松褐天牛球孢白僵菌航天突变株B252及其应用

摘要

本发明公开了松褐天牛球孢白僵菌航天突变株B252及其应用。本发明将球孢白僵菌菌株通过航天诱变筛选获得一株在生长特性以及对天牛致病力等方面发生了较大幅度正向变异的航天突变株B252，其微生物保藏号是CGMCC No.8048。致病力测定和室内防治实验表明，松褐天牛球孢白僵菌航天突变株B252对天牛的致病力以及室内防治效果均显著高于野生球孢白僵菌。本发明进一步提供了松褐天牛球孢白僵菌突变株B252在防治天牛等害虫方面的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及昆虫病原真菌突变体，尤其涉及松褐天牛球孢白僵菌航天 突变株，本发明进一步涉及松褐天牛球孢白僵菌航天突变株在防治天牛中 的应用，属于球孢白僵菌突变株及其应用领域。

背景技术

由松材线虫Bursaphelenchus xylophilus(Steiner&Buhrer)Nickle）引起的 松材线虫病是一种毁灭性松树病害，严重威胁着林业发展。在东亚，该病 主要借助羽化后的松褐天牛(Monochamus alternates Hope)成虫进行自然 传播，在补充营养时传到健康松树上，导致松树死亡。松褐天牛在中国东 至台湾、南至广东、西至西藏、西北至秦岭、北至河北、东北至辽宁均有 分布。因此，切断松材线虫病的传播途径，有效地降低其传播媒介昆虫松 褐墨天牛的种群密度，显得尤为重要。

球孢白僵菌（Beauveria bassiana(Bals.)Vuill.）是中国应用最为广泛 的一种昆虫病原真菌（李增智，樊美珍），国内外学者应用白僵菌防治松 褐天牛做了很多研究（蒲蛰龙，李增智.昆虫真菌学[M].合肥:安徽省科技 出版社，1996:271～361；张玲华，田兴山．微生物空间诱变育种的研究 进展[J]．核农学报，2004，18(4)：294-296；宋满刚，张满贵，缪美锁， 红晓祥，梁虹，罗宝君．我国太空育种成果显著[J]．种子世界，2004，7： 57）。球孢白僵菌和其它昆虫病原真菌一样，作为生物农药，尽管具有 化学农药不可比拟的众多优点，但存在致死害虫的时间较长，同时还存在 受环境影响较大、防治效果不稳定以及自身抗逆性较差等缺点。为了改变 这种境况，通过高效率育种对微生物的生理变异和遗传变异，对昆虫病原 真菌进行改造，航天诱变为选育生物防治优良菌株提供了新途径（农向群， 张泽华，胡攀，高松，张礼生．航天诱变对昆虫病原真菌的生物学效应 [J]．菌物学报，2006，25(4)：674-681），并成功地筛选到优良的金龟子 绿僵菌航天突变体。以获得适合市场需要的产品。

太空环境具有较好的诱变作用，可以产生改善菌种的有利性状、创造 新品种等有益变异，还可发诱发与产量有关的数量性状变异，但很多变异 具有一定的随机性。搭载微生物的主要目的就是通过设计最佳方案筛选那 些产量高、价值大的变异生产菌株（孙继美,丁珊,肖华,等.球孢白 僵菌防治松墨天牛的研究[J].森林病虫通讯,1997(3):16-18），而为了 选择得到性状稳定的新品种或品系，需要进行大量繁重的筛选和检测试验 （刘洪剑,朴春根,汪来发,等.白僵菌和肿腿蜂对松墨天牛幼虫的作用 [J].林业科学,2007,43(5):64–68；张立钦,刘军.松墨天牛优良白僵 菌菌株筛选[J].南京林业大学学报,2000,24(2):33-37）。

从松褐天牛幼虫身体分离的球孢白僵菌进行航天诱变筛选获得在生产 性能或对天牛致病力上有显著提高的突变体，这对于天牛的生物防治将具有 重要的意义。

发明内容

本发明的主要目的是将从松褐天牛幼虫身体分离的球孢白僵菌 （Beauveria bassiana(Bals.)Vuill.）进行航天诱变筛选获得在生产性能或对 天牛致病力上有显著提高的突变株；

本发明的另一目的是将所获得的航天诱变突变株应用于天牛的生物防 治。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一株在生产性能或对天牛致病力上有显著提高的球孢白僵菌 （Beauveria bassiana(Bals.)Vuill.）突变株B252，其微生物保藏号是： CGMCC No.8048；分类命名：球孢白僵菌Beauveria bassiana；保藏时间： 2013年8月20日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学 院微生物研究所。

本发明将球孢白僵菌（Beauveria bassiana(Bals.)Vuill.）菌株cfcc81357 分为两份，一份留在地面常规保存用作对照（CK）；另一份搭载“神舟”8 号飞船历时6d 20h进行航天诱变，航天搭载菌株返回地面后，以未搭载的 原始菌株为对照，比较航天搭载菌株在表形、色素变化、生长速度、产孢量 和致病力等方面的变异性，以筛选获得在生长性能或对天牛致病能力有显 著提高的突变体。

本发明首先通过显微镜观察了航天诱变对于球孢白僵菌的外部形态 的影响，通过观察可以看到原始菌株的分生孢子梗着生在营养菌丝上，产 孢细胞簇生于菌丝、分生孢子梗或膨大的孢囊上，瓶形，颈部明显延长成 产孢轴，轴上具有小齿突，呈“之”字形弯曲，产孢细胞和孢囊常增生，在 分生孢子梗或菌丝上聚成球形至卵形的相当密实的孢子头，分生孢子球形 或近球形。突变菌株B130菌丝一般向同一方向竖直生长，菌丝长且直， 不产生孢子。B159的菌丝形态与原始菌株相比，隔膜明显，且菌丝在每 个隔膜之间都稍有弯曲。突变菌株B252的菌丝与孢子形态与原始菌株无 明显差异。

本发明将球孢白僵菌航天诱变菌株的生长速度与原始菌株进行了对 比，筛选结果发现，航天诱变菌株出现了正负双向变异，但是大多数的菌 株都呈现出负向变异，只有较少的菌株呈现出正向变异，变异幅度较大， 说明航天诱变对球孢白僵菌菌落的生长速度的趋向和幅度均有影响。各菌 落直径平均每天都有2mm以上的增长，属于生长比较迅速的类型。培养 10d后，菌株B252的菌落直径均大于原始菌株。

通过观察航天诱变对于菌丝干重的影响发现，球孢白僵菌突变体菌株 培养过程菌丝干重变化幅度不大，培养4d后，菌丝干重最重的菌株的B252 为0.8391g。

航天诱变对球孢白僵菌菌株产孢量的影响出现了不同趋向、不同幅 度的变异。其中产孢量最多的为菌株B252，其产孢量为2.09×10⁷cfu/mL， 而菌株B130不产孢，通过菌丝形态观察也可以说明其无孢子产生。

本发明进一步考察航天诱变对致病力的影响，接种后各突变体对松 褐天牛幼虫的致病力有所不同,航天诱变对致病力影响较大，出现负向突 变的较多。第4天幼虫开始死亡，突变体B252的致病力相比原始菌株有 显著提高，在致死速度上也快于原始菌株，说明突变体B252对松褐天牛 幼虫具有较强的致病力。

室内防治效果实验表明,B252菌株对天牛的防治效果显著高于球孢 白僵菌野生菌株。

从总体上看，球孢白僵菌经航天诱变后，产生了丰富的性状变异， 只有少数突变株呈现出正向变异作用，航天诱变的负效应大于正效应，对 生长速度、产孢量、致病力等很多性状都表现出不同程度的抑制作用，表 现出了不同的的变异趋向和幅度。生长速度、产孢量和致病力是筛选生物 防治菌株的重要指标，航天诱变使这些特性表现出不同变异趋向和幅度， 证明了航天诱变是非定点的、广泛性的、正负双向性的，且诱变位点多、 诱变率高，所导致的生物体变异有生理性变异也可能有遗传性变异。本发 明通过筛选航天搭载菌株在表形、色素变化、生长速度、产孢量和致病力等 方面的变异性，最终发现航天诱变菌株B252在生长特性以及对天牛致病 力等方面发生了较大幅度的正向变异，是一株具有优异突变性状的菌株， 在天牛的防治等生产和研究中具有广泛的应用前景。

因此，本发明还提供了一种防治天牛的球孢白僵菌微生物制剂，所述 微生物制剂包括：球孢白僵菌B252的孢子粉或发酵液以及制剂载体。

作为参考，本领域技术人员可参考下述方法制备得到球孢白僵菌 B252孢子粉：（1）制备球孢白僵菌B252发酵液；（2）从球孢白僵菌 B252发酵液中回收孢子产物；（3）干燥所回收的球孢白僵菌孢子产物， 即得。

本领域所属技术人员可按照文献中所公开的各种方法制备得到球孢 白僵菌B252发酵液；例如，采用三级培养方法，即：种子培养、二级液 体扩大培养和液体发酵培养，制备得到球孢白僵菌B252发酵液；其中， 在液体发酵培养时,可以采用发酵罐发酵或采用摇瓶培养的方式进行发酵 培养；三级培养所用到的培养基及其培养条件均已在文献中公开，作为参 考，其中，所述的液体发酵培养基的组成成分包括碳源和氮源；所述的碳 源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一种 或多种。所述的氮源包括但不限于硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨或黄豆粉中的 任一种或多种。

本发明进一步提供一种制备防治天牛的球孢白僵菌B252微生物制 剂的方法，该方法包括以下步骤：将球孢白僵菌B252的孢子粉或发酵液 和载体混合在一起，搅拌均匀，粉碎过筛，制备得到相应的微生物制剂， 例如，可以是颗粒制剂、粉剂、可湿性粉剂或微胶囊菌剂等。

其中，所述的载体可以是硅藻土、高岭土、木屑、活性碳、草炭、 农作物秸秆、干燥的农家肥等；此外，本发明的淡紫拟青霉微生物制剂中 还可加入辅料或/和助剂；所述的辅料可以是蟹壳粉或几丁质等；所述的 助剂可以是润湿剂、分散剂或稳定剂等。

附图说明

图1航天诱变球孢白僵菌形态变异与原始菌株菌落形态；A-I: B122，B130，B159，B252，B260，B283，BJ-1，BJ-80，野生型。

图2航天诱变球孢白僵菌突变体的菌丝结构。

图3球孢白僵菌航天突变体生长速度与原始菌株比较。

图4球孢白僵菌航天突变体菌丝干重与原始菌株比较。

图5球孢白僵菌航天突变体产孢量与原始菌株比较。

具体实施方式

通过下列实施例将更具体说明本发明的实施方式，但是应理解所述实 施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应 该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细 节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实验例1 球孢白僵菌航天诱变突变株的筛选及诱变效应的测定实验

1 实验材料及方法

1.1 菌株

球孢白僵菌（Beauveria bassiana(Bals.)Vuill.）(菌株号cfcc81357)系 从江苏省溧水市马尾松树中感染白僵菌的松墨天牛幼虫体表分离纯化获 得。

供试球孢白僵菌（Beauveria bassiana）航天诱变返地后，于本试验室 4℃保存，备用。

1.2 航天搭载

将球孢白僵菌（Beauveria bassiana(Bals.)Vuill.）菌株cfcc81357分 别分为两份，一份留在地面常规保存用作对照（CK）；另一份于2011年 11月1日搭载“神舟”8号飞船，历时6d20h，返回地面后，及时取出材料 低温保存。

1.3 突变体筛选

将经航天诱变处理后的球孢白僵菌菌株和野生型菌株（CK）分别制 成孢子悬浮液（B130为菌丝体），稀释孢子浓度到1×10³cfu/mL，涂布 到PDA平板上（每皿加0.1mL孢子液），25℃恒温培养4-6d后，观察 单菌落大小、形态和正反面颜色，挑选出与野生型菌株（CK）差别较明 显的菌株。

1.4 航天诱变效应的测定

以未搭载的原始菌株为对照，比较航天菌株在表形、色素变化、生长 速度、产孢量和致病力等方面的变异性。

1.4.1 突变菌株的形态和色素变化观察

从已生长好的平板上，用直径为6mm的打孔器切菌落3块于5mL含 0.5‰吐温的溶液中，充分震荡，制成孢子悬浮液。用灭好菌的直径为6mm 的滤纸片蘸满孢子液放在培养皿中央，置于25℃温箱中培养，每个菌株3 皿，观察菌落的形态、颜色。

1.4.2 菌丝及孢子形态观察

将一灭菌盖玻片以45°角斜插在刚接过菌的培养基上，25℃恒温培 养3d后将盖玻片拔出，显微观察并拍照（徐福元,张培,赵菊林等.利 用小蠹虫释传白僵菌技术防治松材线虫病的研究[J].林业科学研究,2000, 13(专):林业科学研究第22卷）。

1.4.3 菌落生长速度测定

用灭菌的直径为6mm的滤纸片蘸满孢子液放在培养皿中央，置于 25℃温箱中培养，以十字交叉法每天测菌落直径，第5天起开始，共测6 天。野生型菌株为对照，重复3次。

1.4.4 菌丝干重测定

250mL锥形瓶装100mL PD培养基，吸取0.2mL孢子悬浮液于每瓶 培养基中，恒温摇床温度为25℃，转速为120r/min。培养4d后，从三角 瓶中倒出所有菌液，离心倒上清，将沉淀倒在滤纸上，60℃烘箱烘干至恒 重，称重。

1.4.5 产孢量测定

用直径为6mm的打孔器切菌落3块于5mL含0.5‰吐温的溶液中， 充分震荡后在显微镜下用血球计数板计数，计算产孢量，设3次重复。

2 结果与分析

2.1 航天诱变对菌落形态和色素变化的影响

在PDA平板上，不同分离菌株表现出的培养特性各不相同，与原始 菌株差异较大。菌落一般呈平绒状或者丛毛状，表面白色或乳白色，有的 逐渐产生淡黄色粉末状孢子，背面为黄褐色，有些有深褐色环状或者沟壑 状线条存在（图1，表1）。

表1 球孢白僵菌航天突变体的菌落形态特征

2.2 菌丝及孢子形态观察

球孢白僵菌航天突变菌株通过显微镜观察，可以看到原始菌株的分生 孢子梗着生在营养菌丝上，产孢细胞簇生于菌丝、分生孢子梗或膨大的孢 囊上，瓶形，颈部明显延长成产孢轴，轴上具有小齿突，呈“之”字形弯 曲，产孢细胞和孢囊常增生，在分生孢子梗或菌丝上聚成球形至卵形的相 当密实的孢子头，分生孢子球形或近球形。突变菌株B130菌丝一般向同 一方向竖直生长，菌丝长且直，不产生孢子。B159的菌丝形态与原始菌 株相比，隔膜明显，且菌丝在每个隔膜之间都稍有弯曲。另外两个突变菌 株B252和B130的菌丝与孢子形态与原始菌株无明显差异(图2)。

经过观察突变株中仅有3株突变株（B130、B159和B252）具有一 定的产孢能力，对这3株突变体进行生长速度、菌丝干重以及产孢子量的 测定。

2.3 航天诱变对生长速度的影响

球孢白僵菌航天诱变菌株的生长速度与原始菌株相比，出现了正负双 向变异，变异幅度较大（图3），说明航天诱变对菌落的生长速度的趋向 和幅度均有影响。各菌落直径平均每天都有2mm以上的增长，属于生长比 较迅速的类型。培养10d后，菌株B252的菌落直径均大于原始菌株；其 中生长速度最快的菌株为B252，菌落直径为4.72cm，生长速度最慢的为 菌株B159，菌落直径为2.67cm。

表2 航天诱变球孢白僵菌生长速度

注：表中数据为平均值±标准差。同一栏内数据后小写字母表示经SPSS检测相互间差异显著(P<0.05)。

2.4 航天诱变对菌丝干重的影响

试验结果见图4，白僵菌突变体菌株培养过程菌丝干重变化幅度不大， 培养4d后，菌丝干重最重的菌株的B252为0.8391g。

2.5 航天诱变对产孢量的影响

经航天诱变后的菌株出现了不同趋向、不同幅度的变异（图5）。其 中产孢量最多的为菌株B252，为2.09×10⁷cfu/mL；菌株B159产孢量很少， 而菌株B130几乎不产孢。

实验例2 球孢白僵菌航天株对松褐天牛幼虫的致病力测定

1.实验方法

在安徽省安庆市大龙山林场采集松褐天牛（Monochamus alternatus  Hope）幼虫，以越冬4龄幼虫为供试材料，室内饲养2d，剔除带机械损伤 和行为不正常个体，选择健康、大小基本一致的幼虫用于生物测定试验

部分菌株孢子稀释至1.0×10⁷cfu/mL^-1浓度的孢子悬浮液,以无菌水 作对照。将松褐天牛幼虫在孢悬液中浸渍15s，然后置于无菌培养皿中让 其自由爬行，使其身体表面无水滴，然后将每头松褐天牛放在直径12mm× 高75mm的指形管中,一试管一头虫,管内装有人工饲料,用浸无菌水的 脱脂棉封口,分别置于25℃环境条件下黑暗培养,每处理30头幼虫;同 时以等量无菌水代替孢子悬浮液作为对照。逐天观察记录天牛幼虫死亡情 况；虫死后保湿培养观察菌丝生长及产孢情况，若虫尸上长出肉眼可见的 菌丝及孢子则计为被感染（僵虫），统计死亡率及僵虫率。

2.实验结果

接种后各突变体对松褐天牛幼虫的致病力有所不同,航天诱变对致 病力影响较大，出现负向突变的较多。第4天幼虫开始死亡，突变体B252 的致病力比原始菌株有显著提高，在致死速度上快于原始菌株，说明突变 体B252对松褐天牛幼虫具有较强的致病力。

表2 球孢白僵菌航天突变体对松褐天牛四龄幼虫的致病力

实验例3 B252菌株防治天牛的应用效果实验

1.试验材料及方法

从林中选取有明显松褐天牛幼虫侵入孔的松木段若干,带回室内,分 为3组,每组10-15段；用筛选出的B252菌株及球孢白僵菌野生菌株（未进 行航天诱变）分别生产孢子粉（3.0×10¹⁰/g）,分别采用在木段表面撒菌粉 以及向侵入孔中注射菌液的两种防治方法进行比较试验。孢子粉用量以均 匀散布在木段上为准，注入侵入孔的菌液浓度为1×10⁷个/ml,每孔1ml （B252菌株和球孢白僵菌野生菌株的用量相等）。对照组不做处理，对 照组与试验组分开放置。40天后,破开木段,逐一检查。

2．实验结果

实验结果见表3。

表3 室内不同菌株和不同方法的防治天牛的应用结果

从实验结果可见，无论是采用撒菌粉法还是注射菌液法，B252菌株 对天牛的致死率均显著高于球孢白僵菌野生菌株。