一种玉米单倍体植株染色体组加倍的方法

摘要

本发明公开了一种玉米单倍体植株染色体组加倍的方法，包括以下步骤：首先配置秋水仙素溶液，并加入助渗剂二甲基亚砜混合均匀得到注射液，再将注射液80～100微升注射入单倍体玉米植株茎尖生长点，对接受注射后的玉米植株进行常规护理，即可收获染色体组加倍的种子。本发明可大大提高染色体组加倍的成功率，降低了科研人员的工作量，缩短了育种时间，并且科研人员无需长时间暴露在秋水仙素污染的环境中，身体健康安全得到保障。

说明书

技术领域

本发明属于农业育种领域，特别涉及一种玉米单倍体植株染色体组加倍 的方法。

背景技术

传统的玉米育种中常采用双单倍体育种（Doubled haploid,DH）技术来 利用孤雌生殖诱导系诱导产生单倍体，再经加倍形成二倍体，一般只需经过2 个世代就可得到100%的纯合系，其被称为DH（Doubled Haploid）系，育种 进程较快。

玉米单倍体植株由于只含1套染色体组，一般生长势较弱，多数表现出 高度不育，生产中直接应用效率极低。只有将单倍体加倍后使其植株散粉得 到DH系，才能在育种中大规模应用。玉米单倍体加倍技术的限制是当前玉 米单倍体育种技术规模化应用的主要限制因素。

目前实现单倍体加倍主要有两种途径：单倍体自然加倍或单倍体人工加 倍。

单倍体自然加倍由于不借助任何药剂，是较经济实惠的方法。然而自然 加倍只适用于自然加倍率高的背景材料，同时要积极创造能提高单倍体自然 加倍率的地理、生态、气候条件，该方法受遗传背景影响较大且加倍成功率 低。

单倍体人工加倍是获得DH系较有效的方法，最常用的是化学药剂法， 其原理是使用化学药剂破坏细胞有丝分裂时纺锤丝的形成，使2个子细胞染 色体在有丝分裂后期不移向两极，从而改变细胞染色体倍性，实现染色体的 化学加倍，目前，主要利用的化学药剂有秋水仙素和除草剂。在国内，利用 秋水仙素加倍单倍体的方法已较为成熟，秋水仙素是一种高毒致癌物，在实 际操作中常常添加二甲基亚砜（DMSO）作为助渗剂来提高加倍效率。化学药 剂法在实际使用时又分为浸泡法和滴定法：浸泡法一般是使用0.06%～0.5% 的秋水仙素溶液浸泡玉米种子、幼芽或幼苗根部，浸泡时间为12～48小时， 再将材料清洗干净后转入温室培养或移入田间栽种，加倍率可达到20～50%， 该方法因加倍效率高而被广泛应用，但是该方法需要使用秋水仙素溶液长时 间浸泡玉米材料，而后又要清洗、移栽，高毒致癌物-秋水仙素长时间处于开 放环境，科研人员在浸泡、清洗、移栽的过程中要长时间接触秋水仙素，身 体健康安全受到了威胁；滴定法是用滴管将0.06%～0.5%的秋水仙素溶液滴 在子叶、幼苗的生长点，由于溶液滴流、蒸发后药效降低，需要每隔6～8小 时滴定一次，如此反复数日，该方法需要科研人员反复定时滴定，程序繁琐， 工作量大，并且在反复滴定操作过程中科研人员暴露在秋水仙素开放的环境 里，身体健康受到损害。

因此，目前急需一种加倍成功率高，又使科研人员的身体健康得到保障 的玉米单倍体植株染色体组加倍方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种既能提高加倍成功率，又对科研人员的健康 伤害较小的玉米单倍体植株染色体组加倍的方法。

本发明所提供的一种玉米单倍体植株染色体组加倍的方法，包括以下步 骤：

（a）配置秋水仙素溶液，并加入助渗剂混合均匀得到注射液；

（b）将步骤(a)所得的注射液80～100微升注射入单倍体玉米植株茎尖 生长点；

（c）对接受注射后的玉米植株进行常规护理，收获染色体组加倍的种子。

其中，步骤(a)中所述的秋水仙素溶液的质量百分比浓度为0.3%～0.8%， 优选地，所述水仙素溶液的质量百分比浓度为0.5%。

其中，步骤(a)中所述的助渗剂为二甲基亚砜，其添加量优选为为按质量 百分比加入2%～3%，最优选地，所述二甲基亚砜的添加量为按质量百分比加 入2.5%。

其中，步骤(b)中所述的单倍体玉米植株优选为2～3叶期的单倍体玉米 植株。

其中，在步骤(b)中注射入单倍体玉米植株茎尖生长点的注射液的注射量 优选为100微升。

为使本发明达到更好的技术效果，所述单倍体玉米植株为将单倍体玉米 种子在温室大棚中播种种植而得，在所述步骤(b)完成以后，再将玉米植株移 栽至大田。

本发明所提供的技术方案，实现了以下有益效果：

（1）通过注射的方法将秋水仙素精准注射入玉米幼苗的茎尖生长点，使 秋水仙素的效果达到最大化，加倍成功率可提高到30～50%，高于使用自然 加倍法的10%～20%的加倍率，降低了科研人员的工作量，缩短了育种时间；

（2）本发明的方法比传统的化学药剂法简单、快捷，科研人员只需要配 置秋水仙素溶液后进行注射操作，程序简单、时间短，无需长时间暴露在秋 水仙素污染的环境中，身体受到的损害大为减少，健康安全得到保障。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本 发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂、种子、种苗均为常规市售， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中使用的玉米品系农大高诱1号、M9均从广西壮族自治区 农业科学院获得。

实施例1

1.2012年3月以农大高诱1号为父本，双M9×M9杂交组合为母本， 杂交获得60粒玉米单倍体种子，2012年8月将这些种子播种于广西农科 院玉米研究所温室大棚，进行常规护理，使其萌芽生长。

2.配置质量百分比为0.3%的秋水仙素溶液，并加入质量百分比为2%二 甲基亚砜，制成注射液，使用注射器将注射液100微升注射于3叶期单倍体 玉米植株的茎尖生长点。

3.在注射7天后把单倍体玉米植株移至大田并常规精细护理，收获种子。

实施例2

1.2012年3月以农大高诱1号为父本，双M9×M9杂交组合为母本， 杂交获得60粒玉米单倍体种子，2012年8月将这些种子播种于广西农科 院玉米研究所温室大棚，进行常规护理，使其萌芽生长。

2.配置质量百分比为0.5%的秋水仙素溶液，并加入质量百分比为2.5% 二甲基亚砜，制成注射液，使用注射器将注射液100微升注射于3叶期单倍 体玉米植株的茎尖生长点。

3.在注射7天后把单倍体玉米植株移至大田并常规精细护理，收获种子。

实施例3

1.2012年3月以农大高诱1号为父本，双M9×M9杂交组合为母本， 杂交获得60粒玉米单倍体种子，2012年8月将这些种子播种于广西农科 院玉米研究所温室大棚，进行常规护理，使其萌芽生长。

2.配置质量百分比为0.8%的秋水仙素溶液，并加入质量百分比为3%二 甲基亚砜，制成注射液，使用注射器将注射液100微升注射于3叶期单倍体 玉米植株的茎尖生长点。

3.在注射7天后把单倍体玉米植株移至大田并常规精细护理，收获种子。

实施结果及分析

统计实施例2的实施结果：2012年10月共有21株植株散粉，即加倍 成功率为21/60×100%=35%，11月底收获时，共16株玉米能收到至少一 粒种子，结实株率为16/60=26.7%；2013年3月播种这一批种子共45粒， 进行农艺性状观察及配合力测定，最终育成了五个农艺性状优良的双单倍 体玉米自交系，如果用自然加倍方法进行染色体组加倍则需要233粒左右的 玉米单倍体种子，意味着需要杂交11.6倍的双M9×M9杂交组合为母本来 诱导才能达到类似的效果（表1）。使用本发明方法进行玉米单倍体植株染 色体组加倍，加倍成功率达到35%，结实株率可达到26.7%，大大高于使用自 然加倍法的1%～5%加倍率和0.5～8%的结实株率，可见使用本发明方法大大 降低了科研人员的工作强度，并且科研人员也无需长时间暴露于致癌物秋水 仙素污染的环境，保障了他们的身体健康安全。

表1本发明方法与自然加倍法加倍效率对比