的SpA5粗纯化样品。

仪器系统：AKTA-expolrer100/Avant25液相色谱系统（GE）

层析填料：SP HP、MMC、Phenyl HP

柱规格：①(Φ)1.6cm×(H)2.5cm，②(Φ)2.6cm×(H)20cm，③(Φ)1.6cm×(H)2.5cm；

装柱体积：①③5ml×2、②54ml；

SP HP缓冲液：缓冲液A:20mM PB，pH7.5；缓冲液B:20mM PB+1M NaCl，pH7.5；

MMC缓冲液：缓冲液A：20mM Tris,pH8.0；缓冲液B：20mM Tris-HCl+1M NaCl，pH 8.0；

Phenyl HP缓冲液：缓冲液A：20mM PB+1.5M(NH₄)₂SO₄,pH6.0；缓冲液B：20mM PB， pH6.0；

上样样品：SpA5各突变体粗纯化样品分别调节至与纯化填料相对应缓冲液A一致的pH 备用。

SP HP：上样流速：8ml/min，洗脱流速：8ml/min；

洗脱程序：0-30%缓冲液B，10个柱体积（CV）；

MMC：上样流速：12ml/min，洗脱流速：12ml/min；

洗脱程序：0-30%缓冲液B，7个柱体积（CV）；

Phenyl HP：上样流速：8ml/min，洗脱流速：8ml/min；

洗脱程序：0-100%缓冲液B，10个柱体积（CV）。

各洗脱程序中其余份额的缓冲液是对应的缓冲液A。

收集：将目的蛋白各步洗脱样品进行SDS-PAGE纯度分析，评价纯化效果。

图15-20是SpA5(KKAA)的纯化结果图，其它各SpA5蛋白的纯化结果与该蛋白结果一 致。

从图15-20可以看出，在不同层析填料条件下，SP HP比MMC及Phenyl HP洗脱目的蛋 白的纯度更高，可以达到90%以上，具有很好的层析纯化效果。因此，综合上述考虑，确定 选择使用SP HP作为第一步层析纯化的填料。

（2）层析纯化工艺的优化

在确立使用SP HP作为第一步填料的基础上，对此层析填料进行条件优化，主要优化的 条件是上样样品电导及洗脱程序等，评价指标为SpA5的纯度及得率。

仪器系统：AKTA-explorer100液相色谱系统（GE Healthcare）；

层析填料：SP HP；

柱规格：(Φ)1.6cm×(H)2.5cm；

装柱体积：5ml×2；

缓冲液A：20mM PB，pH7.5；缓冲液B：20mM PB+1M NaCl,pH7.5；

上样样品：SpA5粗纯化样品调节pH至8.0备用；

上样流速：8ml/min，洗脱流速：8ml/min；

洗脱程序：①0-100%B，10个柱体积（CV），②0-30%B，10个柱体积（CV）；洗脱液中 的其它份额为缓冲液A。

由图21-22可以看出，在低样品电导条件下，流穿中没有目的蛋白，且目的蛋白很早就 出峰，而在图23-24中，提高样品中的电导，流穿中有明显的目的蛋白。为了提高蛋白的回 收率，选用低样品电导作为上样条件。因此，综合上述考虑，确定上样样品电导为5ms/cm左 右，洗脱程序为0-50%B，5CV。

4、硫酸铵沉淀纯化

通过SP HP层析纯化之后，SpA5纯度达到了90%以上，但依然需要进一步纯化以便去 除目的蛋白下方紧挨着的一条带。采用硫酸铵沉淀进行纯化，使SpA5沉淀，而杂蛋白存在 于上清中。

硫酸铵沉淀条件的确定：

分别尝试SpA5经SP HP纯化后的样品与硫酸铵按不同比例混合后搅拌，离心，收集上 清与沉淀，SDS-PAGE观察纯化效果。

样品：经SP HP纯化后的SpA5样品。

硫酸铵：3M(NH₄)₂SO₄；

沉淀条件：4℃条件下，样品与3M(NH₄)₂SO₄按1:2、1.4:1.6比例（V/V）混合后搅拌10min， 6000r/min，离心20min；

结果判定：分别收集离心后的上清与沉淀进行SDS-PAGE，评价不同浓度硫酸铵沉淀去 除杂蛋白的效果（图25）。

图25是SpA5（KKAA）的硫酸铵沉淀效果图，其它SpA5蛋白的沉淀效果与该蛋白一 致。从图25的蛋白纯度检测比较可以看出：4℃条件下，SP HP纯化后的SpA5（KKAA）样 品与3M(NH₄)₂SO₄以1.4:1.6（V/V）比例混合去除残留杂蛋白的效果最好，纯度达到95%以 上。因此，本发明中优选的沉淀条件是：4℃条件下，SpA5样品与3M(NH₄)₂SO₄按1.4:1.6 混合，然后离心，收集SpA5蛋白沉淀。

5、脱盐

采用疫苗稀释液平衡脱盐G25柱，将上步纯化获得的样品通过脱盐柱置换缓冲液。

具体为：将上步获得的样品，用组氨酸缓冲液（组氨酸（Merck，美国，药用级）10mmol/L， 泊洛沙姆188（Merck，美国，药用级），0.01%w/v，NaCl 9g/L(西南制药)）溶解，平衡层析 系统（AKTA Explorer 100，美国GE Healthcare）及层析柱XK50-60（美国GE Healthcare） (600mL Sephadex G 25)，用流速20mL/min脱盐（脱去(NH₄)₂SO₄及PB）。

6、去内毒素

仪器系统：AKTA-explorer 100液相色谱系统（GE Healthcare）；

层析填料：Q HP；

柱规格：(Φ)2.6cm×(H)20cm；

装柱体积：50ml；

缓冲液：缓冲液A：10mM His+0.01%泊洛沙姆188+0.9%NaCl，pH6.0，无内毒素（疫 苗稀释液）；缓冲液B:1M NaOH；

上样样品：将上步脱盐后样品调节至与缓冲液A一致pH备用。

用缓冲液B(1mol/L NaOH)在位清洗消毒5个柱体积，放置半小时后，使用疫苗稀释液平 衡系统至pH为6.0，然后上样。流速：8ml/min。收集穿透峰即目的蛋白峰。

穿透峰样品进行10%SDS-PAGE结果如图26。

7、工艺放大

按照以上确定的条件进行工艺放大：所采用的SP HP层析柱规模放大为 (Φ)2.6cm×(H)20cm，装柱体积CV=50ml，Q HP层析柱规模放大为(Φ)2.6cm×(H)20cm，装柱 体积CV=50ml。重复三批次实验，SDS-PAGE分析SpA5纯化后的效果及得率，评价此工艺 放大后的稳定性和可重复性。

从图27至图35可以看出，SpA5蛋白经SP HP层析工艺放大后，放大层析纯化模式和小 量试验层析纯化色谱图无明显变化，经纯化后的SpA5纯度达到95%以上。

8、HPLC纯度检测

HPLC仪Agilent1260（美国Agilent公司），分析柱ZorBax SB-300-C34.6x150mm3.5 micron（美国Agilent公司）。

流动相：A：0.1%三氟乙酸（Tedia，美国），水（18.2MΩ）；B：0.1%三氟乙酸（Tedia， 美国），乙腈（Tedia，美国）。

柱温60℃，流速0.5mL/min，上样10μl。

检测方法：0-30min：90%A，10%B；30-35min：100%B；35-40min：90%A，10%B；40-45 min：90%A，10%B。

检测结果如图36和表1所示。

由图36和表1可以看出，纯化的SpA5（KKAA）突变体几乎无杂峰，主峰保留时间13.282 分，主峰面积比率98.2%。其余各突变体结果类似。

表1：HPLC检测峰值

峰号 保留时间 类型 峰宽（min） 峰面积 峰面积

  （min）     （mAU*s）   1 11.158   0.0000 0.00000 0.0000 2 12.879 BV 0.1387 26.23703 1.7774 3 13.282 VB 0.1186 1449.93225 98.2226 4 32.252   0.0000 0.00000 0.0000

9、蛋白N端、C端测序、分子量测定及氨基酸组成分析

委托上海中科新生命生物科技有限公司对获得的各SpA5突变体（包括本发明的4种 SpA5各突变体及SpA5ref(KKAA)）进行测序分析，各突变体的测序序列与设计的序列完全 一致。

实施例5：内毒素含量测定

1、将实施例4获得的样品用无热原水（湛江博康海洋生物有限公司）稀释至50μg/mL 作为待测样品。根据内毒素检测试剂盒（湛江博康海洋生物有限公司）能检测到的最高范围 0.25EU/mL，对待测样品进行稀释。即假定待测样品内毒素含量为5EU/mL，则用无热原水进 一步稀释待测样品至2.5μg/mL(稀释20倍)；

2、按照试剂盒说明书配制内毒素标准品阳性对照溶液、待测样品工作液、待测样品检测 溶液；

3、鲎试剂的准备：根据各待测样品及对照品的数量，取鲎试剂，酒精棉球消毒瓶颈，晾 干后开启，每支加入检查用水0.1ml，轻轻摇匀备用；

4、加样：向配制好的鲎试剂中分别加入待测样品检测溶液、内毒素标准品阳性对照液、 检查用水各0.1ml，轻摇混匀，封口膜封口，37℃水浴60±2分钟，期间严禁移动；检查用水 为阴性对照；

5、检测：取出样品，轻轻垂直旋转180°，观察瓶底，液体凝固不流动为阳性，流动不凝 固为阴性；

6、测定结果：各突变体蛋白内毒素阴性，小于5EU/ml。

实施例6：各包被蛋白与人IgG的结合

将获得的各蛋白用0.1mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.5）稀释至500ng/ml浓度，取100μl包 被96孔ELISA板，4℃包被过夜。洗涤液（Tris2.42g，吐温200.5mL，用浓HCl调pH=7.4， 加ddH₂O至总体积1000ml）洗板4次。向各孔中加入200μl封闭液(5%(w/v)脱脂奶粉溶于 100mmol/L TTBS(Tris(pH7.5)，吐温200.1%(v/v)，NaCl 0.9%(w/v))中，37℃封闭2小时。 弃液体，用洗涤液洗板4次。加入人IgG-HRP(中杉金桥，北京)（1:5000)100μl，37℃温育 60min。弃液体，用洗涤液洗板4次。加入100μl/孔新配制含OPD的显色液，室温避光显色 15min。加入50μl12.5%H₂SO₄终止液终止反应，测定OD450nm。OD值越高表明与人IgG 结合越强，越不适合做为候选抗原。结果如图37和表2所示，其中PBS为阴性对照。

表2：ELISA检测的SpA及其各突变体蛋白与人IgG结合能力

由结果可以看出，本发明的各SpA5蛋白与野生型SpA5wt及SpA（252）相比，与人IgG 的结合能力都大下降，P<0.01；而SpA5（RRVV）已丧失与人IgG的结合能力。

实施例7：兔抗重组突变体抗体F(ab)2片段阻止SpA与人IgG结合

根据实施例6的结果，SpA5wt具有与SpA全蛋白一样的人IgG结合能力，因此这两个 蛋白均不进行本次实验。

1）家兔免疫

分别取SpA5ref(KKAA)、SpA5(KKAA)、SpA5(KKVV)、SpA5(RRAA)及SpA5(RRVV)2mg （2mg/ml）加1ml完全弗氏佐剂（sigma，美国），充分乳化。2.0-2.5kg新西兰大耳兔（第三 军医大学实验动物中心）25只，每组5只，于第0、14、28天皮下多点免疫乳化后的蛋白2ml(蛋 白量2mg)，末次免疫7天取血清。

2）抗体纯化

兔血清用硫酸胺沉淀后用PBS稀释，加至用PBS平衡的蛋白G预装柱(美国GE公司)， PBS清洗柱子，用含有1mol/L甘氨酸、0.5mol/L NaCl的pH2.5的缓冲液洗脱，洗脱液立即 用1mol/L Tris-HCl，pH8.5缓冲液中和，PBS透析。经Lowry法测定，抗体浓度为3mg/ml。 经Westen实验验证，该抗体为SpA5特异抗体。

3）抗体F(ab)₂片段的制备

将胃蛋白酶（sigma,美国）用醋酸盐缓冲液(醋酸钠18g，加冰醋酸9.8ml，再加水稀释至 1000ml，pH4.5)配制成60IU/ml，以1:11(v/v)加入至上步获得的抗体中，37℃作用30分钟， 用1mol/L Tris-HCl，pH8.5缓冲液终止反应，用蛋白G预装柱进行如上步的亲和层析纯化。 Lowry法测定浓度为1mg/ml。结果如图38所示。

4）重组突变体抗体F(ab)₂片段阻止SpA与人IgG结合的验证

将各SpA5蛋白用0.1mol/L碳酸盐缓冲液pH9.5稀释至500ng/ml浓度包被96孔ELISA 板，4℃包被过夜。洗涤液（Tris2.42g，吐温200.5mL，用浓HCl调pH=7.4，加ddH₂O 至总体积1000ml）洗板4次。向各孔加入200μl封闭液(5%(w/v)脱脂奶粉溶于100mmol/L TTBS(Tris(pH7.5)，吐温200.1%(v/v)，NaCl 0.9%(w/v)中)，37℃封闭2小时。弃液体，用 洗涤液洗板4次。加入人IgG-HRP(中杉金桥，北京)（1:5000)100μl，及稀释至100ng/ml的 兔抗突变体蛋白抗体F(ab)2片段100μl与其反应，37℃温育60min。弃液体，用洗涤液洗板4 次。加入100μl/孔新配制含OPD的显色液，室温避光显色15min。加入50μl12.5%H₂SO₄终 止反应。测定OD450nm。OD值越高表明与人IgG结合越强，越不适合做为候选抗原。结果 总结如表3及图39所示。

表3：重组突变体抗体F(ab)2片段阻止SpA与人IgG结合的ELISA结果（OD450nm）

由结果可知，本发明的各SpA5蛋白产生的抗体都能有效地与SpA结合，从而显著降低 SpA与人IgG的结合能力，而抗SpA5(RRVV)抗体F(ab)2的降低能力最强。

实施例8：B细胞凋亡诱导实验

1）取6周龄BALB/c小鼠（北京华阜康），体重约为16g，共计64只，随机分为7组， 每组8只，分别编号为PBS组、SpA组、SpA5wt组及SpA5各突变体组。

2）SpA组腹腔注射SpA纯化蛋白，每只剂量为150μg；SpA5wt组腹腔注射野生型的 SpA5wt纯化蛋白，每只剂量为150μg；SpA5突变体组腹腔注射SpA5突变体纯化蛋白，每只 剂量为150μg；PBS组注射相等体积的PBS。

3）4小时后断颈处死小鼠，取各组小鼠的脾脏，加入PBS，用200目的筛网制成单细胞 悬液，1000r/pm离心5mins弃上清。

4）取4℃的红细胞裂解液(BD Biosciences，美国)，按1:5的比例向细胞沉淀中加入红细 胞裂解液(1ml细胞体积加入5ml裂解液)，轻轻吹打混匀，室温静置5min；800-1000rpm离心 5分钟，离心弃去上层红色清液；收集沉淀部分，加入Hank’s液（Hyclone，美国）或无血清 培养基1640（Hyclone，美国）离心洗3次；加入完全培养基1640（Hyclone，美国）调整细 胞的密度为2×10⁶细胞/ml。

5）细胞收集：将细胞直接收集到96孔U型板。离心：U型板直接在U型板架上离心 1800rpm5min，然后甩掉上清，用160μl着色缓冲液（PBS＋1%胎牛血清（GIBCO，新西兰）） 重悬，然后离心同上；1.5ml Ep管在小型离心机上离心1800rpm5min，去上清后，用1ml着 色缓冲液重悬，然后离心同上。

6）流式染色：离心时预先配制染色液重组藻红蛋白耦联的抗小鼠CD19抗体（eBioscience， 美国），然后根据需要的2倍倍比配制后按50μl/孔加入到上述离心的细胞孔，4℃孵育30min。 加入100μl着色缓冲液稍重悬，离心1800rpm5min。去上清，加入160μl着色缓冲液重悬， 离心1800rpm5min。

7）上机检测：去上清，加入150μl1×PBS重悬入上样管，上机（BD FACSCantoⅡ）按 BD FACSCantoⅡ操作程序进行检测。

CD19+白细胞百分比越接近阴性对照表明所试验蛋白诱导凋亡能力越少，所试验蛋白就 更适合做为候选抗原。结果总结如表4和图40所示。

表4：CD19+B细胞百分率

由结果可知，SpA（252）及SpA5wt都能诱导小鼠脾B淋巴细胞凋亡，而各突变体都不 引起B细胞凋亡（平均值±stdev，n=8）。

根据上述几个实施例，将本发明的各SpA5蛋白的表达量、与人IgG结合能力、抗SpA5 突变体F(ab)2片段阻止SpA结合人IgG能力及诱导B细胞凋亡能力与SpA5ref(KKAA)的比 较，结果见表5。

表5：SpA5各突变体性质总结

实施例9：SpA5疫苗的制备

磷酸铝为美国GENERAL CHEMICAL公司原装进口产品(20mg/ml)。

1、配制金黄色葡萄球菌重组SpA5疫苗

①准确量取磷酸铝佐剂80μl，将其加入到配制瓶中。量取疫苗稀释液（组氨酸10mM、 NaCl 0.9%、泊洛沙姆1880.01%、pH6.0）220μl，总体积300μl，充分混匀；

②用疫苗稀释液将各SpA5蛋白稀释至30μg/300μl，充分混匀；

③将等体积的稀释后佐剂溶液与稀释后蛋白溶液加入至分装瓶中，温度范围4℃-32℃条 件下，垂直混悬或水平搅拌吸附1小时后即得。

2、10%SDS-PAGE鉴定重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白磷酸铝佐剂吸附均一性与完全 性

①取上述疫苗制剂1ml，4℃，6000rpm离心5分钟，小心吸取上清，并从上清取样40μl；

②补入与上清等体积的解离液（1M Na₂CO₃），室温条件下，垂直混悬1小时，取样40μl；

③按上述1的方法配制不含磷酸铝佐剂的蛋白溶液，磷酸铝所占体积以疫苗稀释液补足， 充分混匀后取样40μl；

④将所取样品加入10μl5×蛋白上样缓冲液，100℃加热5分钟，冷却并瞬时离心后，取 10μl上样；

⑤利用10%SDS-PAGE电泳，电压先80v电泳20分钟，再调至180v，电泳40分钟。然 后将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统 下观察结果，结果示于图41，说明磷酸铝佐剂能充分充分吸附蛋白。

实施例10：感染用金黄色葡萄球菌菌株（国际标准株MRSA-252）标准定量曲线的建立

将菌株接种于MH平板置于37℃孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于MH液体 培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6小时后6000rpm离心10min收集菌体，用生理盐 水洗涤菌体2次；再将菌液进行10倍和1.25倍稀释，并在紫外分光系统下测定各菌液的在 600nm处的吸光度（OD600），并取各个稀释度的菌液100μl涂布于MH平板，置于37℃孵育 24小时后计数菌落；根据各个平板菌落数和菌液的OD600值绘制标准定量曲线。

结果：标准曲线公式为Y=2.3065X+0.0051（109CFU/ml），相关系数为0.9999。

实施例11：脓毒血症动物模型的构建

1、将MRSA-252菌株接种于MH平板置于37℃孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接 种于MH液体培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6小时后收集菌体，并利用标准曲线 公式进行定量，再将菌液稀释（或浓缩）为2.0×10¹⁰CFU/mL、1.5×10¹⁰CFU/mL、 1.25×10¹⁰CFU/mL、1.0×10¹⁰CFU/mL不同浓度组，再用各组菌液通过尾静脉注射6～8周龄、 体重为18～20g的BALB/C小鼠（100μl/只）进行全身感染，同时设置生理盐水对照组，观察 7天并统计各组小鼠的死亡率；

2、感染后计时每隔24小时（至感染后7天）采用菌落计数法对细菌定植量进行检测： 从各感染组和对照组中随机选取3只小鼠，利用眼球摘除法，取小鼠血样0.5～1mL，取20μL 血样用180μL肝素稀释10倍后用于细菌计数，取50μL涂于平板，置于37℃，24h后计数克 隆数；取完血样后将小鼠处死放入75%酒精中浸泡消毒后，取出将其四肢固定，将其解剖， 取出脾、肾、肝脏，置于2mL无菌的PBS中，于洁净的玻璃匀浆器中进行匀浆，取1mL均 浆按照1:10、1:100、1:1000比例进行稀释；每稀释度各取100μL轻轻涂布于固体培养基上， 置于37℃，培养24h，做菌落计数。结果显示于表6。

表6：MRSA-252最小致死剂量与亚致死剂量的确定

2.0×10⁹CFU剂量组12小时（h）内小鼠死亡率为100%；1.5×10⁹CFU剂量组48h内小鼠 死亡率为90%，72h内死亡率为100%；1.25×10⁹CFU剂量组48h内小鼠死亡率为80%，96h 内死亡率为小鼠死亡率为90%，120h内死亡率为小鼠死亡率为100%；1.0×10⁹CFU剂量组48h 内小鼠死亡率为10%，72h内死亡率为小鼠死亡率为20%，7天（d）内死亡率为小鼠死亡率 为70%；由此可见MRSA-252最小致死剂量约为1.25×10⁹CFU，亚致死剂量为 1.0～1.25×10⁹CFU。

3、MRSA-252感染BALB/C小鼠后在血液和各脏器中的定植量：

感染后血液中细菌的在48h时达到峰值，最大定植量达到8.0×10⁹CFU/ml，在72h时血 液中细菌量开始减少，到96h时血液中未检测出细菌；感染后脾、肾、肝脏中定植的细菌均 在72时达到峰值，最大定植量均达到8.0×10⁹CFU/ml；对照组小鼠的血液、脾、肾、肝脏中 的细菌定植检测结果均为零。

以上结果针对小鼠的生存率和血液、脾、肾、肝脏主要器官细菌定植量进行了动物模型 的评价，为SA单个亚单位疫苗和SA多亚单位融合疫苗的成功研制及SA感染的发病机制的 研究奠定了基础。

实施例12：通过动物免疫攻毒保护确定SpA5作为抗原的效果

1、将SpA5ref(KKAA)、SpA5(KKAA)及SpA5(RRVV)按实施例9制成疫苗。

2、实验动物及分组：

使用雌性6周龄BALB/C小鼠（北京华阜康）。设疫苗稀释液、磷酸铝佐剂对照组、 SpA5ref(KKAA)、SpA5(KKAA)及SpA5(RRVV)五组，每组30只。

3、将各疫苗分别以30μg/100μl分三次股四头肌肌注（0、14、21天）免疫。

4、攻毒：末次免疫，在第14天采用致死剂量，尾静脉注射MRSA-252活菌进行攻毒实 验，每只BALB/C小鼠注射菌液量为1.25×10⁹CFU（根据表6确定的结果），观察10天，统 计各组小鼠的存活率。

5、结果见表7。

表7：SpA5各突变体蛋白免疫小鼠后的攻毒保护能力

组别 10天后存活数（只） 生存率 疫苗稀释液 4 13% AlPO₄6 20% SpA5(KKAA) 11 37% SpA5(RRVV) 12 40% SpA5ref(KKAA) 10 33%

由表可知，SpA5(KKAA)和SpA5(RRVV)都对动物有很好的保护效果。