一种酸性磷酸酶突变体、编码基因、载体及应用

摘要

本发明提供了一种酸性磷酸酶突变体及其编码基因，以及含有该基因的载体和应用。所述突变体由SEQ ID No.1所示氨基酸序列经点突变得到，所述点突变为：第108位突变为丝氨酸，和/或第143位突变为亮氨酸。本发明的有益效果主要体现在：本发明运用半理性设计的方法，对酸性磷酸酶（EB-AP/PTase）基因进行多轮点饱和突变，获得了酶活力提高的酸性磷酸酶突变体AP/PT-D108S和AP/PT-D108S/N143L，具有较高的实用价值和广阔的市场应用前景。

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种酸性磷酸酶突变体及其编码基因，以及含有该基 因的载体和应用。

（二）背景技术

呈味核苷酸I+G作为新一代食品增鲜剂，由5’-肌苷酸（5’-IMP）和 5’-鸟苷酸（5’-GMP）按1:1混合而成。I+G具有比谷氨酸钠（味精）更 鲜美的呈味效应，也可与味精混合使用，具有相乘的协同效应，并且能够 显著降低产品成本，广泛应用与食品加工领域。

I+G的呈味作用取决于其化学结构，研究发现只有核苷5’-位碳原子 上的羟基与磷酸基团发生酯化才表现出鲜味活性，而2’-和3’-位碳原子的 羟基磷酸酯化无活性。因此，通过磷酸化反应将肌苷或鸟苷转化为呈味核 苷酸，关键是如何使核苷的5’-位磷酸酯化反应。相比化学磷酸化方法而 言，利用酸性磷酸酶生物催化无机焦磷酸（PPi）的磷酸根特异地转移到 核苷分子的特定位置上，该反应不需要ATP，具有反应条件温和、位置 特异性强、转化率高、环境友好等特点，具有独特的优势和潜力。酸性磷 酸酶催化肌苷和鸟苷磷酸化生成5’-IMP和5’-GMP的过程如下式所示：

20世纪70年代末，加拿大著名科学家Smith首次发明了寡聚核苷酸 定点突变技术，研究表明，多点突变的效果往往比单点突变更为理想。点 饱和突变技术在提高催化活性，减少副反应，提高热稳定性，改变底物结 合特异性等方面有显著的作用。此外点饱和突变技术在医药，农牧业和环 境保护，蛋白质基因表达与调控等研究领域的应用也越来越广阔。点饱和 突变技术的原理是在靶位点处设计兼并引物并对目的基因进行扩增以获 得靶位点处氨基酸分别被其它19种天然氨基酸所替代的突变子。一般将 兼并引物设计成NNN或NNX（N代表4种核苷酸等比例混合物；X代 表2种核苷酸等比例混合物（如G/C或G/T）。

Asano等最早开展了酶法磷酸化生产5’-IMP和5’-GMP的研究，首 次研究发现了Morganella morganii的磷酸酶具有选择性磷酸化酶活性， 对肌苷和鸟苷的催化效率大致相同，为简单的一步转移磷酸基团反应。然 后他们从M.morganii中分离纯化得到选择性磷酸化酶，并成功克隆到控 制其磷酸转移活性的基因，在此基础上利用易错PCR的技术通过随机突 变建立突变文库，成功得到具有两个突变点（G74D/I153T）的磷酸转移 活性的基因，将其导入Escherichia coli，得到一株含有G74D/I153T的突 变体的高产酸性磷酸酶突变株。由于该酶在转移磷酸基团的同时也在催化 磷酸水解，因此要尽可能的抑制其水解活性，针对这一问题，他们找到与 M.morganii有着高度同源性的Escherichia blattae，并以E.blattae为出发 菌株，采用定点突变，对酸性磷酸酶基因引入突变（S72F/G74D/I153T）， 成功提高了该酶的磷酸转移活性，同时也降低了其水解酶的活性。Mihara 等利用点饱和突变技术对E.blattae酸性磷酸酶EB-AP/PTase的一些活性 位点进行突变，获得了一个包含11个氨基酸突变的良性突变体（L63Q， A65Q，E66A，N69D，S71A，S72A，G74D，D116E，T135K，E136D， I153T），该突变酶活性明显提高。

然而，目前酸性磷酸酶EB-AP/PTase存在的主要问题是酶活力相对 较低，导致酶法生产I+G成本较高。因此提高酸性磷酸酶酶活力，对推 动呈味核苷酸的工业化生产具有重要的意义。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种酶活提高的酸性磷酸酶突变体，为绿色生产呈 味核苷酸I+G提供条件。

本发明采用的技术方案是：

一种酸性磷酸酶突变体，由SEQ ID No.1所示氨基酸序列经点突变 得到，所述点突变为：第108位突变为丝氨酸，和/或第143位突变为亮 氨酸。所述突变体是以SEQ ID No:1为出发序列，经过多轮点饱和突变， 筛选获得的酶活力提高的酸性磷酸酶突变体。

具体的，所述酸性磷酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.2 （AP/PT-D108S）或SEQ ID No.3所示（AP/PT-D108S/N143L）。

本发明还涉及编码所述酸性磷酸酶突变体的基因。

具体的，所述基因序列如SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示。

本发明还涉及含有所述基因的重组载体，以及所述的基因在制备重组 酸性磷酸酶突变体中的应用。

本发明还涉及所述的酸性磷酸酶突变体在生产呈味核苷酸中的应 用。

本发明的有益效果主要体现在：本发明运用半理性设计的方法，对酸 性磷酸酶（EB-AP/PTase）基因进行多轮点饱和突变，获得了酶活力提高 的酸性磷酸酶突变体AP/PT-D108S和AP/PT-D108S/N143L，具有较高的 实用价值和广阔的市场应用前景。

（四）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例1：酸性磷酸酶（EB-AP/PTase）的蛋白质晶体结构及饱和突 变点的确定

对酸性磷酸酶的蛋白质晶体结构进行分析（PDB蛋白数据库 ID:1EOI），酸性磷酸酶的活性位点为：Lys115，Arg122，Ser148，Gly149， His150，Arg183，His189，Asp193。以肌苷为底物，对其进行分子对接。 确定以下3个突变点：第108位的天冬氨酸，第104位的谷氨酸，第143 位的天冬酰胺。

实施例2：酸性磷酸酶突变体的构建

（1）构建酸性磷酸酶（EB-AP/PTase）重组大肠杆菌

根据SEQ ID No:4所示序列，采用化学全合成的方法合成后，克隆到 表达载体pET28b上，并将重组表达质粒pET28b-AP/PT转入大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中，经酶切和菌落PCR鉴定，成功构建重组大肠杆菌E.coli  BL21(DE3)/pET28b-AP/PT。

（2）E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PTase的分子改造

A、对E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PTase通过引物扩增目的基因 引物（108）：

上游引物：GAGGACGCCGGANNNCTTGCAACTCGT

下游引物：ACGAGTTGCAAGNNNTCCGGCGTCCTC

以E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PTase的质粒为模板，Prime STAR 为聚合酶，在引物的参与下进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；用Dpn  Ⅰ消化模板进行酶切，然后将酶切后的产物转化到大肠杆菌BL21(DE3) 感受态中，最后将转化细胞涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB平板 上筛选阳性克隆，37℃过夜培养，得到点突变体D108S；

LB平板配制：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g， 蒸馏水1000mL。

LB液体培养基配制：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸 馏水1000mL。

B、以D108S的质粒为模板，进行迭代饱和突变：针对第104位的谷 氨酸和第143为的天冬酰胺设计引物，建立饱和突变库，并参考上述步骤 进行新一轮的筛选，目的是得到饱和突变文库。

引物（104）：

上游引物：TGGTAGCCCNNNCACCGAAAAAGA

下游引物：TCTTTTTCGGTGNNNGGGCTACCA；

引物（143）：

上游引物：CCGTTCGCNNNTTATGGGGTCTC

下游引物：GAGACCCCATAANNNGCGAACGG

步骤A中所述的PCR扩增的反应条件：预变性：98℃2min；变性： 98℃10s；退火：50℃10s；延伸：72℃6min；从变性到延伸共30个循 环；最后，72℃10min；4℃保存。使用的聚合酶为Prime STAR。

步骤B中所述的PCR扩增的反应条件：预变性：98℃2min；变性： 98℃10s；退火：50℃10s；延伸：72℃6min；从变性到延伸共33个循 环；最后，72℃10min；4℃保存。使用的聚合酶为Prime STAR。

（3）从饱和突变文库中筛选到酶活显著提高的酸性磷酸酶突变体

对步骤（2）中37℃培养后的LB卡那霉素抗性平板上的单菌落进行 初步筛选，将产生透明圈的菌落，接种于含有5ml LB培养基的试管中， 接种前加入5μg/ml的卡那霉素，于37℃过夜培养；然后转接到含有50ml  LB培养基的250ml三角瓶中，接种前加入50μg/ml的卡那霉素，于37℃ 培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8，加入0.1mM IPTG进行诱导，28℃继续培养 10h。发酵结束后，离心收集菌体，0.85%生理盐水洗涤菌体2遍，然后 悬浮在100mM醋酸钠缓冲液中（pH5.0），为催化反应备用。

催化反应体系：反应缓冲液为0.1M pH5.0的醋酸钠缓冲液10ml； 反应温度为35℃；反应底物中肌苷的浓度为10mg/ml，十水焦磷酸钠浓 度为200mg/ml；菌体添加量为0.05g；反应时间为1h，以E.coli BL21(DE3) 空菌株为阴性对照。反应结束后，取1ml反应液用200μl2M盐酸终止 反应，用HPLC进行分析。

结果，筛选到两个活性提高的突变体：突变体D108S（其氨基酸序 列如SEQ ID No:2所示，编码基因如SEQ ID No:5所示），和突变体 D108S/N143L（其氨基酸序列如SEQ ID No:3所示，编码基因如SEQ ID  No:6所示）。

与E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PTase相比，本发明的酸性磷酸酶的 酶活获得了提高，结果如表1所示：

表1：3株菌株与出发菌株在相同反应体系下的酶活力