法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-08-26
授权
授权
2014-03-12
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/63 申请日:20131114
实质审查的生效
2014-02-12
公开
公开
技术领域
本发明属生物工程领域的基因工程和细胞工程技术，特别是应用于大规模重组人纤溶酶原激活剂（rhPA）的生产技术领域。
背景技术
动物乳腺生物反应器技术是指利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物，指导外源基因在转基因动物的乳腺中表达，并从动物的乳汁中获取重组蛋白，具有很高的商业应用价值。家兔具有泌乳量高、妊娠期短、每胎产仔数多等优点。到目前为止，应用兔乳腺生物反应器生产重组人组织纤溶酶原激活剂尚未见报道。
血栓性疾病是危害人类生命和健康的主要疾病之一，目前临床上用于治疗该类疾病溶栓药物以天然人组织纤溶酶原激活剂（tPA）为代表。在血中的半衰期甚短（3～5分钟），使得在临床治疗中为维持其有效浓度而必须大剂量静脉滴注，从而增加了循环系统出血的风险。
虽然重组rhPA能够在原核细胞表达，但表达产物没有活性，需进行复性，由此增加了生产环节。即使通过复性后产生活性，但其比活性也偏低。由此造成生产成本增加，致使其价格昂贵临床治疗费用高。此外，原核产品与人体相融性差，易相生不良反应，也降低节药物的安全性，增加了临床应用风险。
因此，设计并研制延长半衰期，降低系统出血倾向，提高比活性，降低价格成为开发新型rhPA药物的重要目标，这类新药的开发对于保障人类的生命健康具有重要的实际意义。
发明内容
本发明第一目的提出可用于制备重组人纤溶酶原激活剂的载体pGEMT/rhPA。其DNA序列为：
tcgactctag agggacagcc cccccccaaa gcccccaggg atgtaattac gtccctcccc 60
cccgagccgg cagcgtgcgg ggacagcccg ggcacgggga aggtggcacg ggatcgcttt 120
cgctaggggc agcagcgagc cgcccggggc tccgctccgg tccggcgctc cccccgcatc 180
cctctgaacg cttctcgctg ctctttgagc ctgcagacac ctggggggat acggggaaaa 240
agctttaggc tgaaagagag atttagaatg acagaatcat agaacggcct gggttgcaaa 300
ggagcacagt gctcatccag atccaacccc ctgctatgtg cagggtcatc aaccagcagc 360
cagcctcctt gggcaacctg ttcagtgcgt caccaccctc tgggggaaaa actgcctcct 420
ccaggctgcc cagagccaca tccagcctgg ccttgaatgc ctgcagggat ggggcatcca 480
catatccaac ccaaacctcc cctgtctcag tgtaaagcca ttcccccttg tcctatcaag 540
ggggagtttg ctgtgacatt gttggtctgg ggtgacacat gtttgccaat tcagtgcatc 600
acggagaggc agatcttggg gataaggaag tgcaggacag catggacgtg ggacatgcag 660
aagataggat agaaggacaa agagcaagtt aaaacccagc atggagagga gcacaaaaag 720
gtgttgaggg ctctgggaca ctctccaagt cacagcgttc agaacagcct taaggataag 780
gccacagaca ctgctggtcc ctgtgtctga gcctgcatgt ttgatggtgt ctggatgcaa 840
gcagaagggg tggaagagct tgcctggaga gatacagctg ggtcagtagg actgggacag 900
gcagctggag aattgccatg tagatgttca tacaatcgtc aaatcatgaa ggctggaaag 960
cctccaagat ccccaagacc aaccccaacc cacccaccgt gcccactggc catgtccctc 1020
agtgccacat ccccacagtt cttcatcacc tccagggacg gtgacccccc cacctccgtg 1080
ggcagctgtg ccactgcagc accgctcttt ggagaaggta aatcttgcta aatccagccc 1140
gaccctcccc tggcacaacg taaggccatt atctctcatc caactccagg acggagtcag 1200
tgaggatggg gctctagagg gacagccccc ccccaaagcc cccagggatg taattacgtc 1260
cctcccccgc taggggcagc agcgagccgc ccggggctcc gctccggtcc ggcgctcccc 1320
ccgcatcccc gagccggcag cgtgcgggga cagcccgggc acggggaagg tggcacggga 1380
tcgctttcct ctgaacgctt ctcgctgctc tttgagcctg cagacacctg gggggatacg 1440
ttgcaaagga gcacagtgct catccagatc caaccccctg ctatgtgcag ggtcatcaac 1500
gggaaaaagc tttaggctga aagagagatt tagaatgaca gaatcataga acggcctggg 1560
cagcagccca ggctgcccag agccacatcc agcctggcct tgaatgcctg cagggatggg 1620
gcatccacag cctccttggg caacctgttc agtgcgtcac caccctctgg gggaaaaact 1680
gcctcctcat atccaaccca aacctcccct gtctcagtgt aaagccattc ccccttgtcc 1740
tatcaagggg gagtttgctg tgacattgtt ggtctggggt gacacatgtt tgccaattca 1800
gtgcatcacg gagaggcaga tcttggggat aaggaagtgc aggacagcat ggacgtggga 1860
catgcaggtg ttgagggctc tgggacactc tccaagtcac agcgttcaga acagccttaa 1920
ggataagaag ataggataga aggacaaaga gcaagttaaa acccagcatg gagaggagca 1980
caaaaaggcc acagacactg ctggtccctg tgtctgagcc tgcatgtttg atggtgtctg 2040
gatgcaagca gaaggggtgg aagagcttgc ctggagagat acagctgggt cagtaggact 2100
gggacaggca gctggagaat tgccatgtag atgttcatac aatcgtcaaa tcatgaaggc 2160
tggaaagcct ccaagatccc caagaccaac cccaacccac ccaccgtgcc cactggccat 2220
gtccctcagt gccacatccc cacagttctt catcacctcc agggacggtg acccccccac 2280
ctccgtgggc agctgtgcca ctgcagcacc gctctttgga gaaggtaaat cttgctaaat 2340
ccagcccgac cctcccctgg cacaacgtaa ggccattatc tctcatccaa ctccaggaac 2400
ggagtcagtg aggatggggc tctagaggat ccctcgacct gcaggtcaac ggatcacaac 2460
aaactggaaa attcttcaag agaagaatac cagaccaccc tacctgcttc ctgagaaatc 2520
tgtttgctgc tcagaagcaa cagttagaac cagacatgga acaacagact ggttccaaat 2580
caggaaagga gtatgtcaag gctgtatatc gtcaccctga ttatttaact tatatgcata 2640
gtacataata caaaatgcca ggctggatga atcgcaagct ggaatcaaga tttctgggag 2700
aaatatcaat aaacgagata caaagataca ccacacttat ggcagaaaac taagaagaac 2760
taaagagcct cttgatgaaa gtgaaagagg agagtgaaaa agccagctta aaacccaaca 2820
ttcaaaatca agatcatcat ttcatggcaa ataaatgggg aaacaatgga aacagtgaga 2880
gactttattt tcttgggctc caaaatcact gcagattgtg actacagcca tgattaaaag 2940
atgcttgctc cttggaagag aagctattac caaactagaa agcatattaa aaagcagaga 3000
cgttactttg ctgactaagt tctgtctagt caaacctatg gtttttccag tagtcatata 3060
tggatgtgag ttgaactata aagaaagctg agcaccaaag aattgatgct tttgaaattt 3120
ggtgttggag aagtctcttg agagtccctt gaacctgcaa ggagatccaa ccagtccatc 3180
ctaaaggaaa tcagtcctga atattcattg gaaggactga tgctgaaatt gaagattaac 3240
gttttggact cacctaatgc agaagagcca actcactaga aaagacccca tgttggcaaa 3300
aattgaagcc aggaagagaa gtgaatgaca gaggatgaga tggttggatg gcatcgttga 3360
ctgaatggac atgagtctga tcaagttccg ggagacagca aaggacaggg ctgcctggtc 3420
tgctgcagtc catggggttg caaagagtcg gtctcaaatg agtaactaaa caacaaccaa 3480
gcagtagaaa aataaataaa atttgtctct gagatctcag tacctctttc tgtgcatatc 3540
cgtctcctgt tattgtactt tgtcttctgc ttgtaataaa gctgtcctgt tagtaaaatc 3600
ccacctctga gtaatataca gagaataaaa gaagggagaa attatgtgca agttctctct 3660
tgtttgggtc ctctgaattc ttttagctat caaaaatgga aggtgattat tgtgcaatgt 3720
catctcctgc ttctcattta aaagattcta cctcagtggg ggctaaaact ccacatttaa 3780
cagtagcaaa aaccaatatt ccatagcttc ttaggaaacc attttttata ctcttgtatg 3840
taattacatt caagctcaaa agcaaagaag tgattctgcg ttggtgaagg cccaaccata 3900
gaaaagagga agaaaatagg ccacatactg tgcttccccc atagctcagt tggtaaagaa 3960
tctacctaca atgcaggagg cctgggcttg atccctgggt aagggagatc ccctggagaa 4020
ggaaatggta acccactcca gtactcttgc ctgtaaatcc catggacgga ggagcctggc 4080
agctacagcc ttggggtggc aagagttgga catgattaac aactaaacca ctgccaccac 4140
tccacatact gagtgctccc cagtggcact agtggtaaag aaccacctgc cggtgcagaa 4200
gacattaaag acactggctc tatccctgct tgggaagtag ggaagatccc ctagagaggg 4260
aaatagcaac ccactccaga attcttgcct ggaaaatccc atgaatgaag actggcgggc 4320
tgtagtaact ggggtcacaa agagttaaac atgatttagc aactaaacat caccacatta 4380
aaaaaattac caccaaaata gtcatattcc aggctaaggg gaataatagc actagtacct 4440
gagagaactt tctcagattc tctgtcaagt tcttccttct ctcatataac cagtagtcta 4500
gtttacctca tcagatatta actactcatc gattctaaat tatctaatta tggggggggg 4560
cactacattg cattatattt tgtgtccatt gactatcact caatttattt ataaaaaatt 4620
catccatgtt gtttctgtga cagtaactca ttcacattaa ttgtaatatc tcattgcatt 4680
gtatactaca atttatttat acaaaatact attattcaca cttctgttga ttttaatttg 4740
gaacatcaac aataacgtgg ctgagaagct tctttcttta gtatattgtt aaggatttcc 4800
ttgatcaaga ttttacctac ttttctggtc caattggtga gagacagtca taaggaaatg 4860
ctgtgtttat tgcacaatat gtaaagcatc ttcctgagaa aataaaaggg aaatgttgaa 4920
tgggaaggat atgctttctt ttgtattcct tttctgagaa atcagacttt ttcaccttgg 4980
ccttggccac caaaagctaa caaataaagg catatgaagt agccaaggcc ttttctagtt 5040
atatctatga cactgagttc atttcatcat ttattttcct gacttcctcc tgggtccata 5100
tgagcagtct tagaatgaat attagctgaa taatccaaat acatagtaga tgttgatttg 5160
ggttttctaa gcaatccaag acttgtatga cagtaagatg tattaccatc caacacacat 5220
ctcagcatga tataaatgca aggtatattg tgaagaaaaa tttttaatta tgtcaaagtg 5280
cttactttag aaggtcatct atctgtccca aagctgtgaa tatatatatt gaaggtaatg 5340
tctgtcacta aagaggcaaa gaaacttgaa gattgctttt gcaaatgggc tcctattaat 5400
aatagatgaa gctaaccttg taaaaatgag tagtgtgaaa tacaactaca attatgaaca 5460
aaaaagtact tttgaggtct ggctcagact ctattgtagt acttagggta agaccctcct 5520
cctgtatggg ctttcatttt ctttcttgct tccctcattt gcccttccat gaatactagc 5580
tgataaacat tgactataaa agatatgagg ccaaacttga gctgtcccat tttaataaat 5640
ctgtataaat aatatttgtt ctacaaaagt attatctaaa taaatgttac tttctgtctt 5700
aaaatccctc aacaaatccc cactatctag agaataagat tgacattccc tggaatcaca 5760
gcatgctttg tctgccatta tctgacccct ttctctttct ctcttctcac ctccatctac 5820
tcctttttcc ttgcaattca tgacccagat tcactgtttg atttggcttg catgtgtgtg 5880
tgctgagttg cgtctgactg ttatcaaccc catgaatgat agtccaccag gctctactgt 5940
ccatgaaatt ttccagtcaa gaatactgga gtggattgca tttcctactc catttgatta 6000
atttagtgac ttttaaattt ctttttccat attcgggagc ctattcttcc tttttagtct 6060
atactctctt cactcttcag gtctaaggta tcatcgtgtg cttgttagct tgttactttc 6120
tccattatag cttaagcact aacaactgtt caggttggca tgaaattgtg ttctttgtgt 6180
ggcctgtata tttctgttgt gtattagaat ttaccccaag atctcaaaga cccactgaat 6240
cccagccaag atctgtagct actggacaat ttcatttcct ttatcagatt gtgagttatt 6300
actaaagaga cctcattgtg gttacaataa tttggggact gggccaaaac ttccgtgcat 6360
cctgttaaaa tgctccccag aatttctggg gacagaaaaa taggaagaat tcatttccta 6420
atcatgcaga tttctaggaa ttcaaatcca ctgttggttt tatttcaaac cacaaaatta 6480
gcatgccatt aaatactata tataaacagc cactaaatca gatcattatc cattcagctt 6540
ctccttcact tcttctcctc tactttggaa aaaaggtaag aatctcagat ataatttcag 6600
tgtatctgct actcatcttt attttggact aggttaaaat gtagaaagaa cataattgct 6660
taaaatagat cttaaaaata agggtgttta agataaggtt tacactattt tcagcagata 6720
tgttaaaaaa tagaagtgac tataaatact tgataaaaat tatagtgact gcaaatgttt 6780
taggaatata ataagatata ataacagtgg ttgctatttt ctttagcaca agactagtta 6840
acaggctgta ttaaaagatc ttttcttgaa ttaaatattt tcaatttgat taaacctacc 6900
tcagccataa aggcaagcac atttcattta tactatgggg atttgaataa ttattactga 6960
agaagctcta ccaacaaaaa gtttatagag ctatcatatt tagtcaagag ataaagaggg 7020
ttgttaggat atatatgcta tttgaaaggt atttataaaa gaagagtata tttatcaaaa 7080
tttctcaaga acatccaaat ttcaagttta tcatttatct tacaatattt caaaaatatt 7140
aaaatagata catgaaatac agaagtaaat taaagagaaa gtattttact tggtaaaaaa 7200
attctaggtt ggacagagag tgccaggaaa caaaaacaat gaaaaatgtg acctgacagg 7260
aattatagct caaagtatag tagtaagtaa tgaaatggct taaaaattgg tatataaaat 7320
gctagttata aaataaacaa aatgcaataa tatcctccct acatgtaatg aattctaggt 7380
attatgatta tgctcttttt tgaagtcttg acaataaaaa tttttttaga agtttatagg 7440
catcttgaat aaagtgaaac aaattaagaa ttagtatcca tgagaaaaat atagaacaat 7500
tttcctaatt tagtttgaaa atctgggatt gaagatgtgt gtcaagagat gttggtggca 7560
agaacatttt tttttcaaga acttataaaa atgcaacaaa acaaaccatt taatacattt 7620
tggtcaaaat caataatgta ttttatttta tgctccaagg agcataaaat tggggactgg 7680
gcaagagaaa ctgacaccct ggtaaattac caagagataa gtacacagtt actatagtag 7740
aaaataagca tagtgtatga tctctaaaat tatgtgagac aaaggagaga tgacattagg 7800
catgtgggga tgaagactga gtagagaaga aacaatctaa tcagtccaag aaaacatctc 7860
gatcagtgga acaaatagaa gaaatgctaa aatgaaacag aagtcttact ggaaataaaa 7920
gatatgcata agacaaaaat tcatgaaaat cacttagttt agcagagaaa agataaaaat 7980
aaagtatgac cttcttcata tacattgttt gatcatatgc acctcaataa aactgagtct 8040
ccaacagaaa tgaaacatta atattttgtt cactgctcta atcccagaat ctaagcgata 8100
tctggcaata aaaataataa atatatattt tttaataaat gaatcaacca cttaattttt 8160
ctgtaaatat ctgtaacttc tcttctgtct ttccaaaaac actcataagt actgtgaatg 8220
agatgaaaaa gagtgaagta ggatataggc tgttagcaga aaacatctga atggctggca 8280
gtgaaacatt aacttgaaat gtaagattaa tgagtaatag taaattttaa ccttggccat 8340
atgataaaat gttcattaat atttttctag aatacagggc tttttgtttt tgccatgagg 8400
tttgcaggat cttggttccc tgaccaggga tcaaacctgc acaccaggga tcaaacctgc 8460
actcccctgg aagcatggag tcttggacat ttgtattata cactatcttt ggttcctttt 8520
aaagggaagt aattttactt aaataagaaa atagattgac aagtaatacg ctgtttcctc 8580
atcttcccat tcacaggaat cgcggatcgt tgacattgat tattgactag ttattaatag 8640
taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt 8700
acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg 8760
acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat 8820
ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct 8880
attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg 8940
gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg 9000
ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc 9060
caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa 9120
tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc 9180
tatataagca gagctcctcg agatgaaggt cctcattctt gcctgcctgg tggctctcgc 9240
tgcaatgaag tgcctcctgc ttgcggtggg cctggcccta acctgtggca tccaggccaa 9300
gcttatgatc ctgataggca aggtttacac agcacagaac cccagtgccc aggcactggg 9360
cctgggcaaa cataattact gccggaatcc tgatggggat gccaagccct ggtgccacgt 9420
gctgaagaac cgcaggctga cgtgggagta ctgtgatgtg ccctcctgct ccacctgcgg 9480
cctgagacag tacagccagc ctcagtttcg catcaaagga gggctcttcg ccgacatcgc 9540
ctcccacccc tggcaggctg ccatctttgc caagcacagg aggtcgcccg gagagcggtt 9600
cctgtgcggg ggcatactca tcagctcctg ctggattctc tctgccgccc actgcttcca 9660
ggagaggttt ccgccccacc acctgacggt gatcttgggc agaacatacc gggtggtccc 9720
tggcgaggag gagcagaaat ttgaagtcga aaaatacatt gtccataagg aattcgatga 9780
tgacacttac gacaatgaca ttgcgctgct gcagctgaaa tcggattcgt cccgctgtgc 9840
ccaggagagc agcgtggtcc gcactgtgtg ccttcccccg gcggacctgc agctgccgga 9900
ctggacggag tgtgagctct ccggctacgg caagcatgag gccttgtctc ctttctattc 9960
ggagcggctg aaggaggctc atgtcagact gtacccatcc agccgctgca catcacaaca 10020
tttacttaac agaacagtca ccgacaacat gctgtgtgct ggagacactc ggagcggcgg 10080
gccccaggca aacttgcacg acgcctgcca gggcgattcg ggaggccccc tggtgtgtct 10140
gaacgatggc cgcatgactt tggtgggcat catcagctgg ggcctgggct gtggacagaa 10200
ggatgtcccg ggtgtgtaca ccaaggttac caactaccta gactggattc gtgacaacat 10260
gcgaccgtga ctcgaggatc cggacccttc cctattcttg taagtctaaa tttactaact 10320
gtgctgttta acttctgatg tttgtatgat atttgagtaa ttaagagccc tacaaaaaaa 10380
tcaataatga atggttccaa aataagcata gctgagatta atgattctca gcattagtta 10440
taaatagaat aagctggaaa accttcacct cccctccacc accagatctc aatgtctagg 10500
cttacccatg gagattctga ttaactgttc tttctatgta gaagaaactt attgggaaga 10560
aataatataa tggactatga tttaattggt ctgttgagaa tttagatgaa ggggattaag 10620
ttacaataaa gccagaattt aacttgataa tctcatttgg ctaagaataa caaacctaag 10680
aaggtttgct attttctaca attttgaagt tttccttatg cacaattatt tcaccacatg 10740
actcatttca catcttgttt ttgatatatg agcatatgag ggcaaaatac tgaagatgct 10800
tatttcaata ctcagggaaa attttcttgc caaaaggcaa gaattgtata attcattcac 10860
ttattttatt ttttttaatt tttaaggtct aagaggattt caaagtgaat gccccctcct 10920
cacttttggt aagctttagg agattggagg cagactgatc atttttatag ttaatatctt 10980
ttacatttca tcttcctgga taagccccaa tagtagcaat ttctatcagt ataccagcat 11040
tatctgttat atttcaaata atgcaaaact gtatatatat ggtgttgaca gatttgattg 11100
aaagattagt tttaaattta ttttcagtga ttgactgtta tttactgacc tgaaattatg 11160
gttttctttc aattgcctat atccttatta ttgattgtaa tcatttatag aaaaaacaaa 11220
ataatttctt atacttttat gtaaacctgt tagagcttat tttaaagatc aactgcattc 11280
acatttctaa tctagtcatt atgagcttca attgttttat ctcacttaaa atttatatat 11340
tgtcttttaa ttcatgagtc aaaatacaat ctcacagtcc agatatggga cttaaaaggg 11400
gaatagcata tagttttgat attcttaaag atatacatct ttttgtgatc atgattcagc 11460
agacatttta ataaaacaat tccaagtgag ccgacacttg gtcctagagg aatttttata 11520
accttaagat aaggcacagc atggtgtttt tgtaataaga tttcttttat gaaaaagtca 11580
caccaaaatt ggaaatgggg tgagatgaag agttataaca tataactaaa tggacatttg 11640
ttctctattc cacagaattg actgcgactg gaaatatggc aacttttcaa tccttgcatc 11700
atgctactaa gataattttt aaatgagtat acatggaaca aaaaatgaaa ctttattcct 11760
ttatttatat tatgcttttt catcttaatt tgaatttgag tcataaacca tatactttca 11820
aaatgttaat tcaacattag cataaaagtt caattttaac ttggaaatat catgaacata 11880
tcaaattatg tataaaaata atttctggaa ttgtgattat tatttcttta agaatctatt 11940
tcctaaccag tcatttcaat aaattaaccc ttaggcatat ttaagttttc ttgtctttat 12000
tatattttta aaaatgaaat tggtctcttt attgttaact taaatttatc tttgatgtta 12060
aaaatagctg tggaaaatta aaattgaata gaattctttg aattgagttc caaaggatat 12120
caaaaagtga gggaaaagat agggtgagcc tatgctgcat atgtccttag aaagtcttgg 12180
tttatacctg ttacctaagt taaacaatta tacttgttcc tttcactctc gaaagtaccc 12240
agcattggat gttaaatttt atagtcatcc tagacaaaaa aaaaaaaaaa aacaaacaac 12300
tcgcagtttg gaaccagtct gttgttccat gtccagttct aactgctgct tctggacctg 12360
gttagtctcc aagagattcc atttctacat ttataaacag tcaatttaag gtgttttatt 12420
gaagttttaa tgtgaaaagt gcactatatg gtgcatgata ggagttcctg gttgaatctc 12480
atttctgaca tcactgacac cagtgcagca aggactagtg ttacaatcag aaggagctga 12540
gttgtgtaat tttagccatt aatgcccaag agactagaac ttacacaaag ctctaatatc 12600
cattgtctct gtctgtggag taattatttc attgccatga attatctgtc tgtcatatcc 12660
tgcattttta tacatgattc agttcccttc agttcacaca atgacttgtc taatttcatc 12720
atatttctta tctttaaaga aaaattccat ctttgagagt tgttattgtt cagtcactag 12780
tttcctgcat cctccatgtt ttcctcactt caggattaag tgaagccgta cttaggcaca 12840
gtcatgtcca actctttgtg accccatgca ctgcagcatg ccaggcttcc ctgcccttcg 12900
ctctctcctg gagtttgctc agactcatgt agattgagtc ggtgatggta tccaactatc 12960
tcatcaactg ttgtgccctt ctcctcctac cctcagtctt taccagcatc agagtctttc 13020
tcagattctt caggttatta tataacaact atcataaaag gagtatctaa atggctgtgt 13080
ccattatttc acatgttatt ctctctttaa cttgctccaa tcccaatttt atccctatgg 13140
gaactgcttt attgaagatc accaacaact tttattttac taatcgtttt gttttaccca 13200
acctctcagt gagtgttatg aggtagagtt gactatttct tcattttgaa atattacgct 13260
tcatttcatt tgatatccta aagctcataa ggtgtggttt ttctcttaac tcactagaca 13320
cttctttgaa gtctctcttc tggcattttc tccttttcca aaattttaat ggttggagta 13380
ccctagattt tagccttaat ttgtttgatg ttgttcagtt ccattctcag ctcagagctt 13440
ccaactgtat gtctccaaac ttactcgttt tgtaaactcc aaactcatgc actcaactgc 13500
attcttgacc tccacactga attatctaat taatgtccta aatctggcat gaccaagcat 13560
acatttttgt ctgaatccag tccccaactt gctcaaaatt taattaaacg taattcagtt 13620
acaaaggcag ctgatattgt atgcaataga cctgaatggg aacttcacaa aagaagttat 13680
cttaattgtc aataaaaaca tgaaaaatac tctacatcat caatcttcag aaaaatgcaa 13740
attaaaggtg cctaataata tcatgacaca accgtcagaa tgactgaaat gaaaagaatt 13800
gtaatacagt tcagttcagt tcagttactc agtcgtctcc aactctttgt gaccccatga 13860
actgcagcat gacagacctt cctgtccatc accaactccc agagtttact cagactatgt 13920
ccattgagtt gatgatgcca tccaaccatc tcatcctctg tcgtcccctt ctcctcctgc 13980
cctcagtctt tcccagcatc agggtctttt ccaatgagtc agctcttcgc atcaggtggc 14040
taaagtattg gagtttcagc ttcaacatca gtccttctaa ttaacaccca ggactgatct 14100
cttttaggat ggactagttg gatctccttg cagtccaagg gactctcaag agtcttctcc 14160
aacaccacag ttcaaaagca tcaattcctt ggcactcagc tttccttata gtccatgtct 14220
cacatccaca catgactatt ggaaaaacca tagccttgac taggtggacc tttgttgaca 14280
aagtaatgtc tctgcttttt aatatgttgt ctagattggt cataactttc cttccaagaa 14340
gtaattgtct tttaatttca tggctgcagt caccatctgc agtgattttg gagccccaaa 14400
atataaagtc agctgctgtt tccactgttg ccccatctac cccatctatt tgccatgaag 14460
cctcaaatgt gatatctgaa tcacagctct acagtgtggt agctaagtgg tgctgtgtaa 14520
tactctcctc tttcactttc atcaagaggc tctttagttc ctcttcactt tctgccataa 14580
gggtggtgtc atctgcatat ctgaggttat tgatatttct cttggcaatt ttgattccag 14640
tgatgggact ggatgccact atcttagttt tctgaatgtt gagctttaag ccagcctttt 14700
cctgcacttc ttccagccca gtgtttctca tgatgtactc tgcatataaa ttaaataagc 14760
catgtccagt tctaactgtt gtttcctgac ctgcatacag gtttctcaag aggcaagtca 14820
ggtggtctgg tattctcacc tgtttcagaa ttttccacag tttattgtga tccacacagt 14880
caaaggcttt ggcatagcca ataaagcaga aagagatgtt tttctggaac tctcttactt 14940
ttttgatgat ccagtggatg ttggcaattt gatctctggt tcctctgcct tttctaaaac 15000
cagctttaac atctggaagt tcatggttca cgtaatacaa aatgtaatac aaaatgtctg 15060
caaaaacaaa ggaatgaaaa gtaatgctaa aaaatgttaa tatttacaga aatttttata 15120
gtagtaaaga attcacctgc aatacaggag aaccgggtta gatccctggg ttggaagacc 15180
tcctggagaa ggaaatggct acccaatcta gtattcttgt ctggagaagg caagaatgga 15240
cagagaagcc cagcgggcta tggtccatcg ggtcacaaag agtcagaagc taccttgcac 15300
acagcaagca cggtgcgcgc gcgtgcacac acacacacac acacacacac agacacacac 15360
acactctaaa acatttaccc aagcttgtcc aatggaaaat caaaaagcca gcaatttaag 15420
atgacatcag gtaccactgt ccaggtaagc ctcagaacac aatgaccagt aagaagcaaa 15480
gtgccatatg agcaactcga atttttgcaa tgttacctaa gagcttccat ttttataatg 15540
caaaagaatt tcatatgggg aaattgtatt agataaccct gaatgaggag caagatatag 15600
tcaaagtaag atgctctagt actatttttt ataagcatga tttgttcagc caaaggtttt 15660
ttcccatatg gccaatgaac tgaaatatgc agtcctgaga tttgcatata tttctagctg 15720
aaaccaagta aataatatcc tcaagaaaga aatcaataga aaagttggat gaagagtaca 15780
ataaagggac caaaaatatt cagaaataag aactagagga gatattggga aatccctggt 15840
gagtccagtt taggattttg tactttcact gcagttggca tggatataat ccctcactgg 15900
ggaactaaga tcccataagc tgtgttggat tgccaaaaaa ataaatatta agagatatca 15960
ttcatagaat attttaaaga tattttagag aagaggaaat taaggatgtg agaatttgta 16020
ttactttttc aagatactaa agctatttag agatagagct gttactaaaa acttcagttt 16080
cctaaaaatt atttgaagca ctgtttaata aattccaaaa tatagaggaa ggaaaacaaa 16140
atactgagga ttcatataat gattcagatt tagaaacaat ataacacaga attagtgaat 16200
tctgacaaat tattaggtag gagtagatag ttcagcatta ctcgtataga tggagtattt 16260
aatcctttcc atgagattat ccaaatataa taatttcgta tctatgtgaa gtataactat 16320
taagattact ttataaagta aatcaagaac cagagaataa gaaaaatgtt ttgtgaacca 16380
gcagatacta tgaacacata aaactcagaa ccctgattcc taagacacac agctaatcct 16440
gattattctt cctttacatg tgaccataga acttcacaca agttcaagat acatttgttg 16500
agcacatcag tatcagttca gtcactcagt catgtccgaa tctttgtgac cttgtggact 16560
gcagcacgcc aggctttcct gtccaccacc aacccctgga gcttactcaa actcatgtcc 16620
attgagtcag tgatcccatc caaccatctc atcctctgtc atcctcttct cctgccttca 16680
atctttccca gacattggag tcttttccaa tgagtcagat cttcacatta ggtggccaaa 16740
gtataggagt ttcagcttca gcatcaatcc ttccaatgaa tattccttga tgtacccctt 16800
agagtgacaa tatacagcct tgacatactc tttttcctat ttggaaccag tctgttgttc 16860
tatacagatt tctcaggagg caggtaaagt ggtctggtat tcccatctct tgaagaattt 16920
tccacagttt attgtgatcc acacaatcaa aggctttagc gtagtcaata aagcagatgt 16980
ttttctggaa ctctcgtgct tttttgatga tccaatggat gttggcaatt tgatctctgg 17040
ttcctctgcc ttttctaaat ccagcttgaa catctggaag ttcatggtcc acgtactgtt 17100
gaagcctggc ttggagaatt ttgagagtta ttttgctagc atgtgagatg agtgcaatca 17160
tgtgggtgtt tgaacatact ttgtcattgc ttttctttgg gattgtggca gtcctgtggc 17220
cactgctgag ttttccaaat ttgctgacat attgagtgca gcactttcac agcatcacct 17280
tttaagattt gaaatagctc aactggaatt ccatcacctc cactagcttt gttcatagtg 17340
aggctttcta aggccgtttg actttgcatt ccagggtgtc tggctctagg tgagtgatcc 17400
gttgacctgc agcggccgca attcttgaag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt 17460
ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa 17520
tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat 17580
gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca 17640
acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca 17700
cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta 17760
catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt 17820
tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtgttgacgc 17880
cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc 17940
accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc 18000
cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa 18060
ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga 18120
accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgcagcaat 18180
ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca 18240
attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc 18300
ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat 18360
tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag 18420
tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa 18480
gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca 18540
tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc 18600
taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 18660
tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 18720
gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 18780
agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 18840
aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 18900
gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 18960
gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 19020
tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 19080
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 19140
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 19200
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 19260
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 19320
ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 19380
cgcagccgaa cgaccgagag cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg 19440
cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt 19500
acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagtatacac tccgctatcg ctacgtgact 19560
gggtcatggc tgcgccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc 19620
tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga 19680
ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagctgcg gtaaagctca tcagcgtggt 19740
cgtgaagcga ttcacagatg tctgcctgtt catccgcgtc cagctcgttg agtttctcca 19800
gaagcgttaa tgtctggctt ctgataaagc gggccatgtt aagggcggtt ttttcctgtt 19860
tggtcacttg atgcctccgt gtaaggggga atttctgttc atgggggtaa tgataccgat 19920
gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc ggttactgga 19980
acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa aaatcactca 20040
gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta gccagcagca 20100
tcctgcgatg cagatctatt aatacgatac ctgcgtcata attgattatt tgacgtggtt 20160
tgatggcctc cacgcacgtt gtgatatgta gatgataatc attatcactt tacgggtcct 20220
ttccggtgat ccgacaggtt acggggcggc gacctcgcgg gttttcgcta tttatgaaaa 20280
ttttccggtt taaggcgttt ccgttcttct tcgtcataac ttaatgtttt tatttaaaat 20340
accctctgaa aagaaaggaa acgacaggtg ctgaaagcga ggctttttgg cctctgtcgt 20400
ttcctttctc tgtttttgtc cgtggaatga acaatggaag tcaacaaaaa gcagctggct 20460
gacattttcg gtgcgagtat ccgtaccatt cagaactggc aggaacaggg aatgcccgtt 20520
ctgcgaggcg gtggcaaggg taatgaggtg ctttatgact ctgccgccgt cataaaatgg 20580
tatgccgaaa gggatgctga aattgagaac gaaaagctgc gccgggaggt tgaagaactg 20640
cggcaggcca gcgaggcaga tccccagcca ggaactattg agtacgaacg ccatcgactt 20700
acgcgtgcgc aggccgacgc acaggaactg aagaatgcca gagactccgc tgaagtggtg 20760
gtaaccgcat tctgtacttt cgtgctgtcg cggatcgcag gtgaaattgc cagtattctc 20820
gacgggctcc ccctgtcggt gcagcggcgt tttccggaac tggaaaaccg acatgttgat 20880
ttcctgaaac gggatatcat caaagccatg aacaaagcag ccgcgctgga tgaactgata 20940
ccggggttgc tgagtgaata tatcgaacag tcaggataac aggctgcggc attttgtccg 21000
cgccgggctt cgctcactgt tcaggccgga gccacagacc gccgttgaat gggcggatgc 21060
taattactat ctcccgaaag aatccgcata ccaggaaggg cgctgggaaa cactgccctt 21120
tcagcgggcc atcatgaatg cgatgggcag cgactacatc cgtgaggtga atgtggtgaa 21180
gtctgcccgt gtcggttatt ccaaaatgct gctgggtgtt tatgcctact ttatagagca 21240
taagcagcgc aacaccctta tctggttgcc gacggatggt gatgccgaga actttatgaa 21300
aacccacgtt gagccgacta ttcgtgatat tccgtcgctg ctggcgctgg ccccgtggta 21360
tggcaaaaag caccgggtta acacgctcac catgaagcgt ttcactaatg ggcgtggctt 21420
ctggtgcctg ggcggtaaag cggcaaaaaa ctaccgtgaa aagtcggtgg atgtggcggg 21480
ttatgatgaa cttgctgctt ttgatgatga tattgaacag gaaggctctc cgacgttcct 21540
gggtgacaag cgtattgaag gctcggtctg gccaaagtcc atccgtggct ccacgccaaa 21600
agtgagaggc acctgtcaga ttgagcgtgc agccagtgaa tccccgcatt ttatgcgttt 21660
tcatgttgcc tgcccgcatt gcggggagga gcagtatctt aaatttggcg acaaagagac 21720
gccgtttggc ctcaaatgga cgccggatga cccctccagc gtgttttatc tctgcgagca 21780
taatgcatgc gtcatccgcc agcaggagct ggactttact gatgcccgtt agatctcggc 21840
gtatatcaaa tcgcgatcaa caaggccatt catgcaggcc gaaagatttt tttaactata 21900
aacgctgatg gaagcgttta tgcggaagag gtaaagccct tcccgagtaa caaaaaaaca 21960
acagcataaa taacccgctc ttacacattc cagccctgaa aaagggcatc aaattaaacc 22020
acacctatgg tgtatgcatt tatttgcata cattcaatca attgttatct aaggaaatac 22080
ttacatatgg ttcgtgcaaa caaacgcaac gaggctctac gaatcgagag tgcgttgctt 22140
aacaaaatcg caatgcttgg aactgagaag acagcggaag ctgtcggcgt tgataagtcg 22200
cagatcagca ggtggaagag ggactggatt ccaaagttct caatgctgct tgctgttctt 22260
gaatgggggg tcgttgacga cgacatggct cgattggcgc gacaagttgc tgcgattctc 22320
accaataaaa aacgcccggc ggcaaccgag cgttctgaac aaatccagat ggagttctga 22380
ggtcattact ggatctatca acaggagtca ttatgacaaa tacagcaaaa atactcaact 22440
tcggcagagg taactttgcc ggacaggagc gtaatgtggc agatcatgcg cacccgtggc 22500
caggacccaa cgctgcccga gatgcgccgc gtgcggctgc tggagatggc ggacgcgatg 22560
gatatgttct gccaagggtt ggtttgcgca ttcacagttc tccgcaagaa ttgattggct 22620
ccaattcttg gagtggtgaa tccgttagcg aggtgccgcc ggcttccatt caggtcgagg 22680
tggcccggct ccatgcaccg cgacgcaacg cggggaggca gacaaggtat agggcggcgc 22740
ctacaatcca tgccaacccg ttccatgtgc tcgccgaggc ggcataaatc gccgtgacga 22800
tcagcggtcc agtgatcgaa gttaggctgg taagagccgc gagcgatcct tgaagctgtc 22860
cctgatggtc gtcatctacc tgcctggaca gcatggcctg caacgcgggc atcccgatgc 22920
cgccggaagc gagaagaatc ataatgggga aggccatcca gcctcgcgtc gcgaacgcca 22980
gcaagacgta gcccagcgcg tcggccgcca tgccggcgat aatggcctgc ttctcgccga 23040
aacgtttggt ggcgggacca gtgacgaagg cttgagcgag ggcgtgcaag attccgaata 23100
ccgcaagcga caggccgatc atcgtcgcgc tccagcgaaa gcggtcctcg ccgaaaatga 23160
cccagagcgc tgccggcacc tgtcctacga gttgcatgat aaagaagaca gtcataagtg 23220
cggcgacgat agtcatgccc cgcgcccacc ggaaggagct gactgggttg aaggctctca 23280
agggcatcgg 。
以上载体pGEMT/rhPA的基因序列中，于9203－10269位置共1068bp，其中编码356个氨基酸。试验证明其表达的重组产物具有含量高、比活性高的优点，可用于开发人溶血栓药。
本发明第二目的是提出以上载体pGEMT/rhPA的制备方法：
方法包括以下步骤：
1）构建pGEMT/5’P载体：经Sal1与Xho1酶切从载体从中获得8667 bp的5’上游调控序列片段，将8667 bp片段与人工合成的535bp片段连接，并插入纯化的pMEG-T载体片段，连接产物转化DH5α感受态细胞，经挑取细菌克隆并小提质粒，获得pGEMT/5’P载体；
2）构建pGEMT/5’+3’P载体：先以3’下游启动子序列PCR扩增产物克隆pGEMT载体，经酶切，回收4052bp片段，再将回收的4052bp片段连接到经酶切线性化的pGEMT/5’P载体中，连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取细菌克隆并小提质粒，获得pGEMT/5’+3’P载体；
3）构建pGEMT/rhPA载体：先从pUC57质粒载体中以XhoⅠ酶切、回收，取得长度为1063bp的 rhPA片段，再将pGEMT/5’+3’P载体用XhoⅠ酶切线性化，并与rhPA片段连接，转化DH5α感受态细胞，挑取细菌克隆并小提质粒，取得pGEMT/rhPA载体。
本发明体现了以下具体特征：
1）上游5’调控序列应用：编码序列上游的9202 bp启动子序列是表达载体在转基因兔中乳腺特异性表达的重要部分，权利要求1中1－9202 bp的序列扩增获得DNA片段，并连接到rhPA编码序列5’上游，是本发明的内容之一；
2）下游3’调控序列的应用：编码序列下游3’ 的13020bp调控序列是表达载体在转基因兔乳腺特异性表达的另一个重要组成。将10270－23290的13020序列片段连接到编码序列的3’端下游，构建成家兔乳腺特异性表达载体，从而获得大量动物源性重组人组织纤溶酶原激活剂；
3）设计的rhPA功能基因编码序列：设计的编码序列在权利要求1基因序列的9203－10269位置，共1068bp，其中编码356个氨基酸。试验证明其表达的重组产物具有含量高、比活性高的优点，可用于开发人溶血栓药。
本发明构建pGEMT/rhPA载体的方法优点是：
本发明利用动物乳腺生物反应器来生产不仅维持了低成本生产，而且产量高，活性高（可进行翻译后修饰和正确折叠），不需要再复发激活，较天然t-PA具有更高的生物活性和更长的作用时间，更利于开发溶血栓药品。
本发明的有益效果体现在：（1）转基因兔高表达重组人组织纤溶酶原激活剂；（2）获得乳腺高效特异性表达具有生物活性的rhPA转基因兔；（3）生产的成本较细胞培养或工业发酵明显降低，生产流程简单，无需复杂仪器设备。生产过程无污染，产品安全性高，产量高，重组产物可获得翻译后修饰和正确折叠，提高了生物学活性。
发明人构建的乳腺特异性表达rhPA基因表达载体作为外源基因制备转基因兔，获得的乳腺特异性表达rhPA转基因兔的外源基因可传代，后代转基因兔具有与原代相同的生产rhPA的功能。
载体中使用了发明人设计的rhPA基因编码序列，序列中加入了14个氨基酸的的信号肽序列，有利于重组产物分泌至乳腺上皮细胞外，转基因兔产生的rhPA得到有效加工、修饰并能方便地从兔乳汁中收集，从转基因兔乳汁中获得的rhPA溶解人纤维蛋白的活性较现有药品（派通欣）高45－1000倍。该技术可用于大规模制备溶血栓药物，用于人心血病治疗，其生产成本低、安全性高、产物活性高。该发明具有广阔的产业前景和巨大的经济效益。
本发明第三个目的是提出载体pGEMT/rhPA在高效重组人纤溶酶原激活剂制备方法中的应用。
先将pGEMT/rhPA载体经SalI和NotI酶切后取得长度为13782bp的表达载体， 然后将13782bp的表达载体溶解于TE缓冲液稀释至20～30ng/uL，将稀释剂显微注射至兔受精卵雄性原核，经培养后转移至发情兔的输卵管内，至转基因兔出生、成熟；从转基因的成熟母兔的乳汁中提取重组人组织纤溶酶原激活剂rhPA。
可于白色背景上直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
通过实验证明，转基因兔（K34号）乳中表达重组人组织纤溶酶原激活剂有明溶解人纤维蛋白的活性，而且比活性是现有同类药品（派通欣）的45～1000倍。可见，本发明设计出的可延长半衰期，降低系统出血倾向，以提高比活性，这类新药的开发对于保障人类的生命健康具有重要的实际意义。
附图说明
图1为转基因兔生产rhPA的技术路线图。
图2为载体pGEMT/rhPA构建流程图。
图3为出生原代仔兔PCR的整合检测照片。
图4为部分转基因兔后代F1检测照片。
图5为获得表达的K30、K34转基因兔ELISA乳样检测。
图6为rhPA体外活性分析（纤维蛋白平板溶圈法）。
具体实施方式
一、载体构建：
载体构建的技术路线见附图1，乳腺特性表达构件构建的操作步骤如下：
（一）材料
1.1实验材料和仪器
DNA扩增仪（S1000，美国BIO-RAD），DNA电泳仪，台式冷冻高速离心机，小型台式高速离心机（Eppendorf公司，德国），恒温振荡培养箱，重蒸水装置，恒温水浴摇床，隔水式电热恒温培养箱，数码凝胶成像仪（GIS-1000，上海天能科技有限公司），上皿电子天平（FA1604，上海精密天平），PH检测仪（HA405-K2，梅特勒托利多上海公司），制冰机（SIM-F124 日本三洋公司），超净工作台（苏州净化仪器设备厂），真空抽干机（Speed Vac Plus SC110,USA）。
Leica显微镜（Leica公司，德国）和显微操作仪（Eppendorf公司，德国）；拉针仪（Sutter公司，美国）；玻璃毛细管（DCG-10，DC-10型，Sutter公司，美国）；CO2培养箱（Forma Science Inc，美国）；体视显微镜（厦门麦克奥迪公司，中国厦门）；超净工作台（苏州净化仪器设备厂，中国苏州）；小动物手术器械。
1.2 主要试剂
质粒pGEM-T克隆载体购自Promaga公司载体购自Promega公司；高保真DNA聚合酶（Pyrobest DNA polymerase）、各种限制性内切酶、DNA连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司，DH5α菌种为本实验室保存，DNA纯化试剂盒是QIAGEN公司产品；QIAEXII Gel Extration Kit购自上海基因公司，其它试剂为国产，分别购自南京科威公司，上海华美公司，上海生物工程公司等；化学试剂为分析纯，未加说明的均来自美国Sigma公司。
DNA纯化试剂盒（QIAEXII Gel Extration Kit，QIAGEN，Cat. NO. 28704），孕马血清促性腺激素（PMSG）由宁波第二激素厂生产；人绒毛膜促性腺激素（hCG）由上海第一生化药业有限公司生产；M16胚胎培养液、M2显微操作液由实验室自行配制；牛血清白蛋白、液体石腊均来自美国Sigma公司；ECL试剂盒（Amersham bio）；其它国产试剂均为sigma公司产品或国产分析纯（上海化学试剂公司，中国上海）。PCR引物由上海生物工程公司合成，透明质酸酶(SIGMA；Cat. No. H-3506)，蛋白酶K（宝灵曼公司，德国）；其他试剂，均为分析纯。
1.3 试验动物
新西兰白兔，来自江苏南京金陵种兔场。
1.4 PCR引物合成和测序
所有PCR引物设计借助于Primer Premier 5.0 引物设计软件设计完成，由上海英骏生物技术有限公司和上海生物工程技术服务有限公司合成；PCR产物测序由上海英骏生物技术有限公司和上海杰瑞生物技术公司完成。测序序列经DNAStar软件进行DNA序列分析。
1.5 常规分子生物学操作
大肠杆菌感受态细胞的制备，细菌的转化和菌落的筛选，质粒DNA的小量制备，质粒DNA的大规模制备，细菌的保种等参照按金冬雁等译《分子克隆实验指南》第二版操作；限制性内切酶酶切反应、PCR片段分离纯化、PCR产物T载体连接等严格按照试剂或试剂盒说明书进行。
（二）载体构建方法
1.2 .1 rhPA编码序列由DNA合成获得。
1.2.2 PCR扩增获得5’promotor和3’promotor表达调控序列PCR扩增。
5’上游调控区扩增引物：
P5－1：5’-TATGTCGACGTTGACATTGATTATTG-3’
P5－2：5’-GAGGCTCGAGGAGCTCTGCTTATATAGA-3’
PCR反应体系如下：
5×PrimeSTAR Buffer 10 μL
dNTP (2.5mM ) 5 μL
引物：P5-1（50μM） 2 μL
引物：P5-2（50μM） 2 μL
PrimeSTAR HS Taq (2.5U/μL) 1 μL
human genomic DNA 1 μL (10ng)
dH2O up to 50 μL
以山羊基因组为模板，扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性40s，68℃退火延伸4min，扩增33个循环；72℃孵育 5min。
3’下游调控区扩增引物：
P3-1：5’-TATGTCTCGAGACTCGAGGATCCG-3’
P3-2：5’-GAGGCTCATCTAGACAACATATT-3’
PCR反应体系如下：
5×PrimeSTAR Buffer 10 μL
dNTP (2.5mM ) 5 μL
引物:BLG5-a（50μM） 2 μL
引物:BLG5-b（50μM） 2 μL
PrimeSTAR HS Taq (2.5U/μL) 1 μL
Goat genomic DNA 1 μL (10ng)
dH2O up to 50 μL
以山羊基因组DNA(Sasnon)为模板，扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性40s，62℃退40s,72℃延伸7min，扩增33个循环；72℃孵育 10min。
PCR序列克隆入pGEM-T载体并经基因测序验证扩增序列的正确性。
表达载体pGEMT/rhPA构建，如图2所示：
具体步骤如下：
商用pGEMT载体经Sal I、XhoⅠ酶切从pMEG-T载体中获得8667 bp片段，将其连接到经SalI、XhoⅠ酶切并连接的载体片段（3000bp），连接产物转化DH5α感受态细胞。挑取细菌克隆并小提质粒，获得pGEMT/5’P载体。合成535bp（序列：8668－9202）调控序列，并连接于上述8557片段的3’下游，共同组成9202bp的5’调控序列。
应用3’下游调控区扩增引物扩增3’下游启动子序列，PCR扩增产物克隆pGEMT载体（引物及方法见1.2.2）。经XhoⅠ、NotI酶切，回收4052bp片段，XhoⅠ、NotI酶切线性化pGEMT/5’P载体，连接3’启动子序列，转化DH5α感受态细胞，挑取细菌克隆并小提质粒；构建质粒酶切鉴定片段大小与插入方向，并经测序验证序列的正确性。构建质粒命名为pGEMT/5’+3’P。
合成的rhPA编码序列克隆于pUC57质粒载体，经XhoⅠ酶切，回收1063bp片段。
pGEMT/5’+3’P用XhoⅠ酶切线性化，并与长度为1063bp 的rhPA片段连接，转化DH5α感受态细胞，挑取细菌克隆并小提质粒；构建质粒经XboⅠ酶切鉴定大与插入方向，并经测序验证序列的正确性，构建质粒命名为pGEMT/rhPA，其长度为23290bp。
二、转基因兔的制备（参考图2）：
2.1基因准备：
质粒载体pGEMT/rhPA经SalI和NotI酶切，用0.8%琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收DNA纯化试剂盒（QIAGEN公司，UK）回收相应的DNA片段和纯化，回收取得长度为13782bp的表达载体， DNA溶解于TE缓冲液（0.05M Tris, 0.25M EDTA）稀释至20～30ng/uL，用于显微注射。
步骤：限制性内切酶（NotⅠ和SalⅠ），经依次经电泳、从琼脂糖凝胶上切下感兴趣部分、按1：2的体积比加入溶解液、加热并与胶混匀、加入过滤柱、吸附、用洗液清洗2-3次、用重蒸水或TE缓冲液回收，取得适当浓缩的DNA。
通过受精卵原核显微注射法制备转基因兔，获得乳腺特异性表达的转基因兔，并通过培育纯合子获得高表达转基因兔，最终获得乳腺高效特异性表达具有生物活性的重组人纤溶酶原激活剂转基因兔。
供体兔超数排卵
选用5～6月龄新西兰白兔，于18～23℃恒温下饲养，每天于7:00～19:00实行光照。供体母兔皮下注射卵泡刺激素（FSH）连续注射3天（剂量：15IU/次，每日两次），第三天下午注射人绒毛膜促性腺激素（HCG），并与公兔交配。
选成年新西兰母兔，与供体兔同一时间注射HCG，使其为假孕母兔。
取卵
解剖的供体兔输卵管，取下的输卵管，用PBS溶液5～10mL逆行冲卵，在解剖显微镜下检查冲出的胚胎，并移入M16溶液中洗3～4遍，将质量好的受精卵移到含有10% BSA M16培养液的无菌容器中，于37℃、5%二氧化碳条件下培养30～60 min。
2.4 原核显微注射
在垂直拉针仪上制备注射针和持卵针，将卵取出加在预热的M2培养液中，在显微操作仪上将已纯化的目的基因注射入兔受精卵雄性原核。显微注射hrPA外源基因溶解于含5mM Tris、0.25mM EDTA的TE缓冲液，注射DNA浓度3～20ng/μL，每个原核注射2～5pL；原核期显微注射受精卵在M16培养基中体外培养2～3小时，用外径为0.965mm、内径为0.58mm毛细管采集M16培养液中的显微注射受精卵，并转移至同步发情兔输卵管。
输卵管胚胎移植
假孕母兔麻醉后，外科手术切开腹腔，找出卵巢和输卵管，并暴露出输卵管开口，将注射基因后质量较好的存活卵通过输卵管的喇叭口移植到输卵管中，每侧移植5～15枚，将子宫和输卵管回复腹腔，闭合腹腔。
小心照料怀孕兔，待29～31天后，仔兔出生。
转基因兔PCR整合检测
2.6.1 兔耳基因组DNA提取
用苯酚抽提法分离小鼠基因组DNA，方法如下：
①待小鼠3周龄时，剪取长～0.5克兔耳尖皮肤，剪碎加组织裂解液750μl、蛋白酶K10-15μl（20mg/ml），55℃消化过夜。
②离心12000转×5min，取黏稠上清于一洁净Eppendorf离心管，加750μl冰苯酚，摇晃混匀，注意不要剧烈震荡，离心12000转×10min，取上清，并重复一次；
③吸取上层水相，加25：24：1苯酚：氯仿：异戊醇750μl，摇晃混匀，离心12000rmp×10min，取交界面上方液相；
④加体积比为1：1的苯酚和氯仿，合剂量为750μl，摇晃混匀，离心12000转×10min，取交界面上方液相；
⑤加750μl氯仿抽提2次，离心12000转×10min，再取交界面上方液相；
⑥加预冷的无水乙醇900μl，沉淀DNA；
⑦挑取白色DNA沉淀，用70%乙醇洗涤一次，离心，去上清，烘干，加DW30-50μl即可。
转基因兔PCR整合检测
引物设计应用Primer Premier5.0软件，为了提高PCR检测的可靠性，引物的上游引物以Pcmv或5′端调控序列下游部分为模板，下游引物以rhPA为模板的跨接头设计，扩增产物为～550bp。
引物序列如下：
上游：5’-ATGGGCGTGGATAGCGGTTTGAC-3’
下游：5’-CCACCATCAAGGGTCACAGCATCG-3’
PCR反应混合物组成：
组成成分 加入量 终浓度
①10×buffer（含Mg） 5μl 1×
②dNTP(10mM) 1μl 200uM
③permier I(20uM) 1μl 0.4uM
④permier II(20uM) 1μl 0.4uM
⑤Taq(5u/μl) 0.5μl
⑥模板DNA 1μl ~200ng
⑦灭菌蒸馏水 up to 50μL
PCR循环参数(热启动法)：
95℃ 变性5min ；（加聚合酶）；94℃变性45s ，56-61℃复性45s，72℃延伸30s，共20-30个循环；然后72℃延伸10min，最后于4℃保温。
PCR产物于1.4%凝胶中电泳。
PCR产物序列测定：检测阳性的PCR产物送上海基康生物工程有限公司测定序列，应用DNAStar分子生物学分析软件进行序列比较。
如图3所示，将出生原代仔兔进行PCR的整合检测，其中，1-14孔为样品，15孔为DL2000，16-18孔为样品，19-25孔为正常兔1、正常兔2、tw1、tw2、tw3、BLC14/TPA注射片段+正常DNA、BLC14/TPA质粒。1、3、7、9、10、12、16孔呈阳性，标k09、k08、k07、k06、k05、k04、k03。
结论：k09、k08、k07、k06、k05、k04、k03为rhPA转基因兔，其余为非转基因兔。
另外，部分转基因兔后代F1检测PCR的结果如图4所示，其中，1-2孔为k01与正常公兔配种早产兔；3-10孔为k01♀×正常♂配种生，均死；11-16孔为k07♀×正常♂配种生，均死；17-19孔为k09♀×正常♂配种生，均死；20-25孔为DL2000、正常公兔、正常兔、tw、显微注射片度BLC14/TPA、blc14/tpa质粒。4、7、13、15、16、19孔呈阳性。
结论：K09部分后代中携带rhPA外源基因，表明转基因兔可以传代，并在后代中同样可以表达，为大规模生产溶栓药物奠定了基础。
三、转基因兔乳汁中重组人纤溶酶原激活剂检测及活性检测（参考图2）：
3.1 转基因兔乳汁中rhPA ELISA检测
人组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）定量EIA试剂盒购自于上海大唐医学生物技术有限公司。
奶样前期处理：取10000g转基因免的奶样品，4℃离心20min去除上层脂肪后，用1M HCl调PH=4.0，取1000g进行离心30min后，去除下层酪蛋白沉淀，吸取上层乳清用1M NaOH调PH=7.0，然后置于20℃温度环境中保存。
操作方法：
1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
奶样处理：A1为k07未加稀释液，A2为k14未加稀释液，A3为k09未加稀释液（去脂去酪蛋白，同12-3），A4为k09未加稀释液，A5为标准品（30ng/ml），A6为标准品（3.75ng/ml），A7为羊奶加乳样稀释液（去脂去酪蛋白，同12-3），A8为空白。
10000g，4℃离心30min→去除上层脂肪和下层沉淀，—20℃保存。
注：PBS:NaCl 4g
KCl 0.1g
Na2HPO4 0.71g
KH2PO4 0.135g
加超纯水至500ml
乳样稀释液：NaCl 0.73125g
KCl 0.03725g
Tris 0.30275g
PMSF 2Mm(2ml，100mM储液)
加超纯水98ml至100ml
PMSF订购于南京生兴生物技术有限公司分装，原产地Amresco公司，0754货号，5g粉剂，用时溶解于异丙醇中。
图5为应用上述获得表达的K30、K34转基因兔ELISA乳样检测图，A1-A8：（标准品）120ng/ml、 60ng/ml 、30ng/ml 、15ng/ml 、7.5ng/ml、3.75ng/ml 、1.875ng/ml 、0ng/ml；B1－B8：瑞替普酶阳性对照（18ng/ml）、（未脱脂乳样）k13、k14、k20、k22、k23、k27、k30；C1-C8：、k31、k34、k40、k09、正常兔乳、12-3-8流产的BP-21羊乳、12-4-9流产的BP-21羊乳、正常克隆羊乳；D1-D8： k13、k14、k20、k22、k23、k27、k30、k31；E1－E7：k34、k40、k09、正常兔乳、12-3-8日BP-21羊乳、12-4-9日K30、兔乳；E8：PH 7.4 PBS阴性对照。
2011-12-3：
奶样处理：A1-A7为标准品，A8为空白。
B1为k09加乳样稀释液，B2为k09加PBS稀释，B3为k09原乳清，B4为k14加乳样稀释液，B5为k14加PBS稀释，B6为k14未加稀释液，B7为正常羊奶加乳样稀释液，B8为正常羊奶加加PBS稀释。
所有乳样品均10000g，4℃离心30min去除上层脂肪；然后用1M HCl调PH=4.0，再10000g离心，30min，吸取上层乳清，去除下层酪蛋白沉淀，用1M NaOH调PH=7.0，20℃保存待检。
rhPA溶纤维蛋白比活性检测
rhPA溶纤维蛋白比活性检测采用纤维蛋白平板溶圈法（Modified Fibrin Agarose Plate Assay，FAPA），其方法如下：
称取125mg电泳级高强度琼脂糖，加入23ml生理氯化钠溶液，煮沸溶解，60℃水浴平衡，加凝血酶14ul（100IU/ml），纤溶酶原280ul（0.5mg/ml），边加边摇匀，加2.2ml人纤维蛋白原（6mg/ml），不停摇匀，混浊后马上倒平板（直径8cm），水平放置完全凝固后置4℃冰箱至少半小时（应在两天之内使用），待用。将标准品预稀释至1000AU/ml，再进行2倍稀释梯度稀释，使标准曲线各点浓度为1000、500、250、125、62.5AU/ml，将待测样品根据标示量稀释至大约100AU/ml或2ug/ml的浓度，待用。在形成的纤维蛋白平板内打孔（直径2mm），每孔点样10ul，样品和标准品每个稀释度点样两个孔，湿盒（在饭盒内加少量水以保持一定的湿度）水平放置于37℃孵箱24小时。点样平板经过纵横两次量取溶圈直径，以各个稀释度的活性的对数（x）为横坐标，以溶圈直径的平均数（四次量取的数值）的对数为纵坐标（y），采用生物统计软件分析结果。利用统计学软件中的回归分析方法作标准曲线，并求得y=a+bx中的a和b及线性回归系数r值，根据样品的溶圈直径可求得样品的活性。
结论：转基因兔K09、K30、K34乳汁中有重组人组织纤溶酶原激活剂，其表达量为18～3600mg/L。
图6为以纤维蛋白平板溶圈法对rhPA体外活性分析图。活性测定方法参考《生物技术药物安全性评价》第五章，生物技术药物生物活性研究，第二节：五、基因工程溶栓药物生物学活性测定方法。
转基因兔（K34号）乳清中表达产物～1-2ng, 瑞替普酶为45～2880ng，由此估计兔乳汁中表达rhPA溶纤活性是瑞替普酶的45～1000倍。
透明圆圈的直径与溶纤活性成正比，相同直径表示有同样的溶纤效率。
从图6可得到的结论：转基因兔（K09号、K34号、K30号、A13、A06）乳中表达重组人组织纤溶酶原激活剂有明溶解人纤维蛋白的活性，而且比活性是现有同类药品（派通欣）的45～1000倍。
<110>扬州大学
<120>载体pGEMT/rhPA及其构建方法、在高效重组人纤溶酶原激活剂制备中的应用
<160>5
<210>1
<211>23290
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>以上载体pGEMT/rhPA的基因序列中，于9203－10269位置共1068bp，其中编码356个氨基酸
<400>1
tcgactctag agggacagcc cccccccaaa gcccccaggg atgtaattac gtccctcccc 60
cccgagccgg cagcgtgcgg ggacagcccg ggcacgggga aggtggcacg ggatcgcttt 120
cgctaggggc agcagcgagc cgcccggggc tccgctccgg tccggcgctc cccccgcatc 180
cctctgaacg cttctcgctg ctctttgagc ctgcagacac ctggggggat acggggaaaa 240
agctttaggc tgaaagagag atttagaatg acagaatcat agaacggcct gggttgcaaa 300
ggagcacagt gctcatccag atccaacccc ctgctatgtg cagggtcatc aaccagcagc 360
cagcctcctt gggcaacctg ttcagtgcgt caccaccctc tgggggaaaa actgcctcct 420
ccaggctgcc cagagccaca tccagcctgg ccttgaatgc ctgcagggat ggggcatcca 480
catatccaac ccaaacctcc cctgtctcag tgtaaagcca ttcccccttg tcctatcaag 540
ggggagtttg ctgtgacatt gttggtctgg ggtgacacat gtttgccaat tcagtgcatc 600
acggagaggc agatcttggg gataaggaag tgcaggacag catggacgtg ggacatgcag 660
aagataggat agaaggacaa agagcaagtt aaaacccagc atggagagga gcacaaaaag 720
gtgttgaggg ctctgggaca ctctccaagt cacagcgttc agaacagcct taaggataag 780
gccacagaca ctgctggtcc ctgtgtctga gcctgcatgt ttgatggtgt ctggatgcaa 840
gcagaagggg tggaagagct tgcctggaga gatacagctg ggtcagtagg actgggacag 900
gcagctggag aattgccatg tagatgttca tacaatcgtc aaatcatgaa ggctggaaag 960
cctccaagat ccccaagacc aaccccaacc cacccaccgt gcccactggc catgtccctc 1020
agtgccacat ccccacagtt cttcatcacc tccagggacg gtgacccccc cacctccgtg 1080
ggcagctgtg ccactgcagc accgctcttt ggagaaggta aatcttgcta aatccagccc 1140
gaccctcccc tggcacaacg taaggccatt atctctcatc caactccagg acggagtcag 1200
tgaggatggg gctctagagg gacagccccc ccccaaagcc cccagggatg taattacgtc 1260
cctcccccgc taggggcagc agcgagccgc ccggggctcc gctccggtcc ggcgctcccc 1320
ccgcatcccc gagccggcag cgtgcgggga cagcccgggc acggggaagg tggcacggga 1380
tcgctttcct ctgaacgctt ctcgctgctc tttgagcctg cagacacctg gggggatacg 1440
ttgcaaagga gcacagtgct catccagatc caaccccctg ctatgtgcag ggtcatcaac 1500
gggaaaaagc tttaggctga aagagagatt tagaatgaca gaatcataga acggcctggg 1560
cagcagccca ggctgcccag agccacatcc agcctggcct tgaatgcctg cagggatggg 1620
gcatccacag cctccttggg caacctgttc agtgcgtcac caccctctgg gggaaaaact 1680
gcctcctcat atccaaccca aacctcccct gtctcagtgt aaagccattc ccccttgtcc 1740
tatcaagggg gagtttgctg tgacattgtt ggtctggggt gacacatgtt tgccaattca 1800
gtgcatcacg gagaggcaga tcttggggat aaggaagtgc aggacagcat ggacgtggga 1860
catgcaggtg ttgagggctc tgggacactc tccaagtcac agcgttcaga acagccttaa 1920
ggataagaag ataggataga aggacaaaga gcaagttaaa acccagcatg gagaggagca 1980
caaaaaggcc acagacactg ctggtccctg tgtctgagcc tgcatgtttg atggtgtctg 2040
gatgcaagca gaaggggtgg aagagcttgc ctggagagat acagctgggt cagtaggact 2100
gggacaggca gctggagaat tgccatgtag atgttcatac aatcgtcaaa tcatgaaggc 2160
tggaaagcct ccaagatccc caagaccaac cccaacccac ccaccgtgcc cactggccat 2220
gtccctcagt gccacatccc cacagttctt catcacctcc agggacggtg acccccccac 2280
ctccgtgggc agctgtgcca ctgcagcacc gctctttgga gaaggtaaat cttgctaaat 2340
ccagcccgac cctcccctgg cacaacgtaa ggccattatc tctcatccaa ctccaggaac 2400
ggagtcagtg aggatggggc tctagaggat ccctcgacct gcaggtcaac ggatcacaac 2460
aaactggaaa attcttcaag agaagaatac cagaccaccc tacctgcttc ctgagaaatc 2520
tgtttgctgc tcagaagcaa cagttagaac cagacatgga acaacagact ggttccaaat 2580
caggaaagga gtatgtcaag gctgtatatc gtcaccctga ttatttaact tatatgcata 2640
gtacataata caaaatgcca ggctggatga atcgcaagct ggaatcaaga tttctgggag 2700
aaatatcaat aaacgagata caaagataca ccacacttat ggcagaaaac taagaagaac 2760
taaagagcct cttgatgaaa gtgaaagagg agagtgaaaa agccagctta aaacccaaca 2820
ttcaaaatca agatcatcat ttcatggcaa ataaatgggg aaacaatgga aacagtgaga 2880
gactttattt tcttgggctc caaaatcact gcagattgtg actacagcca tgattaaaag 2940
atgcttgctc cttggaagag aagctattac caaactagaa agcatattaa aaagcagaga 3000
cgttactttg ctgactaagt tctgtctagt caaacctatg gtttttccag tagtcatata 3060
tggatgtgag ttgaactata aagaaagctg agcaccaaag aattgatgct tttgaaattt 3120
ggtgttggag aagtctcttg agagtccctt gaacctgcaa ggagatccaa ccagtccatc 3180
ctaaaggaaa tcagtcctga atattcattg gaaggactga tgctgaaatt gaagattaac 3240
gttttggact cacctaatgc agaagagcca actcactaga aaagacccca tgttggcaaa 3300
aattgaagcc aggaagagaa gtgaatgaca gaggatgaga tggttggatg gcatcgttga 3360
ctgaatggac atgagtctga tcaagttccg ggagacagca aaggacaggg ctgcctggtc 3420
tgctgcagtc catggggttg caaagagtcg gtctcaaatg agtaactaaa caacaaccaa 3480
gcagtagaaa aataaataaa atttgtctct gagatctcag tacctctttc tgtgcatatc 3540
cgtctcctgt tattgtactt tgtcttctgc ttgtaataaa gctgtcctgt tagtaaaatc 3600
ccacctctga gtaatataca gagaataaaa gaagggagaa attatgtgca agttctctct 3660
tgtttgggtc ctctgaattc ttttagctat caaaaatgga aggtgattat tgtgcaatgt 3720
catctcctgc ttctcattta aaagattcta cctcagtggg ggctaaaact ccacatttaa 3780
cagtagcaaa aaccaatatt ccatagcttc ttaggaaacc attttttata ctcttgtatg 3840
taattacatt caagctcaaa agcaaagaag tgattctgcg ttggtgaagg cccaaccata 3900
gaaaagagga agaaaatagg ccacatactg tgcttccccc atagctcagt tggtaaagaa 3960
tctacctaca atgcaggagg cctgggcttg atccctgggt aagggagatc ccctggagaa 4020
ggaaatggta acccactcca gtactcttgc ctgtaaatcc catggacgga ggagcctggc 4080
agctacagcc ttggggtggc aagagttgga catgattaac aactaaacca ctgccaccac 4140
tccacatact gagtgctccc cagtggcact agtggtaaag aaccacctgc cggtgcagaa 4200
gacattaaag acactggctc tatccctgct tgggaagtag ggaagatccc ctagagaggg 4260
aaatagcaac ccactccaga attcttgcct ggaaaatccc atgaatgaag actggcgggc 4320
tgtagtaact ggggtcacaa agagttaaac atgatttagc aactaaacat caccacatta 4380
aaaaaattac caccaaaata gtcatattcc aggctaaggg gaataatagc actagtacct 4440
gagagaactt tctcagattc tctgtcaagt tcttccttct ctcatataac cagtagtcta 4500
gtttacctca tcagatatta actactcatc gattctaaat tatctaatta tggggggggg 4560
cactacattg cattatattt tgtgtccatt gactatcact caatttattt ataaaaaatt 4620
catccatgtt gtttctgtga cagtaactca ttcacattaa ttgtaatatc tcattgcatt 4680
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gaacatcaac aataacgtgg ctgagaagct tctttcttta gtatattgtt aaggatttcc 4800
ttgatcaaga ttttacctac ttttctggtc caattggtga gagacagtca taaggaaatg 4860
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aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 18900
gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 18960
gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 19020
tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 19080
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 19140
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 19200
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 19260
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 19320
ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 19380
cgcagccgaa cgaccgagag cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg 19440
cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt 19500
acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagtatacac tccgctatcg ctacgtgact 19560
gggtcatggc tgcgccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc 19620
tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga 19680
ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagctgcg gtaaagctca tcagcgtggt 19740
cgtgaagcga ttcacagatg tctgcctgtt catccgcgtc cagctcgttg agtttctcca 19800
gaagcgttaa tgtctggctt ctgataaagc gggccatgtt aagggcggtt ttttcctgtt 19860
tggtcacttg atgcctccgt gtaaggggga atttctgttc atgggggtaa tgataccgat 19920
gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc ggttactgga 19980
acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa aaatcactca 20040
gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta gccagcagca 20100
tcctgcgatg cagatctatt aatacgatac ctgcgtcata attgattatt tgacgtggtt 20160
tgatggcctc cacgcacgtt gtgatatgta gatgataatc attatcactt tacgggtcct 20220
ttccggtgat ccgacaggtt acggggcggc gacctcgcgg gttttcgcta tttatgaaaa 20280
ttttccggtt taaggcgttt ccgttcttct tcgtcataac ttaatgtttt tatttaaaat 20340
accctctgaa aagaaaggaa acgacaggtg ctgaaagcga ggctttttgg cctctgtcgt 20400
ttcctttctc tgtttttgtc cgtggaatga acaatggaag tcaacaaaaa gcagctggct 20460
gacattttcg gtgcgagtat ccgtaccatt cagaactggc aggaacaggg aatgcccgtt 20520
ctgcgaggcg gtggcaaggg taatgaggtg ctttatgact ctgccgccgt cataaaatgg 20580
tatgccgaaa gggatgctga aattgagaac gaaaagctgc gccgggaggt tgaagaactg 20640
cggcaggcca gcgaggcaga tccccagcca ggaactattg agtacgaacg ccatcgactt 20700
acgcgtgcgc aggccgacgc acaggaactg aagaatgcca gagactccgc tgaagtggtg 20760
gtaaccgcat tctgtacttt cgtgctgtcg cggatcgcag gtgaaattgc cagtattctc 20820
gacgggctcc ccctgtcggt gcagcggcgt tttccggaac tggaaaaccg acatgttgat 20880
ttcctgaaac gggatatcat caaagccatg aacaaagcag ccgcgctgga tgaactgata 20940
ccggggttgc tgagtgaata tatcgaacag tcaggataac aggctgcggc attttgtccg 21000
cgccgggctt cgctcactgt tcaggccgga gccacagacc gccgttgaat gggcggatgc 21060
taattactat ctcccgaaag aatccgcata ccaggaaggg cgctgggaaa cactgccctt 21120
tcagcgggcc atcatgaatg cgatgggcag cgactacatc cgtgaggtga atgtggtgaa 21180
gtctgcccgt gtcggttatt ccaaaatgct gctgggtgtt tatgcctact ttatagagca 21240
taagcagcgc aacaccctta tctggttgcc gacggatggt gatgccgaga actttatgaa 21300
aacccacgtt gagccgacta ttcgtgatat tccgtcgctg ctggcgctgg ccccgtggta 21360
tggcaaaaag caccgggtta acacgctcac catgaagcgt ttcactaatg ggcgtggctt 21420
ctggtgcctg ggcggtaaag cggcaaaaaa ctaccgtgaa aagtcggtgg atgtggcggg 21480
ttatgatgaa cttgctgctt ttgatgatga tattgaacag gaaggctctc cgacgttcct 21540
gggtgacaag cgtattgaag gctcggtctg gccaaagtcc atccgtggct ccacgccaaa 21600
agtgagaggc acctgtcaga ttgagcgtgc agccagtgaa tccccgcatt ttatgcgttt 21660
tcatgttgcc tgcccgcatt gcggggagga gcagtatctt aaatttggcg acaaagagac 21720
gccgtttggc ctcaaatgga cgccggatga cccctccagc gtgttttatc tctgcgagca 21780
taatgcatgc gtcatccgcc agcaggagct ggactttact gatgcccgtt agatctcggc 21840
gtatatcaaa tcgcgatcaa caaggccatt catgcaggcc gaaagatttt tttaactata 21900
aacgctgatg gaagcgttta tgcggaagag gtaaagccct tcccgagtaa caaaaaaaca 21960
acagcataaa taacccgctc ttacacattc cagccctgaa aaagggcatc aaattaaacc 22020
acacctatgg tgtatgcatt tatttgcata cattcaatca attgttatct aaggaaatac 22080
ttacatatgg ttcgtgcaaa caaacgcaac gaggctctac gaatcgagag tgcgttgctt 22140
aacaaaatcg caatgcttgg aactgagaag acagcggaag ctgtcggcgt tgataagtcg 22200
cagatcagca ggtggaagag ggactggatt ccaaagttct caatgctgct tgctgttctt 22260
gaatgggggg tcgttgacga cgacatggct cgattggcgc gacaagttgc tgcgattctc 22320
accaataaaa aacgcccggc ggcaaccgag cgttctgaac aaatccagat ggagttctga 22380
ggtcattact ggatctatca acaggagtca ttatgacaaa tacagcaaaa atactcaact 22440
tcggcagagg taactttgcc ggacaggagc gtaatgtggc agatcatgcg cacccgtggc 22500
caggacccaa cgctgcccga gatgcgccgc gtgcggctgc tggagatggc ggacgcgatg 22560
gatatgttct gccaagggtt ggtttgcgca ttcacagttc tccgcaagaa ttgattggct 22620
ccaattcttg gagtggtgaa tccgttagcg aggtgccgcc ggcttccatt caggtcgagg 22680
tggcccggct ccatgcaccg cgacgcaacg cggggaggca gacaaggtat agggcggcgc 22740
ctacaatcca tgccaacccg ttccatgtgc tcgccgaggc ggcataaatc gccgtgacga 22800
tcagcggtcc agtgatcgaa gttaggctgg taagagccgc gagcgatcct tgaagctgtc 22860
cctgatggtc gtcatctacc tgcctggaca gcatggcctg caacgcgggc atcccgatgc 22920
cgccggaagc gagaagaatc ataatgggga aggccatcca gcctcgcgtc gcgaacgcca 22980
gcaagacgta gcccagcgcg tcggccgcca tgccggcgat aatggcctgc ttctcgccga 23040
aacgtttggt ggcgggacca gtgacgaagg cttgagcgag ggcgtgcaag attccgaata 23100
ccgcaagcga caggccgatc atcgtcgcgc tccagcgaaa gcggtcctcg ccgaaaatga 23160
cccagagcgc tgccggcacc tgtcctacga gttgcatgat aaagaagaca gtcataagtg 23220
cggcgacgat agtcatgccc cgcgcccacc ggaaggagct gactgggttg aaggctctca 23280
agggcatcgg
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>酶切获得8667bp片段和用于酶切pMEG-T载体的引物
<400>2
tatgtcgacg ttgacattga ttattg
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>酶切获得8667 bp片段和用于酶切pMEG-T载体的引物
<400>3
gaggctcgag gagctctgct tatataga
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆pGEMT载体中4052bp片段和对pGEMT/5’P载体进行酶切的引物
<400>4
tatgtctcga gactcgagga tccg
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆pGEMT载体中4052bp片段和对pGEMT/5’P载体进行酶切的引物
<400>5
gaggctcatc tagacaacat att。
机译： 一种在宿主细胞中生产人组织纤溶酶原激活剂（tPA），tPA和DHFR蛋白的表达载体，用该载体方法转化的重组细胞以扩增DNA序列的生产方法，......
机译： 获取多肽的方法，重组载体及其构建方法，获取抗体的方法，确定人体组织中的纤溶酶原激活物抑制剂的方法和试验
机译： 获取多肽的方法，重组载体及其构建方法，获取抗体的方法，确定人体组织中纤溶酶原激活物抑制剂的方法和试验
