微尺度物质的分离方法及毛细管柱横向电色谱分离装置

摘要

本发明公开了一种微尺度物质的分离方法及毛细管柱横向电色谱分离装置，分离方法包括将样品引入分离装置的分离柱内，该分离柱由一个作为外电极的毛细管、一根作为内电极的沿轴向贯穿毛细管的导电材料共同组成，内电极与外电极同轴，并分别连接电源两端；分离柱横向上施加电场，利用电泳作用使待分离物质发生横向迁移，增加待分离物质与柱表面的接触几率，依据待分离物质与柱表面相互作用力大小的差异实现分离；通过电场方向的切换完成待分离物质与柱表面的吸附解析过程，进而提高待分离物质间的分辨率。本发明有效的将电泳技术和色谱技术融于一体，实现不同物质的有效分离，分离方法的操作及专用装置的制作均较简单，且可以实现在线检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微尺度物质的分离方法及其专用设备，具体是指将电泳技术与色谱技术融合于一体的一种微尺度物质的分离方法及毛细管柱横向电色谱分离装置。

背景技术

目前，微尺度物质如细胞、生物大分子、合成颗粒物、胶体等，其分离和筛选已经成为当代各研究领域中一个优选的主要研究内容。传统的分离技术很难同时分离尺寸范围较宽的样本，而且很难获得单一尺寸的目标物质，这些都将给后续研究带来不便。为实现微尺度物质的分离，一些无阻塞、非填充型分离系统被建立，而绝大多数都属于连续型分离技术，此类技术有诸多优势，比如可以实现样品的连续分离与筛选、可实现大量样品的快速分离等。然而此类技术的装置结构和制作过程均比较复杂，并且设备制作精度要求高，对于多个组分的分离，装置制备更为困难。多出口设计特点很难实现样品的在线检测，故此不适用于未知或复杂样品的分离分析。另外，大部分微分离技术与现有色谱技术相比，其分离度均较低。因此，连续型分离技术实际应用过程中必然面临一些挑战。基于以上局限，为更好的研究微尺度物质，需要开发一种高分辨率、装置制作和实验操作均较简单的技术。更为重要的是，要求技术能够容易实现样品的在线检测。

发明内容

本发明的目的是为了克服非填充型分离系统中微尺度物质分离度低的不足，而提供一种微尺度物质的分离方法及其专用设备毛细管柱横向电色谱分离装置，本发明在分离装置的分离柱横向上引入电场，且柱表面引入色谱作用，微尺度物质进入分离柱后能够在电场作用下发生横向电迁移，通过物质的电迁移行为增加粒子与柱表面的接触几率，进而提高色谱作用的贡献，最终达到提高分离度的目的

为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

　一种微尺度物质的分离方法，包括下列步骤：

    ①样品由微量注射器引入进样器内；

    ②打开毛细管柱横向电色谱分离装置的电源开关，使毛细管柱横向电色谱分离装置的分离柱横向上形成电场；

    ③样品在由运载液的带动下由进样阀进入所述的分离柱，在外加横向电场作用下，样品中待分离物质在分离柱内发生横向迁移，待分离物质迁移到柱表面时，待分离物质会与柱表面发生相互作用；

    ④电源正负极方向的切换，使待分离物质在分离柱内部横向上来回迁移，并与分离柱内表面发生吸附解吸过程，依据横向力的差异导致物质间分配系数存在差异，从而导致待分离物质沿流动方向有不同的速度，实现不同物质的分离；

    ⑤分离物质以不同洗脱时间进入检测器内，进行在线检测。

所述的电场提供方式为脉冲电源或交流电源。

一种毛细管柱横向电色谱分离装置，包括有提供运载液的泵、进样器、检测器、电源和一端连接进样器，另一端连接检测器的分离柱，其中所述的分离柱包括有：

一个毛细管，该毛细管作为外电极；

一根导电材料，该导电材料作为内电极，沿轴向贯穿毛细管并处于毛细管中心处，即内电极与与外电极同轴，内电极与与外电极连接电源两端。

所述的导电材料为铂丝、金丝或银丝。

本发明的分离机理：待分离物质经进样阀引入分离柱后，在分离柱内，待分离物质将受横向电场作用发生横向移动即电泳技术，当待分离物质迁移到柱表面时，待分离物质与柱表面将发生相互作用即色谱技术。本发明中，待分离物质因自身性质不同，其所受横向作用力将产生差异，进而使待分离物质横向迁移距离产生差异，最终导致待分离物质与柱表面作用力存在差异，即待分离物质在本发明的分离柱内的分配系数存在差异，最终实现待分离物质的分离与分析。在本发明系统内，利用电场方向的切换，使待分离物质在分离柱横向上有反复迁移过程，进而使待分离物质与柱表面之间有吸附解吸过程，通过改变电场的频率，提高理论塔板数，进而提高无阻塞、非填充型分离系统的分离度。

上述的自身性质包括尺寸大小或分子量、表面电荷以及扩散系数；上述的横向作用力为电泳力和黏滞阻力；上述的待分离物质与柱表面之间的相互作用可以为离子相互作用（静电作用）、非极性相互作用或离子相互作用和非极性相互作用同时存在。

总之，本发明通过将分离柱与检测器的在线联用，克服了当前微分离技术对未知的或复杂的微尺度物质难以在线分离分析的困难。另外，本发明有效的将电泳技术和色谱技术融于一体，大大提高了无阻塞、非填充型分离柱的理论塔板数，进而实现样品的高效分离，有望获得单一尺寸的微尺度物质，为微尺度物质的后续研究奠定基础。　　

附图说明

图1为本发明毛细管柱横向电色谱分离装置示意图。

 图2为本发明实施例中不同尺寸聚苯乙烯颗粒分离效果图。

图3为本发明实施例中不同表面电荷聚苯乙烯颗粒分离效果图。　　　

具体实施方式：

　　在图1中，1、运载液，2、六通进样阀，3、样品，4、废液，5、PEEK管，6、导电材料—内电极，7、毛细管—外电极，8、电源，9、检测器，10、三通阀。

   参考图1，一种毛细管柱横向电色谱分离装置，包括有提供运载液的泵、进样器、检测器、电源和一端连接进样器，另一端连接检测器的分离柱，其中所述的分离柱包括有：一个毛细管7，该毛细管7作为外电极；一根导电材料6，所述的导电材料6可为铂丝、金丝或银丝，该导电材料6作为内电极，沿轴向贯穿毛细管7，为保证分离柱内各处待分离物质所受横向电场力相同，内电极必须置于外电极中心处，即内电极与与外电极同轴，并分别连接电源8两端，进而在分离柱横向上产生电场。本发明无需使用常规液相系统的高压泵，进样器采用六通进样阀2，为将待分离物质引入分离柱，并实现在线检测，分离柱的毛细管7一端通过固定设置的三通阀10连接六通进样阀2以便引入样品3，另一端通过固定设置的三通阀10连接检测器9以便实分离物质的在线检测，处于毛细管外侧的导电材料6两端由PEEK管5承接。

利用上述专用的毛细管柱横向电色谱分离装置而公开的一种微尺度物质的分离方法，包括下列步骤：

①样品3由微量注射器引入六通进样阀2内；

②打开电源8的开关，使分离柱横向上形成电场；

③样品3在由泵提供的运载液1的带动下由六通进样阀2、三通阀10进入分离柱，在外加横向电场作用下，样品中待分离物质在分离柱内发生横向迁移；

④电源8的正负极方向切换，使待分离物质在横向上来回迁移，并与柱表面发生吸附解吸过程，横向力的差异使物质间分配系数存在差异，进而导致待分离物质沿流动方向有不同的速度，实现不同物质的分离；

⑤分离物质以不同洗脱时间由三通阀10进入检测器9内，进行在线检测，同时排出废液4。

在具体分离操作过程中，所述的电源为脉冲电源或交流电源。所述的横向作用力为电泳力、黏滞阻力、待分离物质与柱表面之间的相互作用力；所述的待分离物质与柱表面之间的相互作用可以为离子相互作用（静电作用）、非极性相互作用或离子相互作用与非极性相互作用同时存在。

在毛细管柱横向电色谱系统中，当分离柱固定时，待分离物质与柱表面之间的吸附解析次数直接影响待分离物质间的分离度。在毛细管柱横向电色谱技术中，通过优化电场大小（电压和频率）、电泳时间、运载液流速等参数可提高待分离物质间的分离度。优化结果显示，外加电场频率f和持续时间t与洗脱时间t_e成正相关，电压U对t_e无影响，但影响颗粒的保留量和峰形；另外，电压U和电场持续时间t与半峰宽w_1/2成负相关， f与w_1/2成正相关；一定范围内，运载液流速影响不大。本发明中在电场作用下，待分离物质将发生横向迁移，因待分离物质横向迁移距离不同使其与柱表面的相互作用力存在差异，即分配系数不同。另外，本发明中采用脉冲频率的变化使待分离物质与柱表面发生吸附解吸过程。基于以上两个原因，最终实现微尺度的不同物质之间的分离。

本发明在实际分离过程中对微尺度物质实现分离，以聚苯乙烯颗粒物为例评价其分辨率。毛细管柱横向电色谱技术分离条件如下，分离柱长度为20 cm；电压为1.2 V；频率为0.5 Hz；电场施加时间为10 min；脉冲周期分别为0.4和0.6；运载液为蒸馏水；流速为1.0 mL/h。如图2、图3。从图2、3可以得出，毛细管柱横向电色谱分离技术实现了不同微尺度物质（不同尺寸或不同表面电荷）分离的目的。本发明公开了毛细管柱横向电色谱技术，首次有效的将电泳技术和色谱技术融于一体，提高待分离物质间的分辨率，获得单一尺寸的微尺度物质，而且该技术可以实现在线检测。