一株反硝化细菌及其培养条件

摘要

本发明公开一株反硝化细菌及其培养条件，属于环境微生物领域。经鉴定，该反硝化细菌为黄色海假单胞菌

说明书

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株反硝化细菌及其培养方法，以及其反硝化能力。

背景技术

水体富营养化是现今我国水环境面临的重大问题，严重地阻碍着我国国民经济的发展。废水处理过程中的脱氮处理越来越显示其重要地位。在现代水产养殖业中，由于养殖动物排泄和饵料过剩等原因造成水体中氨氮、亚硝酸盐等的含量严重超标，水质恶化，进而导致病害频发，并严重影响了水产养殖业的健康可持续发展。相对于物理化学脱氮方法，生物脱氮已经成为废水中去除氮素污染的最有效的方法之一，而微生物的反硝化作用正是改善水质，特别是降低水体中亚硝酸盐浓度的有效手段之一。

本发明的目的在于提供一株反硝化细菌及其培养条件，并初步研究其反硝化能力，可应用于水体的净化工艺。

发明内容

反硝化细菌的筛选、鉴定与培养条件优化方法如下：

（1）平板初筛及反硝化能力初步鉴定：从江南大学湖边采集土壤样品，制备土壤悬液，涂布于DM固体平板，于30℃恒温培养至长出明显菌落，用接种环逐个挑取形态各异的菌落至新的DM固体平板，划线分离出单菌落。选取分离后的单菌落，点种于BTB平板上，挑取有蓝色变色圈的阳性菌株即为反硝化细菌。

（2）摇瓶复筛与脱氮能力测定：初筛得到的菌株经摇瓶发酵，测定其脱氮能力。经复筛，3号菌总氮去除率最高，达78%。

（3）菌株16S rDNA鉴定：提取总DNA，用细菌16S rDNA通用引物扩增，得到的基因序列为1500 bp，经测序比对，为黄色海假单胞菌（Pseudomonas xanthomarina），命名为DN1，于2013年5月29日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 7650。

（4）菌株发酵条件初步优化：利用单因素实验对菌株的发酵培养基及发酵条件进行优化，得到最适培养基配方为丁二酸钠6-8 g/L、酵母粉6-10 g/L、硝酸钠0.67 g/L、磷酸二氢钾1.36 g/L、硫酸铵0.24 g/L、硫酸镁0.2 g/L，摇床培养条件为：pH 5.0，30℃，200 rpm，该条件下发酵14h，OD₆₀₀达7.29，约3×10⁸ cfu/ml。

（5）反硝化能力测定：在NaNO3浓度为10 mmol/L的水体中，添加丁二酸钠4 g/L，按1%的量接入上述菌液，72h后检测水样中硝酸盐氮和亚硝酸盐氮含量（以不投加菌体的水样作为对照），计算脱氮率达到90%以上。

 其中步骤（1）中所述的DM培养基为（g/L）：丁二酸钠 4.72，NaNO₃ 0.67，KH₂PO₄ 1.50，Na₂HPO₄ 0.42，MgSO₄·7H₂O 1.00，微量元素溶液 2 ml，pH调至7.2，固体培养基添加2%琼脂；BTB平板培养基为（g/L）：FeCl₃·H₂O 0.5，琥珀酸钠8.5，BTB 1 ml（1%溶于酒精），KNO₃ 1.00，KH₂PO₄ 1.00，CaCl₂·2H₂O 0.2，MgSO₄·7H₂O 1.00，pH调至7.0-7.3。

    本发明所述的Pseudomonas xanthomarina DN1为反硝化细菌，可广泛应用于各种富营养化水体的净化。                                                                                                         

具体实施方式

实施例1 反硝化细菌的筛选与鉴定

1、培养基配方

LB培养基（g/L）：胰蛋白胨1，酵母提取物0.5，氯化钠1，pH 7.0~7.2。需要时使用前加入100 μg /ml 氨苄青霉素，固体培养基添加2%琼脂，用于大肠杆菌的培养。

DM培养基（g/L）：丁二酸钠 4.72，NaNO₃ 0.67，KH₂PO₄ 1.50，Na₂HPO₄ 0.42，MgSO₄·7H₂O 1.00，微量元素溶液 2 ml，pH调至7.2，固体培养基添加2%琼脂。

微量元素溶液（g/L）：CuSO·5H₂O 4.00，FeSO₄·7H₂O 0.7，FeCl₃·6H₂O，CoCl₂·6H₂O，Na₂MO₄·2H₂O 3.40，CaCl₂·2H₂O 2.00。

SM培养基（g/L）：丁二酸钠3，NaNO₃ 0.67，KH₂PO₄ 1.36，酵母粉1，MgSO₄·7H₂O 1.00，pH调至7.2，固体培养基添加2%琼脂。

BTB平板（g/L）：FeCl₃·H₂O 0.5，琥珀酸钠8.5，BTB 1 ml（1%溶于酒精），KNO₃ 1.00，KH₂PO₄ 1.00，CaCl₂·2H₂O 0.2，MgSO₄·7H₂O 1.00，pH调至7.0-7.3。

2、平板初筛及反硝化能力初步鉴定

从江南大学湖边采集土壤样品，称取10g置于250 ml三角瓶中，加100 ml无菌水及几粒玻璃珠，摇床振荡1 5 min使土样分散均匀。待土样分散后，静置5 min后，吸取l ml土壤悬液至9 ml稀释液（无菌水），得到10^-2稀释度悬液，依次按l0倍稀释法稀释至l0^-7，由此制得各稀释度土壤悬液。分别吸取各稀释度悬液0.1 ml至DM固体平板（放置过夜，无杂菌生长），于30℃恒温培养至长出明显菌落，用接种环逐个挑取形态各异的菌落至新的DM固体平板，划线分离出单菌落。

选取分离后的单菌落，点种于BTB平板上，BTB在酸性条件是黄绿色的，当反硝化细菌消耗了硝酸根，pH上升，BTB会变蓝，初筛得到3株反硝化细菌。

3、摇瓶复筛与脱氮能力测定    

初筛得到的菌株经摇瓶发酵，测定其脱氮能力。通过测定滤液中的NO₃^--N和NO₂^--N浓度变化，可以反映各菌株的硝酸盐还原能力和实际脱氮能力。NO₃^--N的去除率，可以表明菌株的硝酸盐还原能力，而不考虑硝酸盐还原产物类型的差异（不论终产物是亚硝酸盐或气态产物）；NO_x^--N（NO_x^--N =NO₃^--N+NO₂^--N，亦称总氧化氮TON）的去除率，可以近似表明菌株的脱氮能力。NO₃^--N和NO₂^--N浓度测定采用国标方法。

经复筛，3号菌总氮去除率最高，达78%。

4、16S rDNA鉴定

提取总DNA，用细菌16S rDNA通用引物扩增，得到的基因序列为1500 bp，经测序比对，与黄色海假单胞菌的16S rDNA序列同源性高达99%，初步判断其为黄色海假单胞菌（Pseudomonas xanthomarina），命名为DN1。

实施例2 菌株发酵条件初步优化及反硝化能力测定

利用单因素实验对菌株的发酵培养基及发酵条件进行优化，得到最适培养基配方为丁二酸钠6-8 g/L、酵母粉6-10 g/L、硝酸钠0.67 g/L、磷酸二氢钾1.36 g/L、硫酸铵0.24 g/L、硫酸镁0.2 g/L，摇床培养条件为：pH 5.0，30℃，200 rpm，该条件下发酵14h，OD₆₀₀达7.29，约3×10⁸ cfu/ml。

在NaNO₃浓度为10 mmol/L的水体中，添加丁二酸钠4 g/L，按1%的量接入上述菌液，72h后检测水样中硝酸盐氮和亚硝酸盐氮含量（以不投加菌体的水样作为对照），计算脱氮率达到90%以上。