一种四川省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法

摘要

一种四川省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，本发明包括如下步骤：1）样品DNA提取：对四川各松茸产区的松茸样品进行DNA提取；2）按顺序使用pL281/pS48引物、pDGSL313-1/pS48引物、pDGSL719-2/pS48引物对提取的松茸样品的DNA进行PCR扩增；3）运用QIAxcel全自动DNA分析系统进行产物检测；4）获得四川松茸的产地特征属性DNA指纹图谱。本发明提供一种针对中国四川松茸主产区松茸的地属性DNA指纹图谱的构建方法，以及由此方法得到的松茸的产地属性的DNA指纹图谱。从而能够为残留监控中的问题松茸的四川原产地溯源提供理论参考依据。

说明书

技术领域

本发明涉及中国四川松茸主产区的松茸产地属性的DNA指纹图谱的建立方法，以及由该 方法所得相应的DNA指纹图谱。

背景技术

松茸隶属担子菌门（Basidiomycota）、担子菌纲（Basidiomycetes）、伞菌目（Agaricales）、 口蘑科（Tricholoma）、口蘑属（Tricholoma）^[1]。全球已报道了15个种，我国已记载了5个种 一个变种，即松茸（T.matsutake）、假松茸（T.bakamatsukake）、青岗覃（T.quercicola）、粗壮 口蘑（T.robustum）、黄褐口蘑（T.fulvoeastaneum）和台湾松茸变种（T.matsutake），松茸是一 种外生菌根真菌类，由菌丝体、子实体和孢子组成，本发明所指的松茸是T.matsutake这个品 种，且指可食用的子实体部分，也就是人们在市场上见到的松茸菌。

松茸是一种味道鲜美、口感上乘、气味浓郁独特、营养价值高、具有食疗效果的纯天然食 用菌。目前尚不能人工驯化栽培，基本上都野生菌，所以来自不同分布区域的松茸拥有产地 属性。本发明只针对新鲜松茸，松茸加工制品中，DNA可能发生断裂和降解，且目前多数松 茸加工品不具有产地属性，没有对其进行产地溯源的需要。

日本是松茸的最大消费国，也是最大的进口国。我国松茸主要出口至日本，其中鲜松茸的 出口量占日本进口量的43%，具有巨大的海外贸易价值。

我国松茸的主产区是云南、四川、吉林和黑龙江，其中云南的产量最大，吉林和黑龙江第 二，四川第三。

目前东北生产的鲜松茸从吉林口岸出口，云南、四川和西藏鲜松茸从云南出入境口岸出口， 但有时东北产的松茸也会从云南口岸出口。因此做好松茸的资源保护以及针对性出口管理， 对松茸出口产业事关重大。

中国四川地区的松茸的多分布在甘孜州和凉山州的海拔为3000-4000米的原始森林区。交 通不便，气候寒冷，人烟稀少，多是高山少数名族居住于附近。目前多是由当地高山贫困少 数民族开始对其进行采摘并卖给当地的松茸出口收购商，这已成为这些少数民族特别是藏族 和彝族脱贫致富的主要经济来源。因此，松茸的顺利出口关系到这些少数民族的经济收入， 关系到此地民族的团结和政治稳定。

松茸虽然是纯天然的野生食用菌，但是生长地分散，采摘人员多半是居住于附近的当地 居民——散户，从采撷到出口还要经历很多环节，面对出口国特别是日本苛刻的进口食品贸 易壁垒，检验检疫部门必须对松茸的采摘到出口的全过程进行质量安全控制和溯源管理，尽 可能保证松茸的顺利出口。另外，日本也要求我国提供对日出口的松茸的官方原产地证明。

中国国家质量监督检验检疫总局制定了《出口鲜松茸质量安全控制要求》指出“在强化检 验把关中指出“指导出口企业避免从农残和重金属污染严重的地区收购原料，降低农残和重金 属含量超标的风险”。虽然检验检疫监督管理部门按照溯源管理措施，要求企业对产地进行编 号管理，按照原料来源分产地加工、存储堆放，在报检时必须提供该批出口松茸原料溯源管 理网络图，但实际情况是企业履行得并不严格，这给经出口口岸检验检疫部门检验发现残留 监控不合格的松茸的溯源造成困难，为了保护云南口岸出口的持续性，以及更有效、更有针 对性对某个地区进行松茸质量的管理，管理监管部门除了依靠企业诚信备案登记外，还需要 能识别松茸的产地属性的技术手段，用于区别产地来自云南以及产地来自非云南的松茸货品。

中国整个西南地区的松茸外观相近，气味相同，微有口感上的差异，且不同成熟期松茸子 实体外观会发生变化，受此影响，仅从感官判断不易辨别产地。王明富等研究者就认为中国 西南地区的松茸和日本的松茸即使地理跨度较大，但形态接近，菌丝体不拮抗，属同一品系 的松茸。

以松茸含有的总蛋白以及多糖类进行分析，这些营养物质在松茸的不同成熟期表达量的不 同，受此影响，由此得到的化学分析数据不能用于产地溯源。

相对于感官以及营养成分的分析，遗传物质的特性不会随着菌体生长而发生显著改变，相 对于一个个体，遗传物质从幼到老基本都是稳定的。

但沙涛等认为滇产松茸的IGS1-RFLP与日产松茸的主要类型十分相似，认为滇产的和日 产的松茸可能是同源的。

直到Murata等（2008）创建了并运用这两套引物pDGSL313-1/pS48和pDGSL719-2/pS48， 序列为：pS48：GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC；pDGSL313-1： CGATGTATGTGGCTGTGCCAGTACCAT；pDGSL719-2： TGGGCCGCCCTTGATGGCTCATATT；采用琼脂糖凝胶电泳技术，对日本、北朝鲜、中国 东北省区、中国西南省区、不丹的松茸进行了地理原产地的追溯，开创了利用遗传物质进行 松茸原产地溯源的局面。其中对中国东北省的松茸进行pDGSL719-2/pS48的PCR扩增有PCR 产物，而对中国西南省区的松茸进行pDGSL719-2/pS48的PCR扩增没有PCR产物，这是区 分中国西南省区和东北省区的松茸关键。

琼脂糖凝胶电泳技术电泳方法自身重复性不佳、分辨率低下、操作时间长，操作人员易接 触可能致畸的基因染料，不适宜将来运用于新鲜松茸的溯源检测过程。全自动DNA分析系 统基于全自动毛细管电泳的原理，是一种用样量少，环境友好，操作快速，分辨率高，电泳 条件固定的PCR产物分离系统，所得出的DNA指纹图谱在数据的重复性和稳定性、量化确 定性、以及质量的控制等方面都比琼脂糖凝胶电泳技术得出的DNA指纹图谱更加可靠。

Murata等（2006）设计的pL281/pS48PCR反应系统，序列为pL281：

CTTCACATATACTGGGCATCAGCAAGGG；pS48：

GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC；利用一对引物就可以得到丰富的遗传多态信息， 当时Murata等用于区分是否为T.matsutake类的松茸并未用这套引物进行松茸原产地的追溯。

目前除本发明外无任何学者对中国四川松茸主产区的松茸建立过产地属性的DNA指纹图 谱。

发明内容

本发明的目的是针对出口松茸的原产地溯源管理的现实需求，补填我国目前没有对中国四 川松茸原产地溯源的DNA技术的缺口，提供一种针对中国四川松茸主产区松茸的地属性DNA 指纹图谱的构建方法，以及由此方法得到的松茸的产地属性的DNA指纹图谱。从而能够为残 留监控中的问题松茸的四川原产地溯源提供理论参考依据。

本发明的中国四川松茸产地属性DNA指纹图谱的建立具体包括下列步骤：

一种四川省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，使用以下pL281/pS48引物、 pDGSL313-1/pS48引物、pDGSL719-2/pS48引物的引物序列，引物序列分别为：pL281：

CTTCACATATACTGGGCATCAGCAAGGG；pS48：

GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC；pDGSL313-1：

CGATGTATGTGGCTGTGCCAGTACCAT；pDGSL719-2：

TGGGCCGCCCTTGATGGCTCATATT；其特征在于，包括如下步骤：

1）样品DNA提取：对四川各松茸产区的松茸样品进行DNA提取；

2）按顺序使用pL281/pS48引物、pDGSL313-1/pS48引物、pDGSL719-2/pS48引物对提取的松 茸样品的DNA进行PCR扩增；

3）运用QIAxcel全自动DNA分析系统进行产物检测；

4）获得四川松茸的产地特征属性DNA指纹图谱。

本发明该方法的具体参数为，

1)样品DNA提取：取每个地区的鲜松茸样本菌褶部分500mg，以一个子实体用一个指套放 入一次性PE手套为原则，放入一次性指套中捻碎；必须选择使用非过柱离心的可破碎细胞 壁的商业DNA提取试剂盒提取新鲜样本的DNA；

2)按顺序使用pL281/pS48引物、pDGSL313-1/pS48引物、pDGSL719-2/pS48引物对提取的 松茸样品的DNA进行PCR扩增；其中，PCR的反应体系和检测条件：Premix Taq Version2.0 10μL，上游引物0.5μM，下游引物0.5μM，DNA25-50ng，补ddH₂O至20μL，混合均匀后， 94℃2min；94℃30sec，退火温度30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min。退火温度： pL281/pS48引物体系64℃，pDGSL313-1/pS48引物体系64℃，pDGSL719-2/pS48引物体系 68.5℃；

3）运用QIAxcel全自动DNA分析系统进行产物检测：pDGSL719-2/pS48引物扩增的产物采 用DNA Screening kit卡夹执行AL300程序进行核酸分析；pL281/pS48引物扩增的产物和 pDGSL313-1/pS48引物扩增的产物采用DNA High Resolution kit卡夹执行分辨率适度的 OM500程序进行核酸分析；

4）获得四川省松茸的产地特征属性DNA指纹图谱。

I：本发明按照上述步骤即得到四川省甘孜藏族自治州稻城县日瓦乡亚丁村地区的松茸产地属 性DNA指纹图谱。

II：本发明按照在上述步骤3）后增加如下步骤：

a）单酶限制性酶切体系：10×QuickCut^TM Buffer1μL，QuickCut^TM EcoR V0.1μL，DNA25-50ng， 补ddH₂O至10μL，混合均匀后，37℃10min；

b）再次进行pL281/pS48的PCR反应体系：限制性酶切体系10μL，Premix Taq Version2.09.8μL， 上游引物0.5μM，下游引物0.5μM；

即得到四川省凉山彝族自治州西昌市磨盘乡、四川省甘孜藏族自治州乡城县尼斯乡、四川省 甘孜藏族自治州得荣县奔都乡的松茸产地属性DNA指纹图谱。

III：本发明按照在上述步骤3）后增加如下步骤：

a)混合酶限制性酶切体系：10×QuickCut^TM Buffer1μL，10×QuickCut^TM Buffer1μL， QuickCut^TM EcoR V0.1μL，QuickCut^TM Sph I0.1μL，DNA1μL，补ddH₂O至10μL，混合均匀 后，37℃10min；

b)再次进行pL281/pS48的PCR反应体系：限制性酶切体系10μL，Premix Taq Version2.0 9.8μL，上游引物0.5μM，下游引物0.5μM；

即得到四川省凉山彝族族自治州木里藏族自治县的松茸产地属性DNA指纹图谱。

本发明方法的优点是方法稳定、重现性好、易于掌握，能将中国四川松茸主产区的松茸 溯源至单个产地或者范围较小的片区，可做为中国四川松茸主产区的鲜松茸的原产地溯源的 理论方法之一。

本发明旨在为判别四川松茸的产地提供参考数据，由于四川鲜松茸从云南口岸出口，因 此此方法的推行与运用，可更好的对四川本地产的松茸进行针对性的区域管理提供技术支撑， 从而起到保护云南口岸出口的持续性的作用。

附图说明

图1是实施例1中运用pDGSL719-2/pS48PCR体系得到的四川省甘孜藏族自治州稻城县 日瓦乡亚丁村地区松茸的DNA指纹图谱；

图2是实施例1中运用pDGSL313-1/pS48PCR体系得到的四川省甘孜藏族自治州稻城县 日瓦乡亚丁村地区松茸的DNA指纹图谱；

图3运用pL281/pS48PCR体系得到的四川省甘孜藏族自治州稻城县日瓦乡亚丁村地区松 茸的DNA指纹图谱；

图4是实施例2中运用pDGSL719-2/pS48PCR体系得到的四川省凉山彝族自治州西昌市 磨盘乡地区松茸DNA指纹图谱；

图5是实施例2中运用pDGSL313-1/pS48PCR体系得到的四川省凉山彝族自治州西昌市 磨盘乡地区松茸DNA指纹图谱；

图6是实施例2中运用pL281/pS48PCR体系得到的四川省凉山彝族自治州西昌市磨盘乡 地区松茸DNA指纹图谱；

图7是实施例2中采用限制性酶EcoR V处理样本DNA后再运用pL281/pS48PCR体系得到 的四川省凉山彝族自治州西昌市磨盘乡地区松茸DNA指纹图谱；

图8是实施例3中运用pDGSL719-2/pS48PCR体系得到的四川省甘孜藏族自治州乡城县 尼斯乡地区松茸DNA指纹图谱；

图9是实施例3中运用pDGSL313-1/pS48PCR体系得到的四川省甘孜藏族自治州乡城县 尼斯乡地区松茸DNA指纹图谱；

图10是实施例3中运用pL281/pS48PCR体系得到的四川省甘孜藏族自治州乡城县尼斯乡 地区松茸DNA指纹图谱；

图11是实施例3中采用限制性酶EcoR V处理样本DNA后再运用pL281/pS48PCR体系得到 的四川省甘孜藏族自治州乡城县尼斯乡地区松茸DNA指纹图谱；

图12是实施例4中运用pDGSL719-2/pS48PCR体系得到四川省甘孜藏族自治州得荣县奔 都乡地区松茸DNA指纹图谱；

图13是实施例4中运用pDGSL313-1/pS48PCR体系得到四川省甘孜藏族自治州得荣县奔 都乡地区松茸DNA指纹图谱；

图14是实施例4中运用pL281/pS48PCR体系得到四川省甘孜藏族自治州得荣县奔都乡地 区松茸DNA指纹图谱；

图15是实施例4中采用限制性酶EcoR V处理样本DNA后再运用pL281/pS48PCR体系得 到四川省甘孜藏族自治州得荣县奔都乡地区松茸DNA指纹图谱；

图16是实施例5中运用pDGSL719-2/pS48PCR体系得到四川省凉山彝族族自治州木里 藏族自治县地区松茸DNA指纹图谱；

图17是实施例5中运用pDGSL313-1/pS48PCR体系得到四川省凉山彝族族自治州木里藏 族自治县地区松茸DNA指纹图谱；

图18是实施例5中运用pL281/pS48PCR体系得到四川省凉山彝族族自治州木里藏族自 治县地区松茸DNA指纹图谱；

图19是实施例5中采用限制性酶EcoR V+Sph I混合酶切处理样本DNA后再运用 pL281/pS48PCR体系得到四川省凉山彝族族自治州木里藏族自治县地区松茸DNA指纹图谱。

具体实施方式

实施例1

松茸样本：6个来自四川省甘孜藏族自治州稻城县日瓦乡亚丁村的新鲜松茸子实体。

DNA提取：分别取菌褶部分500mg，以一个子实体用一个指套放入一次性PE手套为原则， 放入一次性指套中捻碎；移入Tissue DNA Purification Kit(promega)的放样孔中，用promega  Maxwell16核酸自动提取仪提取DNA。

按顺序依次进行pDGSL719-2/pS48、pDGSL313-1/pS48、pL281/pS48引物体系扩增，扩 增条件如下：Premix Taq Version2.010μL，上游引物(10mM)1μL，下游引物(10mM)1μL， DNA2μL，补ddH₂O至20μL，混合均匀后，94℃2min；94℃30sec，退火温度30sec，72℃ 1min，30个循环；72℃10min。退火温度：pL281/pS48引物体系64℃，pDGSL313-1/pS48 引物体系64℃，pDGSL719-2/pS48引物体系68.5℃。

pDGSL719-2/pS48引物扩增的产物采用DNA Screening kit（QIAxcel）卡夹执行AL300程序 进行核酸分析；pL281/pS48引物扩增的产物和pDGSL313-1/pS48引物扩增的产物采用DNA  High Resolution kit卡夹（QIAxcel）执行分辨率适度的OM500程序进行核酸分析进行核酸分析。

四川省甘孜藏族自治州稻城县日瓦乡亚丁村松茸经按顺序依次进行pDGSL719-2/pS48、 pDGSL313-1/pS48、pL281/pS48引物体系扩增得到的DNA指纹图谱见图1至图3。

图1图注：M：DNA Size Marker，大小单位为bp；每一个泳道都有的15bp和1000bp为 Alignment Marker，不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条 带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01-06为样品标号。

图1图谱特征：pDGSL719-2/pS48引物扩增无条带。

图2图注：M：DNA Size Marker，大小单位为bp；每一个泳道都有的15bp和1000bp为 Alignment Marker，不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条 带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01-06为样品标号；三 角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。

图2图谱特征：pDGSL313-1/pS48引物扩增具有273bp和60bp条带。

图3图注：M：DNA Size Marker，大小单位为bp；每一个泳道都有的15bp和1000bp为 Alignment Marker，不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条 带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01-06为样品标号；三 角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。

图3图谱特征：pL281/pS48引物扩增无100bp条带，但一定具有155bp和210bp条带。

综合图1至图3的图谱特征即为四川省甘孜藏族自治州稻城县日瓦乡亚丁村松茸的DNA产 地属性的指纹图谱，此组图谱信息将来可为四川省甘孜藏族自治州稻城县日瓦乡亚丁村松茸 的产地溯源提供参考数据。

实施例2

松茸样本：6个来自四川省凉山彝族自治州西昌市磨盘乡的新鲜松茸子实体。

DNA提取：分别取菌褶部分500mg，以一个子实体用一个指套放入一次性PE手套为原则， 放入一次性指套中捻碎；移入Tissue DNA Purification Kit(promega)的放样孔中，用promega  Maxwell16核酸自动提取仪提取DNA，得到模板DNA1。

将提取的DNA进行如下酶切反应：10×QuickCut^TM Buffer（TaKaRa）1μL,，QuickCut^TM  EcoR V（TaKaRa）0.2μL，DNA1μL，补ddH₂O至10μL，混合均匀后，37℃10min，得到 模板DNA2。

以DNA1为模板按顺序依次进行pDGSL719-2/pS48、pDGSL313-1/pS48、pL281/pS48引 物体系扩增，扩增条件如下：Premix Taq Version2.010μL，上游引物(10mM)1μL，下游引 物(10mM)1μL，DNA2μL，补ddH₂O至20μL，混合均匀后，94℃2min；94℃30sec，退 火温度30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min。退火温度：pL281/pS48引物体系64℃， pDGSL313-1/pS48引物体系64℃，pDGSL719-2/pS48引物体系68.5℃。

以DNA2为模板进行pL281/pS48引物体系扩增，扩增条件如下：Premix Taq Version2.0 10μL，上游引物(10mM)1μL，下游引物(10mM)1μL，DNA2μL，补ddH₂O至20μL，混合 均匀后，94℃2min；94℃30sec，退火温度30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min。退 火温度：pL281/pS48引物体系64℃。

pDGSL719-2/pS48引物扩增的产物采用DNA Screening kit（QIAxcel）卡夹执行AL300程序 进行核酸分析；pL281/pS48引物扩增的产物和pDGSL313-1/pS48引物扩增的产物采用DNA  High Resolution kit卡夹（QIAxcel）执行分辨率适度的OM500程序进行核酸分析进行核酸分析。

四川省凉山彝族自治州西昌市磨盘乡松茸经按顺序依次进行pDGSL719-2/pS48、 pDGSL313-1/pS48、pL281/pS48引物体系扩增得到的DNA指纹图谱见图4至图7。

图4图注：M：DNA Size Marker，大小单位为bp；每一个泳道都有的15bp和1000bp为 Alignment Marker，不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条 带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01-06为样品标号。

图4图谱特征：pDGSL719-2/pS48引物扩增无条带。

图5图注：M：DNA Size Marker，大小单位为bp；每一个泳道都有的15bp和1000bp为 Alignment Marker，不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条 带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01-06为样品标号；三 角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。

图5图谱特征：pDGSL313-1/pS48引物扩增具有273bp和60bp条带。[0075]图6图注： DNA Size Marker；每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker，不是PCR的扩增产 物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区 间里，以便准确读出产物大小。三角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带，角 型括符标注的地方某些产地特有的一段区间内的扩增条带系列。

图6图谱特征：pL281/pS48引物扩增无620bp，但一定有100bp和210bp条带，且在210-650 bp间有其他多态性扩增条带，但同一地区样本间无共有性。[0077]图7图注：DNA Size  Marker；每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker，不是PCR的扩增产物，作用是 为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便 准确读出产物大小。

图7图谱特征：经EcoR V酶切+pL281/pS48引物大于250bp以上的片段全部消失。

综合图4至图7的图谱特征即为四川省凉山彝族自治州西昌市磨盘乡的松茸的DNA产地属 性的指纹图谱，此组图谱信息可为将来四川省凉山彝族自治州西昌市磨盘乡松茸的产地溯源 提供参考依据。

实施例3

松茸样本：7个来自四川省甘孜藏族自治州乡城县尼斯乡的新鲜松茸子实体

DNA提取：分别取菌褶部分500mg，以一个子实体用一个指套放入一次性PE手套为原则， 放入一次性指套中捻碎；移入Tissue DNA Purification Kit(promega)的放样孔中，用promega  Maxwell16核酸自动提取仪提取DNA，得到模板DNA1。

将提取的DNA进行如下酶切反应：10×QuickCut^TM Buffer（TaKaRa）1μL,，QuickCut^TM  EcoR V（TaKaRa）0.2μL，DNA1μL，补ddH₂O至10μL，混合均匀后，37℃10min，得到 模板DNA2。

以DNA1为模板按顺序依次进行pDGSL719-2/pS48、pDGSL313-1/pS48、pL281/pS48引 物体系扩增，扩增条件如下：Premix Taq Version2.010μL，上游引物(10mM)1μL，下游引 物(10mM)1μL，DNA2μL，补ddH₂O至20μL，混合均匀后，94℃2min；94℃30sec，退 火温度30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min。退火温度：pL281/pS48引物体系64℃， pDGSL313-1/pS48引物体系64℃，pDGSL719-2/pS48引物体系68.5℃。

以DNA2为模板进行pL281/pS48引物体系扩增，扩增条件如下：Premix Taq Version2.0 10μL，上游引物(10mM)1μL，下游引物(10mM)1μL，DNA2μL，补ddH₂O至20μL，混合 均匀后，94℃2min；94℃30sec，退火温度30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min。退 火温度：pL281/pS48引物体系64℃。

pDGSL719-2/pS48引物扩增的产物采用DNA Screening kit（QIAxcel）卡夹执行AL300程序 进行核酸分析；pL281/pS48引物扩增的产物和pDGSL313-1/pS48引物扩增的产物采用DNA High Resolution kit卡夹（QIAxcel）执行分辨率适度的OM500程序进行核酸分析进行核酸分析。

四川省甘孜藏族自治州乡城县尼斯乡松茸经按顺序依次进行pDGSL719-2/pS48、 pDGSL313-1/pS48、pL281/pS48引物体系扩增得到的DNA指纹图谱见图8至图11。

图8图注：M：DNA Size Marker，大小单位为bp；每一个泳道都有的15bp和1000bp为 Alignment Marker，不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条 带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01-07为样品标号。

图8图谱特征：pDGSL719-2/pS48引物扩增无条带。

图9图注：M：DNA Size Marker，大小单位为bp；每一个泳道都有的15bp和1000bp为 Alignment Marker，不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条 带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01-06为样品标号；三 角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。

图9图谱特征：pDGSL313-1/pS48引物扩增仅有273bp条带。

图10图注：M：DNA Size Marker，大小单位为bp；每一个泳道都有的15bp和1000bp为 Alignment Marker，不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条 带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01-07为样品标号；三 角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。

图10图谱特征：pL281/pS48引物扩增无100bp条带，具有210bp和155bp的条带。

图11图注：M：DNA Size Marker，大小单位为bp；每一个泳道都有的15bp和1000bp为 Alignment Marker，不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条 带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01-07为样品标号。

图11图谱特征：经EcoR V酶切+pL281/pS48引物扩增后始终不会出现100bp的条带，部分 样本大于250bp以上的片段全部消失。

综合图8至图11的图谱特征即为四川省甘孜藏族自治州乡城县尼斯乡松茸的DNA产地属 性的指纹图谱，此组图谱信息可为将来四川省甘孜藏族自治州乡城县尼斯乡松茸的产地溯源 提供参考依据。

实施例4

松茸样本：7个来自四川省甘孜藏族自治州得荣县奔都乡的新鲜松茸子实体

DNA提取：分别取菌褶部分500mg，以一个子实体用一个指套放入一次性PE手套为原则， 放入一次性指套中捻碎；移入Tissue DNA Purification Kit(promega)的放样孔中，用promega  Maxwell16核酸自动提取仪提取DNA，得到模板DNA1。

将提取的DNA进行如下酶切反应：10×QuickCut^TM Buffer（TaKaRa）1μL,，QuickCut^TM  EcoR V（TaKaRa）0.2μL，DNA1μL，补ddH₂O至10μL，混合均匀后，37℃10min，得到 模板DNA2。

以DNA1为模板按顺序依次进行pDGSL719-2/pS48、pDGSL313-1/pS48、pL281/pS48引 物体系扩增，扩增条件如下：Premix Taq Version2.010μL，上游引物(10mM)1μL，下游引 物(10mM)1μL，DNA2μL，补ddH₂O至20μL，混合均匀后，94℃2min；94℃30sec，退 火温度30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min。退火温度：pL281/pS48引物体系64℃， pDGSL313-1/pS48引物体系64℃，pDGSL719-2/pS48引物体系68.5℃。

以DNA2为模板进行pL281/pS48引物体系扩增，扩增条件如下：Premix Taq Version2.0 10μL，上游引物(10mM)1μL，下游引物(10mM)1μL，DNA2μL，补ddH₂O至20μL，混合 均匀后，94℃2min；94℃30sec，退火温度30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min。退 火温度：pL281/pS48引物体系64℃。

pDGSL719-2/pS48引物扩增的产物采用DNA Screening kit（QIAxcel）卡夹执行AL300程序 进行核酸分析；pL281/pS48引物扩增的产物和pDGSL313-1/pS48引物扩增的产物采用DNA High Resolution kit卡夹（QIAxcel）执行分辨率适度的OM500程序进行核酸分析进行核酸分析。

四川省甘孜藏族自治州得荣县奔都乡松茸经按顺序依次进行pDGSL719-2/pS48、 pDGSL313-1/pS48、pL281/pS48引物体系扩增得到的DNA指纹图谱见图12至图15。

图12图注：M：DNA Size Marker，大小单位为bp；每一个泳道都有的15bp和1000bp为 Alignment Marker，不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条 带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01-07为样品标号。

图12图谱特征：pDGSL719-2/pS48引物扩增无条带。

图13图注：M：DNA Size Marker，大小单位为bp；每一个泳道都有的15bp和1000bp为 Alignment Marker，不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条 带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01-06为样品标号；三 角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。

图13图谱特征：pDGSL313-1/pS48引物扩增仅有273bp条带。

图14图注：M：DNA Size Marker，大小单位为bp；每一个泳道都有的15bp和1000bp为 Alignment Marker，不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条 带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01-07为样品标号；三 角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。

图14图谱特征：pL281/pS48引物扩增无100bp条带，具有210bp和155bp的条带。

图15图注：M：DNA Size Marker，大小单位为bp；每一个泳道都有的15bp和1000bp为 Alignment Marker，不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条 带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01-07为样品标号。

图15图谱特征：经EcoR V酶切+pL281/pS48引物扩增后始终不会出现100bp的条带，部分 样本大于250bp以上的片段全部消失。

综合图12至图15的图谱特征即为四川省甘孜藏族自治州得荣县奔都乡松茸的DNA产地属 性的指纹图谱，此组图谱信息可为将来四川省甘孜藏族自治州得荣县奔都乡松茸的产地溯源 提供参考依据。

实施例5

松茸样本：6个来自四川省凉山彝族族自治州木里藏族自治县的新鲜松茸子实体

DNA提取：分别取菌褶部分500mg，以一个子实体用一个指套放入一次性PE手套为原则， 放入一次性指套中捻碎；移入Tissue DNA Purification Kit(promega)的放样孔中，用promega  Maxwell16核酸自动提取仪提取DNA，得到模板DNA1。

将提取的DNA进行如下酶切反应：10×QuickCut^TM Buffer（TaKaRa）1μL,，QuickCut^TM  EcoR V（TaKaRa）0.2μL，DNA1μL，补ddH₂O至10μL，混合均匀后，37℃10min，得到 模板DNA2。

以DNA1为模板按顺序依次进行pDGSL719-2/pS48、pDGSL313-1/pS48、pL281/pS48引 物体系扩增，扩增条件如下：Premix Taq Version2.010μL，上游引物(10mM)1μL，下游引 物(10mM)1μL，DNA2μL，补ddH₂O至20μL，混合均匀后，94℃2min；94℃30sec，退 火温度30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min。退火温度：pL281/pS48引物体系64℃， pDGSL313-1/pS48引物体系64℃，pDGSL719-2/pS48引物体系68.5℃。

以DNA2为模板进行pL281/pS48引物体系扩增，扩增条件如下：Premix Taq Version2.0 10μL，上游引物(10mM)1μL，下游引物(10mM)1μL，DNA2μL，补ddH₂O至20μL，混合 均匀后，94℃2min；94℃30sec，退火温度30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min。退 火温度：pL281/pS48引物体系64℃。

pDGSL719-2/pS48引物扩增的产物采用DNA Screening kit（QIAxcel）卡夹执行AL300程序 进行核酸分析；pL281/pS48引物扩增的产物和pDGSL313-1/pS48引物扩增的产物采用DNA  High Resolution kit卡夹（QIAxcel）执行分辨率适度的OM500程序进行核酸分析进行核酸分析。

四川省凉山彝族族自治州木里藏族自治县松茸经按顺序依次进行pDGSL719-2/pS48、 pDGSL313-1/pS48、pL281/pS48引物体系扩增得到的DNA指纹图谱见图16至图20。

图16图注：M：DNA Size Marker，大小单位为bp；每一个泳道都有的15bp和1000bp为 Alignment Marker，不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条 带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01-07为样品标号。

图16图谱特征：pDGSL719-2/pS48引物扩增无条带。

图17图注：M：DNA Size Marker，大小单位为bp；每一个泳道都有的15bp和1000bp为 Alignment Marker，不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条 带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01-06为样品标号；三 角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。

图17图谱特征：pDGSL313-1/pS48引物扩增仅有273bp条带。

图18图注：M：DNA Size Marker，大小单位为bp；每一个泳道都有的15bp和1000bp为 Alignment Marker，不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条 带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01-07为样品标号。

图18图谱特征：观察小于210bp的条带可将样本归为两种类型：一种为pL281/pS48引物扩 增产物只有210bp和155bp的条带的类型，以下叙述简称类型1；另一种为pL281/pS48引物扩 增产物只有210bp条带的类型，以下叙述简称类型2。

图19图注：M：DNA Size Marker，大小单位为bp；每一个泳道都有的15bp和1000bp为 Alignment Marker，不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条 带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；三角形标注的地方表示 此大小的条带为样品间共有条带。

图19图谱特征：类型1经EcoR V+Sph I混合酶切+pL281/pS48引物扩增，大于620bp 以上的条带全部消失，100bp条带出现；类型2经EcoR V+Sph I混合酶切再进行pL281/pS48 引物扩增，155bp的条带出现，550bp至900bp大条带与酶切前一致，保持不变。

综合图16至图19的图谱特征即为四川省凉山彝族族自治州木里藏族自治县地区松茸的 DNA产地属性的指纹图谱，此组图谱信息可为四川省凉山彝族族自治州木里藏族自治县松茸 的产地溯源提供参考依据。

运用pL281/pS48引物的指纹图谱总结

pL281/pS48引物得到的多态性较高，为了便于理解由此得到的图谱特征，用下述表格进 行总结

表1运用pL281/pS48引物的指纹图谱总结

检索表

总结本发明的5个实施案例的指纹图谱特征，得到如下检索表。此检索表的价值在于： 结合表1的信息和相应的指纹图谱，可较好的为中国四川主产区松茸的产地溯源提供参考依 据，但前提条件是必须按本发明规定的步骤顺序进行实验。

表2中国四川松茸主产区的松茸产地检索表

1.pDGSL719-2/pS48引物扩增有480bp条带或者pDGSL313-1/pS48引物扩增一定具有493bp和360bp 条带——————————————————————————东北居群

1.pDGSL719-2/pS48引物扩增无任何扩增条带—————————————西南居群（2）

2.pDGSL719-2/pS48引物扩增无条带或者pDGSL313-1/pS48引物扩增具有273bp和60bp条带 ———————————————————————————————四川省甘孜藏族自治州稻城县 日瓦乡亚丁村居群、四川省凉山彝族自治州西昌市磨盘乡居群（3）

2.pDGSL719-2/pS48引物扩增无条带或者pDGSL313-1/pS48引物扩增仅有273bp条带 ———————————————————————————————————————————— —————————四川省甘孜藏族自治州乡城县尼斯乡居群、四川省甘孜藏族自治州得荣县奔都乡 居群、四川省凉山彝族族自治州木里藏族自治县居群（4）

3.pL281/pS48引物扩增无100bp条带，但一定具有155bp和210bp条带 ————————————————四川省甘孜藏族自治州稻城县日瓦乡亚丁村居群

3.pL281/pS48引物扩增无620bp，但一定有100bp和210bp条带，且在210-650bp间有其他多态性 扩增条带，但同一地区样本间无共有性；经EcoR V酶切+pL281/pS48引物扩增大于250bp以上的片 段全部消失———————四川省凉山彝族自治州西昌市磨盘乡居群

4.pL281/pS48引物扩增无100bp条带，具有210bp和155bp的条带，经EcoR V酶切+pL281/pS48引 物扩增后始终不会出现100bp的条带，部分样本大于250bp以上的片段全部消失 —————————————————————————————————四川省甘孜藏族自治州乡 城县尼斯乡居群、四川省甘孜藏族自治州得荣县奔都乡居群

4.pL281/pS48引物扩增具有155bp和210bp的条带，经EcoR V酶切后大于620bp以上的条带全部消 失，100bp条带出现—四川省凉山彝族族自治州木里藏族自治县部分居群

4.pL281/pS48引物扩增只有210、900、620bp，无100bp和155bp的样本，经EcoR V+Sph I混合 酶切+pL281/pS48引物体系扩增后，增加155bp的条带，550bp至900bp大条带与酶切前一致，保 持不变———————————四川省凉山彝族族自治州木里藏族自治县地区松茸样本部分居群

结语

上述的本发明的技术方案，是对四川省松茸主产区的松茸的产地属性DNA指纹图谱的建 立方法，虽不涉及引物序列的设计，但是规定了能工作的引物的先后顺序、规定作为产地溯 源的模板DNA的要求、利用限制性内切酶先处理模板DNA再进行多态性PCR扩增以增加区分 度的全新思路、首次拿到诸多纯产地的新鲜样本、采用全自动DNA分析系统得到的直观清晰 和稳定可靠的指纹图谱、由此总结的松茸检索表均是本发明的创新之处。

另外，申请人也对云南省的松茸DNA指纹图谱进行了建立。本发明申请的技术方案同样 适用于其他生产松茸的国家、地区的松茸DNA指纹图谱的建立。