利用特异基因鉴定高致病型大丽轮枝菌的方法及其应用

摘要

本发明提供了一种高致病型大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)基因，其中，该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种鉴定大丽轮枝菌致病型的方法，该方法包括以下步骤：（1）制备含有大丽轮枝菌的全基因组DNA的待测样本；（2）以步骤（1）中得到的全基因组DNA待测样本为模板进行PCR扩增，检测扩增产物中是否存在SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；（3）根据步骤（2）的检测结果判断大丽轮枝菌菌株的致病型。本发明还提供了一种试剂盒。

说明书

技术领域

本发明涉及农作物病害防治领域，具体地，涉及一种高致病型大丽轮枝 菌(Verticillium dahliae)基因、一种鉴定大丽轮枝菌致病型的方法和试剂盒。

背景技术

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)是一种植物致病真菌，它可以导致植物 （尤其是农作物如棉花、番茄等）发生黄萎病。但是，不同致病型的大丽轮 枝菌菌株的致病表现差别很大，例如某些高致病型的菌株感染棉花后会导致 棉花产生严重病害而引起棉花产量下降，而某些低致病型的菌株感染棉花后 仅导致棉花的轻微病害且对棉花产量影响较小。此外，大丽轮枝菌还表现出 一定的潜伏性，即高致病型菌株在感染当年可能不致病，而在次年大范围地 严重致病。

如果能够检测出农田中大丽轮枝菌的主要菌株类型，并对其致病型作出 准确的判断，就可以结合药物防治和轮作等农业手段抑制病害的发生，从而 增加经济效益和社会效益。

发明内容

本发明的目的是解决如何准确判断大丽轮枝菌菌株的致病型的技术问 题，提供一种高致病型大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)基因、一种鉴定大丽 轮枝菌致病型的方法和试剂盒。

SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列为本发明人发现的在高致病型的大丽 轮枝菌菌株的基因组序列中出现而在低致病型的大丽轮枝菌的基因组序列 中不出现的序列。因而，对于某一致病型待测的大丽轮枝菌菌株，只要鉴定 该大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中是否存在SEQ ID NO：1所示的序列， 即可获知该大丽轮枝菌菌株是否为高致病型大丽轮枝菌。具体地，如果鉴定 出该大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中不存在SEQ ID NO：1所示的序列， 则判断该大丽轮枝菌菌株不属于高致病型；如果鉴定出该大丽轮枝菌菌株的 基因组的序列中存在SEQ ID NO：1所示的序列，则判断该大丽轮枝菌菌株 属于高致病型。并且，如果以该大丽轮枝菌菌株的全基因组DNA待测样本 为模板进行PCR扩增的产物中不存在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，就 能够充分证明该大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中不存在SEQ ID NO：1所 示的序列。由此，本发明的发明人得到了本发明的技术方案。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种高致病型大丽轮枝菌 (Verticillium dahliae)基因，其中，该基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序 列。

另一方面，本发明还提供了一种鉴定大丽轮枝菌致病型的方法，该方法 包括以下步骤：

（1）制备含有大丽轮枝菌的全基因组DNA的待测样本；

（2）以步骤（1）中得到的全基因组DNA待测样本为模板进行PCR扩 增，检测扩增产物中是否存在SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

（3）根据步骤（2）的检测结果判断大丽轮枝菌菌株的致病型，在所述 扩增产物中不存在SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的情况下，则指示所述大 丽轮枝菌的菌株不属于高致病型；在所述扩增产物中存在具有SEQ ID NO： 4所示的核苷酸序列的情况下，则指示该大丽轮枝菌的菌株属于高致病型。

另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明提供的 引物和PCR试剂。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供一种高致病型大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)基因，其中， 该基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列核酸。

本发明还提供了一种鉴定大丽轮枝菌致病型的方法，该方法包括以下 步骤：

（1）制备含有大丽轮枝菌的全基因组DNA的待测样本；

（2）以步骤（1）中得到的全基因组DNA待测样本为模板进行PCR扩 增，检测扩增产物中是否存在SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

（3）根据步骤（2）的检测结果判断大丽轮枝菌菌株的致病型，在所述 扩增产物中不存在SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的情况下，则指示所述大 丽轮枝菌的菌株不属于高致病型；在所述扩增产物中存在具有SEQ ID NO： 4所示的核苷酸序列的情况下，则指示该大丽轮枝菌的菌株属于高致病型。

其中，SEQ ID NO：4所示的核酸是SEQ ID NO：1所示的核酸的一个 片段，它能够通过上述引物对以SEQ ID NO：1所示的核酸为模板而PCR 扩增得到。

其中，制备待测样本的步骤可以按照本领域常规的制备用于检测核酸的 样本的方法进行，本发明没有特别的要求，例如可以从棉花植株上采集组织， 并且将采集的组织在含有抗性的培养基上培养，并且筛选、辨别和分离大丽 轮枝菌的菌落，然后按照（《植物基因工程》（何光源著，科学出版社，2007 年出版））中所述的方法提取大丽轮枝菌的基因组DNA，即可制备得到待测 样本。

其中，检测扩增产物中是否存在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的方 法可以按照本领域常规的方法和标准进行，例如可以通过琼脂糖凝胶电泳进 行检测，如果需要还可以通过对电泳得到的目的条带进行回收测序来进一步 判断。

所述扩增中用到的引物可以根据SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的特征 及引物设计的规则来设计，优选情况下，所述引物包括如SEQ ID NO：2（F： 5'CTGACGACTATAGTCCTCCTGG3'）所示的正向引物和如SEQ ID NO：3 （R：5'CTTGATAGCAGCGGTAAGATTC3'）所示的反向引物。

另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有引物和PCR 试剂，其中，所述引物包括如SEQ ID NO：2（F：5' CTGACGACTATAGTCCTCCTGG3'）所示的正向引物和如SEQ ID NO：3 （R：5'CTTGATAGCAGCGGTAAGATTC3'）所示的反向引物。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，各种大丽轮 枝菌的菌株属于经过合法渠道获得的遗传资源。

实施例1

本实施例用于说明待测样本的制备。具体地，是从80个不同的大丽轮 枝菌菌株（编号为VDG1至VDG80）的基因组DNA的制备。

切取棉花植株离地表约10-35cm处的茎，切成1mm³左右大小的小块， 接种在在含有抗生素（氨苄青霉素、利福平和链霉素，浓度均为100μg/ml） 的PDA培养基（含有马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L）上，25℃ 下培养7天，根据大丽轮枝菌的标准菌落形态鉴别大丽轮枝菌的菌落。得到 鉴别的大丽轮枝菌的菌落即作为大丽轮枝菌菌株样品。

按照上述方法，从80个不同的棉花植株中取得80个不同的大丽轮枝菌 菌株，将上述80个不同的大丽轮枝菌菌株按照《植物基因工程》（何光源著， 科学出版社，2007年出版）中所述的方法，分别提取基因组DNA样本，得 到待测样本1-80。

实施例2

本实施例用于说明上述80个不同的大丽轮枝菌菌株的致病型的检测结 果。

参照文献（张兴华，棉花抗枯、黄萎病研究进展及其抗性鉴定方法，江 西农业学报，2008,20(3):43-49）中的人工苗床病圃法，对实施例1中所述 的80个不同的大丽轮枝菌菌株进行棉花苗期致病型鉴定。以所述的80个不 同的大丽轮枝菌菌株在接种健康棉花植株后的病情指数来表征致病型的高 低。

具体地，将大丽轮枝菌在查比克培养基（2g/L的NaNO₃，1g/L的K₂HPO₄， 0.5g/L的KCl，0.5g/L的MgSO₄，0.01g/L的FeSO₄，30g/L的蔗糖，20g/L的琼 脂）上培养至产生孢子，用无菌水洗下孢子得到孢子悬液，并将孢子悬液中 的孢子浓度调整至2×10⁶个/ml。然后，在同一品种的棉花15日龄幼苗的下 胚轴处，使用1ml规格的无菌注射器接种上述孢子悬液，每株接种量为100μl， 接种后每周统计发病情况，计算第四周的病情指数。

本实施例检测得到了上述80个不同的大丽轮枝菌菌株的致病型，通过 上述鉴别标准，鉴定出其中61个大丽轮枝菌菌株的病情指数均高于35，属 于高致病型，而另外19个大丽轮枝菌菌株的病情指数均低于20，不属于高 致病型。

上述61个属于高致病型的大丽轮枝菌菌株分别为：VDG3、VDG63、 VDG61、VDG18、VDG35、VDG32、VDG73、VDG31、VDG33、VDG26、 VDG55、VDG23、VDG57、VDG36、VDG11、VDG67、VDG47、VDG5、 VDG29、VDG59、VDG49、VDG44、VDG21、VDG48、VDG8、VDG50、 VDG25、VDG43、VDG37、VDG46、VDG16、VDG4、VDG68、VDG6、 VDG52、VDG34、VDG7、VDG45、VDG12、VDG76、VDG27、VDG10、 VDG41、VDG64、VDG17、VDG54、VDG39、VDG75、VDG20、VDG13、 VDG22、VDG38、VDG19、VDG28、VDG14、VDG9、VDG53、VDG15、 VDG42、VDG40和VDG1。上述19个不属于高致病型的大丽轮枝菌菌株分 别为：VDG70、VDG69、VDG71、VDG24、VDG79、VDG65、VDG56、 VDG77、VDG74、VDG30、VDG80、VDG60、VDG2、VDG58、VDG66、 VDG62、VDG72、VDG80和VDG51。

实施例3

按照Illumina公司的测序仪Genome Analyzer的说明书（Solexa技术） 中规定的方法，测定大丽轮枝菌菌株（编号为VDG1以及VDG2）的全基因 组序列。

本实施例得到了上述2个不同的大丽轮枝菌菌株的全基因组序列，通过 序列比对，鉴定出VDG1的全基因组序列中不含有SEQ ID NO：1所示的序 列；而VDG2的全基因组序列中含有SEQ ID NO：1所示的序列。

通过上述相同的方法，鉴定出上述80个不同的大丽轮枝菌菌株中的61 个（分别为VDG3、VDG63、VDG61、VDG18、VDG35、VDG32、VDG73、 VDG31、VDG33、VDG26、VDG55、VDG23、VDG57、VDG36、VDG11、 VDG67、VDG47、VDG5、VDG29、VDG59、VDG49、VDG44、VDG21、 VDG48、VDG8、VDG50、VDG25、VDG43、VDG37、VDG46、VDG16、 VDG4、VDG68、VDG6、VDG52、VDG34、VDG7、VDG45、VDG12、VDG76、 VDG27、VDG10、VDG41、VDG64、VDG17、VDG54、VDG39、VDG75、 VDG20、VDG13、VDG22、VDG38、VDG19、VDG28、VDG14、VDG9、 VDG53、VDG15、VDG42、VDG40和VDG1）的基因组的序列中均含有SEQ  ID NO：1所示的序列；并且，另外的19个大丽轮枝菌菌株（分别为VDG70、 VDG69、VDG71、VDG24、VDG79、VDG65、VDG56、VDG77、VDG74、 VDG30、VDG80、VDG60、VDG2、VDG58、VDG66、VDG62、VDG72、 VDG80和VDG51）的全基因组序列中不含有SEQ ID NO：1所示的序列。

根据实施例2和实施例3的结果可以确定，如果鉴定出大丽轮枝菌菌株 的基因组的序列中存在SEQ ID NO：1所示的序列，则该大丽轮枝菌菌株属 于高致病型；如果鉴定出大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中不存在SEQ ID  NO：1所示的序列，则该大丽轮枝菌菌株不属于高致病型。

实施例4

以实施例1中分别制得的检测样本DNA作为模板进行PCR扩增，引物 包括如SEQ ID NO：2（F：5'CTGACGACTATAGTCCTCCTGG3'）所示的 正向引物和如SEQ ID NO：3（R：5'CTTGATAGCAGCGGTAAGATTC3'） 所示的反向引物。

具体的扩增条件包括：94℃，10分钟；（94℃，30秒，54℃，45秒，72℃， 1分钟）35个循环；72℃，10分钟，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

检测结果说明：上述80个不同的大丽轮枝菌菌株中的61个（分别为 VDG3、VDG63、VDG61、VDG18、VDG35、VDG32、VDG73、VDG31、 VDG33、VDG26、VDG55、VDG23、VDG57、VDG36、VDG11、VDG67、 VDG47、VDG5、VDG29、VDG59、VDG49、VDG44、VDG21、VDG48、 VDG8、VDG50、VDG25、VDG43、VDG37、VDG46、VDG16、VDG4、 VDG68、VDG6、VDG52、VDG34、VDG7、VDG45、VDG12、VDG76、 VDG27、VDG10、VDG41、VDG64、VDG17、VDG54、VDG39、VDG75、 VDG20、VDG13、VDG22、VDG38、VDG19、VDG28、VDG14、VDG9、 VDG53、VDG15、VDG42、VDG40和VDG1）的基因组的序列中均存在SEQ  ID NO：4所示的序列；证明这些大丽轮枝菌菌株均存在具有SEQ ID NO：1 所示的序列的核酸，据此判断这些大丽轮枝菌菌株属于高致病型。并且，另 外的19个大丽轮枝菌菌株（分别为VDG70、VDG69、VDG71、VDG24、 VDG79、VDG65、VDG56、VDG77、VDG74、VDG30、VDG80、VDG60、 VDG2、VDG58、VDG66、VDG62、VDG72、VDG80和VDG51）的基因组 的序列中不存在所述SEQ ID NO：4所示的序列；证明这些大丽轮枝菌菌株 均不存在具有SEQ ID NO：1所示的序列的核酸，据此判断这些大丽轮枝菌 菌株不属于高致病型。

根据实施例2和实施例4的结果可以确定，如果鉴定出大丽轮枝菌菌株 的基因组的序列中不存在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，则该大丽轮枝 菌菌株不属于高致病型；如果鉴定出大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中存在 SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，则该大丽轮枝菌菌株属于高致病型。