一种茉莉花粉离体萌发液体培养基及用于测定茉莉花粉活力的方法

摘要

本发明公开了一种茉莉花粉离体萌发液体培养基及其用于测定茉莉花粉活力的方法，茉莉离体萌发液体培养基是以蒸馏水为溶剂，其含有组分为100mg/L的H

说明书

 

一、技术领域

    本发明属于生物技术领域，涉及一种茉莉花粉离体萌发液体培养基及测定茉莉花粉活力的方法。

二、背景技术

茉莉（Jasminum sambac Aiton）又名茉莉花、茶叶花，为木樨科素馨属常绿直立或攀援状灌木。茉莉早在1700多年前的汉代就已从亚洲西南部传入我国，最早栽培地在海南及两广和福建的沿海地区，然后渐次北上直到长江流域。因其株型玲珑，枝叶繁茂，叶色如翡翠，花朵似玉铃，且花多期长，香气清香而持久、浓郁而不浊，被世人誉为花树中的珍品、“天下第一香”（董利娟，2001）。茉莉有广泛的用途，具有较高的观赏、茶用和药用价值，茉莉花除直接用于熏制花茶外，还可提取浸膏和精油用于香料工业，是高级日用化妆品香精和优质香皂精的主要原料之一，尤其是配制高级香水香精的重要原料。茉莉花可盆栽或作花篱观赏，也常作襟花佩戴或花篮装饰，一直深受人们的喜爱。目前，国内大面积栽培茉莉的除福建、广东、广西外，还有浙江、台湾、江苏、安徽、江西、湖南、四川等省，主要是用于窨制茉莉花茶和盆栽观赏，具有巨大的经济效益，使得我国成为世界上茉莉花栽培面积和产量最多的国家（董利娟，2001）。由于自然条件下茉莉花通常不结实，长期的无性繁殖使茉莉花种性退化，产量低，抗逆性弱。但各地生产中优良品种较为缺乏，已严重影响了我国茉莉生产的发展。因此，开展优良品种的选育是茉莉研究者的一项重要工作。进行茉莉花粉活力测定的研究，对种质资源保存与创新、优良品种的选育等具有重要的理论和实践意义。

茉莉生殖障碍严重，自然条件下结实率极低或根本不结实。赖明志（1995）发现茉莉花粉的萌发率为3.68%～9.68%，随后报道了用石蜡切片法对其花芽发育进行观察的结果，认为其有性生殖已经退化（赖明志等，1996）；董利娟和张曙光（2001）认为其花粉发芽率在3%左右；曾贞等（2002）也用石蜡切片法对其发育过程进行了解剖学研究，发现形态正常的花粉粒占23.5%（正常与不正常比例为100：324），认为茉莉雄配子体发育大多不正常，雄性育性较低是导致其不结实的主要原因之一。此外，茉莉为两性花，开花后花粉成熟并自花粉囊中散出，即便成熟的花粉粒具有一定的活力，但其活力仍然会随生理状态、环境及时间的推移等发生一定的变化。因此，了解茉莉开花后花粉的活力状况，对茉莉杂交体系的建立以及茉莉种质创新的研究都具有十分重要的意义。

目前，花粉活力测定的方法主要有形态观察法、染色法、离体萌发法等。形态观察法是依据花粉外形判断活力，不育花粉在生长过程中由于受到某些因素的影响，发育不完全或不良而常呈畸形，而正常花粉有规则的外形。虽然根据形态可以鉴别花粉活力，但正常花粉粒在贮藏过程中活力可能丧失，而形态并不发生明显变化；也有部分花粉虽然外形正常，但生理功能较差，从而使得花粉粒形态观察法在鉴别花粉活力时有一定的误差。染色法是通过使用染色剂对花粉粒进行染色，依据颜色变化判断花粉活力的高低。常用的染色试剂有碘-碘化钾（I₂-KI）溶液和氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液等。由于茉莉花粉本身呈色较深，实验发现染色法的效果并不理想，实验重复性较差，会造成很大的实验误差，不能准确测定花粉的实际活力高低。石蜡切片法在研究花粉发育进程和特性上具有非常直观的优点，但也只能依据形态判断花粉活力，和实际活力之间往往也存在一定的差距；而且如上所述，不同的研究报道之间差距甚大。

花粉离体萌发与花粉管显微观测的结果较为稳定，更能反应花粉的发育状况和实际活力，被认为是效果最好、最接近原始结果的方法（赵宏波等，2007）。但花粉离体萌发需要适宜的培养基，否则也难以取得理想的效果。不同植物花粉萌发需要的培养基种类和浓度不同，往往要对基本培养基进行筛选或改良，必要时还需在此基础上添加一些促进花粉萌发的元素或物质，如Ca²⁺、K²⁺、PEG、糖等。近年来，人们对植物花粉离体萌发和花粉管生长进行了较多研究。张碧玉（1983）报道适宜浓度的蔗糖能促进花粉的萌发，王四清等（1993）和赵宏波等（2005）认为PEG对菊花和梅花花粉离体萌发生长具有显著促进作用；牛东玲等（2004）报道了肉苁蓉花粉离体萌发的适宜培养基，陈和明等（2006）研究了黄藤花粉离体萌发条件及低温对花粉活力的影响。刘自刚等（2011）报道了黄芩花粉的离体萌发，发现BK培养基添加一定浓度的蔗糖和PEG可以使花粉萌发生长良好。然而，关于茉莉花粉离体萌发与花粉管生长的研究国内外尚未见报道。

与其他作物花粉离体萌发液体培养基相比，本发明所涉及的茉莉花粉离体萌发液体培养基虽以BK培养基为基本培养基，但进行了适当改良（提高了Ca²⁺的浓度并相应降低了Mg²⁺的浓度），且同时对添加的蔗糖和PEG的浓度、培养基的PH值、培养时花药的取样时间、培养的温度和光照强度、培养时间等影响萌发的因素全部进行了筛选和优化组合，从而更加适合于茉莉花粉的离体萌发和花粉管的正常生长，也更加有利于茉莉花粉活力的鉴定。

三、发明内容

技术问题  本发明的目的是提供一种茉莉花粉离体萌发液体培养基及其用于测定茉莉花粉活力的方法，首先筛选、改良培养基，优化培养条件，解决茉莉花粉离体萌发率低问题，使得茉莉花粉的萌发率大幅度提高，从而提供可靠、有效的测定茉莉花粉的活力方法。

技术方案 为了实现上述任务，本发明是通过以下技术方案得以实现：

1）一种茉莉花粉离体萌发液体培养基，其特征在于，制得的该茉莉花粉离体萌发液体培养基是以蒸馏水为溶剂，其成分含有100mg/L的H₃BO₃、100mg/L的KNO₃、150mg/L的MgSO₄·7H₂O、350mg/L的Ca(NO₃)₂·4H₂O、80g/L的蔗糖以及120g/L的PEG4000，pH值为6.0；

2）上述茉莉花粉离体萌发液体培养基用于测定茉莉花粉活力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

①花粉采集

选取长势健壮、发育正常、无病虫害的茉莉植株，在盛花期于上午8:00?9:00选取含苞待放的花朵，连同一段长10～20cm枝条及叶片一同采下，迅速置入盛有清水的三角瓶中，带回实验室后拨开花瓣，用镊子取下花药平摊于硫酸纸上，置35°C烘箱中1?2h，促花粉囊失水破裂散粉，将花粉收集起来待用；

②花粉离体萌发

取上述茉莉花粉离体萌发液体培养基，滴3?5滴在载玻片中间部位并摊薄，用毛笔蘸取适量茉莉花粉均匀撒在液体培养基表面，将载玻片置于底部垫有1层浸透水的滤纸的培养皿中，并在载玻片两侧各放置一个大小适中浸透水的脱脂棉球保湿，盖上培养皿盖子后放入培养箱内光照培养，培养温度为25℃?30℃，光照强度为35?50 μmol·m^-2·s^-1；花粉离体萌发培养30min后，部分花粉开始启动萌发，花粉萌发孔膨大；

③花粉管生长及花粉活力的测定

萌发后的花粉管长度超过花粉粒直径后，花粉管开始快速生长；离体培养4h后，进行花粉萌发率统计和花粉管长度测量；以花粉管长度大于花粉直径为花粉萌发标准，在显微镜下随机观察，每处理重复3次以上，每重复随机观察3?5个视野，每视野观察花粉数不少于40粒，统计花粉萌发率以反映有活力的花粉所占比例；同时，用显微测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量10?20个花粉管，每处理共测量100个花粉管，计算花粉管长度平均值，花粉离体萌发花粉管生长情况即可反映花粉粒发育是否正常及其生理状况的优劣，以反映花粉活力大小。

 

有益效果  本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益的技术效果：

1、茉莉花粉在本发明提供的茉莉花粉离体萌发液体培养基上，温度25℃?30℃、光照强度35?50 μmol·m^-2·s^-1条件下培养，茉莉花粉萌发最好，花粉管也能得到较好生长；且茉莉花粉管生长较直，便于观察测量。茉莉花粉离体萌发液体培养基与其他作物花粉离体萌发液体培养基成份上相比，虽以BK培养基为基本培养基，但对其进行了一定的改良，适当提高了Ca²⁺的含量并相应降低了Mg²⁺的含量，且对培养基上添加的蔗糖和PEG的浓度、培养基的PH值、取样时间、培养温度和光照强度等影响花粉培养的条件全部进行了筛选和优化组合。

2、本发明通过试验得出：在上午8:00?9:00收集茉莉花粉，在PH为6.0的改良BK液体培养基（成分为100mg/L的H₃BO₃、100mg/L的KNO₃、150mg/L的MgSO₄·7H₂O、350mg/L的Ca(NO₃)₂·4H₂O）上，添加80 g/L蔗糖和120g/L PEG4000后，于25°C?30°C温度、35?50 μmol·m^-2·s^-1光照强度下离体培养3?4h后，测量茉莉花粉萌发率（最大为59.7%）和花粉管的平均长度（0.55mm），能够稳定有效的反映茉莉花粉的活力状况，直观地证明了本发明的真实性和有效性（具体实验结果参见图2，其中，A：离体培养0.5h的花粉，部分花粉的萌发孔膨大，开始启动萌发，此时萌发率和花粉管长度为0；B：培养2h的花粉及生长的花粉管，萌发率为18.8%，花粉管长度为0.09mm，但部分花粉仍在萌发中，其花粉管长度尚不及花粉粒直径，达不到萌发标准，故仍需继续进行培养；C：培养4h的花粉粒及生长正常的完整花粉管，此时萌发率达到最高（59.7%）且花粉管仍然保持较直（长度为0.55mm），便于观察与测量；D：培养6h后的花粉，此时萌发率开始下降，而且很多花粉管因生长过长（>10mm）而出现扭曲、互相盘绕现象，同时部分花粉管出现末端膨大、降解等异常现象，均不利于观测和比较）。

3、与原有的鉴定方法如石蜡切片、形态观察等相比，本发明利用该茉莉花粉离体萌发液体培养基与花粉管生长显微观测技术测定花粉活力的测定结果更加稳定可靠，花粉萌发率反应有活力花粉所占比例，花粉管生长的观察与测量反应花粉粒发育是否正常及生理状况的优劣，为茉莉花粉活力的测定提供了一种更加有效、可靠的方法。经筛选、改良、优化组合和条件后，茉莉花粉的萌发率最大可接近60%，约是原有文献报道中最大值(23.5%)的3倍、未改良的BK培养基的2倍。

4、在本发明基础上，可以筛选出活力较高的茉莉花粉进行茉莉的人工授粉和杂交，使通过有性途径开展茉莉的种质创新成为可能。

 

四、附图说明

图1为茉莉花粉离体培养所用器皿及摆放示意图（左边是培养皿、载玻片、铺在载玻片下面的1层浸透水的滤纸、摆在载玻片两侧的2个浸透水的脱脂棉球的摆放方法示意图，右边为培养皿的盖子）

图2为培养不同时间的花粉萌发和花粉管生长情况；其中，A：离体培养0.5h的花粉，部分花粉的萌发孔膨大，开始启动萌发，此时萌发率和花粉管长度为0；B：培养2h的花粉及生长的花粉管，萌发率为18.8%，花粉管长度为0.09mm，但部分花粉仍在萌发中，其花粉管长度尚不及花粉粒直径，达不到萌发标准，故仍需继续进行培养；C：培养4h的花粉粒及生长正常的完整花粉管，此时萌发率达到最高（59.7%）且花粉管仍然保持较直（长度为0.55mm），便于观察与测量；D：培养6h后的花粉，此时萌发率开始下降，而且很多花粉管因生长过长（>10mm）而出现扭曲、互相盘绕现象，同时部分花粉管出现末端膨大、降解等异常现象，均不利于观测和比较。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

五、具体实施方式

按照本发明的技术方案，首先制备茉莉花粉离体萌发液体培养基，该茉莉花粉离体萌发液体培养基是以蒸馏水为溶剂，其中含有100mg/L的H₃BO₃、100mg/L的KNO₃、350mg/L的Ca(NO₃)₂·4H₂O、150mg/L的MgSO₄·7H₂O、80g/L的蔗糖以及120g/L的PEG4000，pH值为6.0；

在确定茉莉花粉离体萌发液体培养基的基础上，利用该茉莉花粉离体萌发液体培养基对茉莉花粉进行离体培养，测定花粉的萌发率和花粉管的生长情况，能够可靠、有效的测定茉莉花粉活力。

以下是发明人给出的实施例，该实施例是本发明较优的例子，主要用于进一步解释和理解本发明，本发明不限于该实施例。

1、茉莉花粉的采集

茉莉花粉为2012年7月上旬采自江苏省农业科学院茉莉种质资源圃多年生茉莉群体。采集方法为：选取长势健壮、发育正常、无病虫害的茉莉植株，在盛花期分别于上午（8:00?9:00）、中午（12:00?13:00）和下午（17:00?18:00）选取含苞待放的花朵，连同一段长10～20cm枝条及叶片一同采下，迅速置入盛有清水的三角瓶中，带回实验室后拨开花瓣，用镊子取下花药平摊于硫酸纸上，置35℃烘箱中1?2h，促花粉囊失水破裂散粉，将花粉分别收集起来待用。

2、花粉离体萌发培养条件的筛选

2. 1花粉离体萌发培养基的筛选

培养基种类对植物花粉离体萌发有较大影响，不同植物花粉萌发的适宜培养基不同。设置5种不同成分的基本培养基进行筛选，分别为：

（1）ME₃培养基（成分为MgSO₄·7H₂O 370mg/L、KNO₃ 950mg/L、KH₂PO₄ 85mg/L、CaCl₂·2H₂O 880mg/L、NH₄NO₃ 412.5mg/L、KCl 175mg/L、H₃BO₃ 50mg/L、Na₂EDTA 7.45mg/L、FeSO₄·7H₂O 0.025mg/L、KI 0.83mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、VB₁ 1.0mg/L、VB₆ 1.0mg/L）；（2）BK培养基（成分为：H₃BO₃ 100mg/L、KNO₃ 100mg/L、MgSO₄·7H₂O 200mg/L、Ca(NO₃)₂·4H₂O 300mg/L）；（3）改良BK培养基（为增加Ca²⁺含量调整Ca(NO₃)₂·4H₂O浓度为350mg/L，同时为相应降低总离子浓度使MgSO₄·7H₂O的含量调整为150mg/L，其他成分同BK不变）；（4）100 g/L的蔗糖溶液；（5）150g/L的PEG4000溶液；以蒸馏水培养作为对照（CK）。

将花粉分别以相同的光照、温度条件下在上述6种培养基上培养，分析基本培养基对花粉离体萌发和花粉管生长的影响；花粉的萌发率和花粉管的长度的测量方法为：

以花粉管长度大于花粉直径为花粉萌发标准，在显微镜下随机观察，每处理重复3次以上，每重复随机观察3?5个视野，每视野观察花粉数不少于40粒，统计花粉萌发率以反映有活力的花粉所占比例；同时，用显微测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量10?20个花粉管，每处理共测量不少于100个花粉管，计算其平均值。

结果见表1。从表1可以发现，茉莉花粉在单一成分的蔗糖、PEG、蒸馏水中均不能正常萌发，在ME₃培养基上的萌发率低于10%，在BK培养基上虽可达到20%，但以改良后的BK培养基萌发效果最好，萌发率最高（30.1%），比BK培养基（20.8%）高44.7%，花粉管长度最大（0.29mm），比BK培养基（0.21mm）高38.1%，均显著高于其他培养基。同时，在相同培养基上，均以上午8:00?9:00所取花粉表现最好，故以该时间段为茉莉花粉样品最佳采集时间，后续实验均以该时间点所取样品和改良BK培养基（成分为100mg/L的H₃BO₃、100mg/L的KNO₃、150mg/L的MgSO₄·7H₂O、350mg/L的Ca(NO₃)₂·4H₂O）为前提条件开展。

表1 培养基和取样时间对茉莉花粉萌发的影响

注：不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）；- 表示未观察到花粉正常萌发

2. 2花粉离体萌发条件的筛选

在其他条件相同的情况下，进行单一因素试验，分别设置蔗糖浓度（40、80、120、160、200 g/L 5个处理）、PEG浓度（40、80、120、160、200 g/L 5个处理）、PH值（5.0、5.5、6.0、6.5计4个处理）、培养温度（20、25、30、35、40℃ 5个处理）、培养时间（0.5、1、2、3、4、6h共6个处理）、光照条件（黑暗培养和35?50 μmol·m^-2·s^-1光照培养2个处理）逐一进行培养条件的筛选和优化。

表2  培养条件对茉莉花粉萌发和花粉管生长的影响

注：不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）

试验结果见表2，从表2可以看出：

培养基中加入不同浓度的蔗糖萌发效果不同，40 g/L的低浓度蔗糖没有明显促进作用，120 g/L及以上的高浓度有明显的抑制效果，故确定最佳的蔗糖浓度为80g/L；

培养基中加入不同浓度的PEG4000，均可明显提高茉莉花粉萌发率和促进花粉管生长，在低浓度范围内（≤120），萌发率随PEG浓度的增加而增加，但浓度较高后（≥160）花粉萌发同样受到抑制，使萌发率出现下降并出现花粉管破裂现象，故确定最佳的PEG浓度为120g/L；

PH值变化对茉莉花粉萌发和花粉管生长均有显著影响，PΗ值在5.0?6.0范围内时，花粉萌发率和花粉管长度随PΗ的升高而增加，但在PH值大于6.0以上时，开始迅速下降，表明培养基H⁺浓度过高或过低均显著抑制花粉萌发生长，故最佳PH值确定为6.0；

培养温度对茉莉花粉萌发和花粉管生长具有显著影响，在20°C?30°C范围，萌发率随温度的升高而增大，但20°C较低温度时花粉管生长过慢，在较高温度（≥35°C）时，花粉管生长过快，易发生扭曲、盘绕现象，影响观察和测量，而40°C高温则抑制生长并导致生长异常，故最佳培养温度确定为25°C?30°C；

培养时间不同，对萌发效果和活力观测的影响也较大，培养0.5h仅有少数花粉粒开始启动萌发，出现萌发孔膨大现象，至1h时部分花粉管长度大于花粉粒直径，达到萌发标准，但萌发率太低，且花粉管长度总体上都太短，不适合作为评价标准，2h时虽少数花粉管长度较大，但仍有部分花粉因萌发较晚而花粉管长度不够，仍需继续培养生长，培养6h后，发现萌发率开始下降，很多花粉管因太长（>10mm）而出现扭曲、互相盘绕现象，而且部分花粉管发生末端膨大、破裂等异常现象，均不适宜观测，故培养时间以3?4h为最佳（此时花粉萌发率分别为39.1和42.4，花粉管平均长度分别为0.32mm和0.43mm）；

光照对茉莉花粉萌发影响显著，黑暗培养下不能正常萌发且花粉管生长缓慢，故光照条件以35?50 μmol·m^-2·s^-1为宜。

综合上述研究结果，可以得出：在上午8:00?9:00收集茉莉花粉，在PH为6.0的改良BK液体培养基（成分为100mg/L的H₃BO₃、100mg/L的KNO₃、150mg/L的MgSO₄·7H₂O、350mg/L的Ca(NO₃)₂·4H₂O）上，添加80 g/L蔗糖和120g/L PEG4000后，于25°C?30°C温度、35?50 μmol·m^-2·s^-1光照强度下离体培养3?4h后，测量茉莉花粉萌发率最大（59.7%，约是BK培养基的3倍，改良BK培养基的2倍，也是已有报道的2倍多）和花粉管的平均长度（0.55mm），能够最大限度反映茉莉花粉的活力状况，直观地证明了本发明的真实性和有效性（具体实验结果参见图2，其中，A：离体培养0.5h的花粉，部分花粉的萌发孔膨大，开始启动萌发，此时萌发率和花粉管长度为0；B：培养2h的花粉及生长的花粉管，萌发率为18.8%，花粉管长度为0.09mm，但部分花粉仍在萌发中，其花粉管长度尚不及花粉粒直径，达不到萌发标准，故仍需继续进行培养；C：培养4h的花粉粒及生长正常的完整花粉管，此时萌发率达到最高（59.7%）且花粉管仍然保持较直（长度为0.55mm），便于观察与测量；D：培养6h后的花粉，此时萌发率开始下降，而且很多花粉管因生长过长（>10mm）而出现扭曲、互相盘绕现象，同时部分花粉管出现末端膨大、降解等异常现象，均不利于观测和比较）。