靶向胸苷激酶光敏剂及其药物组合物与治疗癌症的用途

摘要

本发明提供了一种靶向胸苷激酶光敏剂及其药物组合物与治疗癌症的用途。本发明所述的靶向胸苷激酶光敏剂增强了光敏剂对肿瘤细胞的选择性、具有更好的耐受性能够在24小时达到最高血药浓度。本发明所述的靶向胸苷激酶光敏剂具有更大共轭系统吸收波长更长有利于治疗深度肿瘤，该波长区域不需要耗费光输出设备很多能量，甚至使用LED即可，使PDT更具实用性和经济性。本发明所述靶向胸苷激酶光敏剂不仅可诊断，还可通过荧光成像引导用于治疗前列腺癌。本发明所述药物组合物将化疗剂与靶向胸苷激酶光敏剂组合联用，进一步提高了PDT法的治疗效果，扩大了肿瘤应用范围，对转移性肿瘤也具有很好的疗效。

说明书

技术领域

本发明涉及制药领域，尤其涉及一种靶向胸苷激酶光敏剂及其药物组合物与治疗癌症的用途。 

背景技术

前列腺癌是最常见的非皮肤感染性恶性肿瘤，在男性中致死率位于第二，仅次于肺癌。在美国，每年近19万人被诊断为前列腺癌，且大约有近3.1万人死于前列腺癌。前列腺癌是一种多病灶疾病，需要对整个腺体进行控制治疗。目前，治疗方法主要包括只观察(密切观察等待)、手术(根治性前列腺切除术)、辐射(外部照射或植入放射性源近距离放射疗法)、辐射加激素疗法(新佐剂疗法)和激素治疗(雄激素阻断疗法)。此外据调查，部分医生对于局部病变还采用冷冻疗法、化疗和其他新方法来进行治疗。然而不幸地是，所有这些方法都存在弊端，因此亟需新的治疗前列腺癌的方法。 

临床研究表明，光动力学疗法(PDT)是治疗癌症极具吸引力的一种形式，其原理是：肿瘤组织选择性摄取光敏剂，并储于其内，随后在适当波长光局部照射下，光敏剂被激活，从而产生光敏效应。PDT不会引起严重的全身性副作用并且其可反复利用。PDT在杀灭肿瘤细胞的同时不会影响到周围的组织细胞。 PDT疗法具有三大显著优势：良好的接受性、低副作用和高效。 

在20世纪70年代末期和90年代早期，科学家们试着开发前列腺癌的光敏剂-PDT疗法，使基于组织的光敏剂得到发展。同时，PDT-介导新型光敏剂在治疗前列腺癌症方面似乎极具潜力(Photodynamic Therapy：A New Approach toProstate Cancer.Curr.Urol.Rep.2003，4，221-228)。位于英国伦敦的伦敦大学学院(The University College London)证明了替莫泊芬对治疗前列腺癌具有潜在疗效。Zaak和他的同事们报道了利用氨基乙酰丙酸介导的原卟啉IX来治疗前列腺癌(Photodynamic therapy by means of5-ALA induced PPIX in human prostatecancer-preliminary results.Medical Laser Application2003，18，91-95)。Motexafin镥是一种显著的血管活化光敏剂，已经经过狗模型试验(Photodynamic therapy inthe canine prostate using motexafin lutetium.Clin Cancer Res2001，7，651-660)，并且已应用于经放疗后的患者。据报道，使用高剂量PDT比起低剂量的更为理想。Padoporfinand padeliporfin是细菌脱镁叶绿酸钯盐光敏剂，Padoporfin第一试验阶段包括28名正在进行放射性治疗、具有周期性前列腺癌症的加拿大患者。数据显示，2mg/kg的药物剂量具有最佳疗效。紧接着，他们在同样的未经过放疗的前列腺癌症男性患者中使用padeliporfin，结果也相当乐观。总之，自从1978年首次使用光动力学疗法来治疗前列腺癌以来(Photoradiation Therapy for the Treatment of Malignant Tumors.Cancer Res.1978，38，2628-2635)，随着光传递和光敏剂设计的显著发展，人们终于可以对处于正 式临床试验中的许多光敏剂进行评估。 

尽管近几年来，许多光敏剂被研发出来，其中一些被临床试验，比如Tookad和m-THPC，但这两个类似物存在其固有的弊端。比如，尽管对Tookad进行长波照射不会引起明显的皮肤光毒性，但从注射该药物到光处理这一段时间是很短暂的(即有效治疗窗很短)，因此，药物输液和光处理几乎是同时的，有时在患者的治疗中会产生不太一样的治疗效果的问题。再如，在注射m-THPC后，该药物需经过较长时间(3-4天)的血液循环，才能蓄积足够的浓度来杀灭肿瘤细胞；此外，它还具有严重的皮肤光毒性。 

还有一类得到充分实验的四吡咯或还原四吡咯结构的光敏剂是2-((1′-正己氧基)乙基)-2-去乙烯基-焦脱镁叶绿酸-a(HPPH)及其类似物，其中HPPH的结构如下： 

HPPH及其盐的制备方法可见于美国专利5,198,460(再公告号为RE39094)、 5,314,905(再公告号为RE38994)或论文：Methyl Pyropheophorbide-aAnalogs：Potential Fluorescent Probes for the Peripheral-Type Benzodiazepine Receptor.Effect of Central Metal in Photosensitizing Efficacy.J.Med.Chem(rapidcommunication).2005，48(11)，3692-3695。HPPH光毒性持续时间比其他光敏剂短的多，对正常组织的损伤少，治疗效果较好，但在治疗肿瘤和其他过度增生性组织时还是会发生红斑和其他损伤。 

另一方面，使用光敏剂-PDT疗法来治疗前列腺癌的关键在于增强PDT光敏试剂对前列腺癌肿瘤细胞的选择性。目前，很多的癌症成像和治疗方法都利用了肿瘤细胞的增殖和DNA合成。脱氧核糖核酸(DNA)合成处于细胞周期的特殊阶段S期，肿瘤细胞增殖时合成大量DNA，而胸苷激酶1在增生细胞中有较高活性，它受S期的细胞表达调控。因此，通过标记的胸苷对静止期细胞和增生细胞在细胞周期S期DNA的合成阶段进行比较，可研究细胞的增殖情况。早期实验室中，用3H和14C标记胸苷，后来发展到使用阳离子发射层析X射线摄影术(PET)来合成11C-胸苷。嘧啶是用来合成DNA最基本的单元，因此利用11C-胸苷成像是很有意义的。虽然此方法有利于调研和效度研究，但11C过短的半衰期使其得不到广泛的认可，11C-胸苷半衰期很短且会很快降解，因此常规的临床应用并不实际，所以人们一直在寻找具有更优越成像性能的胸苷类似物。 

胸苷类似物已被制药工业和学术科研领域作为一个可能的治疗化合物进行 了广泛研究。查尔斯·海德堡博士最早对这些类似物进行研究，他一直尝试寻找可以干扰DNA合成的胸苷类似物，并于1975年研发出了5-氟二氧嘧啶。5-氟二氧嘧啶是非常有效的抗肿瘤药物，至今仍被广泛应用于临床。当胸苷类似物 ¹⁸F-FLT进入体内，它是能被细胞接纳的并且能在其被胸苷激酶1磷酸化后聚集。有研究人员发现了3′-脱氧-3′-氟胸苷(FLT)，可以用具有更长半衰期(109.8分钟)的同位素，¹⁸F(¹⁸FLT)对其进行标记。通过对多种核苷类似物在细胞增生成像运用方面进行评估，¹⁸F-FLT(3′-脱氧-3′-氟胸苷)法可能是目前为止最好的方法。 

此外，当前光敏剂-PDT疗法在治疗前列腺癌时需要将整个前列腺暴露在适合波长的光照下(依赖于所使用的光敏剂)。另外，尽管光敏剂-PDT疗法是非常有效的癌症治疗方法，它只能用于局部治疗即原发性肿瘤，对于转移性肿瘤的治疗有其局限性。对于转移性肿瘤，通常需要使用化疗剂，如紫杉醇化疗法能够产生全身性的疗效。因此，目前仅对前列腺癌进行单一的光敏剂-PDT疗法或化疗法，局限性都很大，效果并不理想。 

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种疗效好、易成像的靶向胸苷激酶光敏剂，同时还提供了靶向胸苷激酶光敏剂的药物组合物以及其治疗癌症的用途。 

本发明采用的技术方案为： 

本发明一方面涉及一种靶向胸苷激酶光敏剂，具有式I所示结构： 

其中，-R为-COO-R₅或-CO-NH-R₅，

R₁为烷基； 

R₂为H或对位被R取代的苯基，所述取代基R的定义如前； 

-R₃为-CH₂或-CO-N_R4且其羰基端连在该光敏剂母核的碳碳双键碳原子上，R₄为烷基。 

本发明的光敏剂，由四吡咯或还原四吡咯结构的传统光敏剂与胸苷轭合而成，是具有更大共轭系统的增强型光敏剂，轭合的方式可以为成酯键或酰胺键的形式，因具有胸苷结构，因此命名为靶向胸苷激酶光敏剂。 

进一步，在一些实施例中，所述-R为-COO-R₅。 

进一步，在一些实施例中，所述R₁为正丁基或正己基。 

进一步，在一些实施例中，所述-R₃为-CH₂，或为-CO-NR₄且其羰基端连在该光敏剂母核的碳碳双键碳原子上，所述R₄为正丁基或正己基。 

进一步，在一些实施例中，所述靶向胸苷激酶光敏剂结构式如式II、式III 或式IV所示： 

R为-COO-R₅、R₂为H的靶向胸苷激酶光敏剂的制备，可以以HPPH或其类似物为原料与胸苷通过酯化反应直接轭合而成，路线如下： 

例如，上述式II所示光敏剂化学全名为17³-胸苷基-3-((1′-正己氧基)乙基)-3-去乙烯基-焦脱镁叶绿酸，由HPPH的羧基与胸苷的羟基缩合成酯键而制成，因此又命名为HPPH-胸苷轭合物(thymidine-HPPH conjugate)。该光敏剂的制备方法为将HPPH、卡特缩合剂、胸苷和三乙胺溶解于无水二甲基甲酰胺(DMF)中，过夜搅拌反应混合液即得。 

其中，所述卡特缩合剂中文名为苯并三氮唑-1-基-氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)，可以通过商业渠道购买得到。所述胸苷可购自Aldrich、Sigma、BDH等公司。由于胸苷的羟基在一定条件下可转换成氨基即 

因此，上述HPPH也可与胸苷以酰胺键轭合，制成本发明的靶向胸苷激酶光敏剂。 

再如，式IV化合物也可以以HPPH或其类似物为原料通过与胸苷直接轭合制得，路线如下： 

如背景部分所述，原料HPPH或其类似物已得到充分的实验研究，其制备方法尤其是HPPH的制备已得到充分公开，如上述合成路线中化合物7的一种制备方法可见本发明人的论文Synthesis，Photophysical Properties，Tumor Uptake，and Preliminary in Vivo Photosensitizing Efficacy of a Homologous Series of  3-(1′-Alkyloxy)ethyl-3-devinylpurpurin-18-N-alkylimides with Variable Lipophilicity (Journal of Medicinal Chemistry，2001，vol.44，#10p.1540-1559)。 

而R为-COO-R₅、R₂为对位被R取代的苯基的靶向胸苷激酶光敏剂，可以以HPPH或其类似物为原料，先进行卤代等一系列反应，最后通过与胸苷直接轭合，即可制得，路线如下(其中X为卤原子如Br)： 

例如，式III化合物(即下述合成路线中化合物6)，以HPPH(即下述合成路线中化合物1)为原料，先与吡啶鎓三溴化物反应，最后通过与胸苷直接轭合，即可制得，路线如下： 

本发明通过荧光成像实验证实本发明所述靶向胸苷激酶光敏剂具有良好的成像性能，进而帮助前列腺癌和其他癌症进行成像引导治疗。因此本发明还提供所述光敏剂在制备通过荧光成像引导用于治疗前列腺癌和其它癌症的药物中的用途。 

进一步，本发明另一方面涉及一种药物组合物，其包括本发明所述靶向胸苷激酶光敏剂和化疗剂。 

进一步，在一些实施例中所述化疗剂为紫杉醇。 

本发明通过PDT疗效比较实验证明本发明所述光敏剂HPPH-胸苷轭合物与紫杉醇的联用提高了PDT法的疗效。因此本发明还提供了所述药物组合物在制备通过荧光成像引导用于治疗原发性前列腺癌、其它原发性肿瘤和转移性肿瘤的药物中的用途。 

与现有技术相比，本发明所述的靶向胸苷激酶光敏剂有益效果为： 

1、本发明所述靶向胸苷激酶光敏剂增强了光敏剂对肿瘤细胞的选择性，将体内肿瘤治愈率从HPPH的30％提高到了HPPH-胸苷轭合物的50％，本发明的PDT光敏剂既不像Tookad那样治疗窗过窄，又克服了m-THPC具有长期皮肤光毒性、需3-4天才能到达肿瘤细胞处聚集的缺点，本发明靶向胸苷激酶光敏剂具有更好的耐受性能够在24小时达到最高血药浓度； 

2、本发明所述靶向胸苷激酶光敏剂具有更大共轭系统，吸收波长更长，有利于治疗深度肿瘤；该波长区域不需要耗费光输出设备很多能量，甚至使用LED即可，使PDT更具实用性和经济性； 

3、本发明所述药物组合物将化疗剂与靶向胸苷激酶光敏剂组合联用，进一步提高了PDT法的治疗效果，如将肿瘤治愈率从单用HPPH-胸苷轭合物的50％提高到了联用紫杉醇后的70％； 

4、本发明所述靶向胸苷激酶光敏剂不仅可诊断，还可通过荧光成像引导用于治疗前列腺癌，真正实现了“即查即治”(See and Treat)；进一步与化疗剂联用组成药物组合物，扩大了肿瘤应用范围，对转移性肿瘤也具有很好的疗效。 

附图说明

图1为本发明实施例1HPPH-胸苷轭合物的电子吸收谱图，其中横坐标为波长，单位为nm，纵坐标为吸收强度； 

图2为本发明实施例1HPPH-胸苷轭合物的1H-NMR图； 

图3为实施例4HPPH、HPPH-胸苷轭合物以及HPPH-胸苷轭合物联用紫杉醇在体外的PDT疗效比较图，其中，横坐标为光剂量，单位为J/CM²；纵坐标为细胞存活率(cell survival％)，单位为百分率(％，)；编号1化合物指HPPH；编号3化合物指本发明的HPPH-胸苷轭合物； 

图4为本发明实施例2涉及的光敏剂的体外PDT疗效比较图，其中，横坐标为光剂量，单位为J/CM²；纵坐标为细胞生长量相对百分率(contorl growth％)，单位为百分率(％，)； 

图5为本发明实施例3涉及的光敏剂的体外PDT疗效比较图，其中，横坐标为光剂量，单位为J/CM²；纵坐标为相对生长率，单位为百分率(％，)； 

图6为本发明实施例6HPPH、HPPH-胸苷轭合物以及HPPH-胸苷轭合物联用紫杉醇在体内的PDT疗效比较图，图中化合物1指HPPH，化合物3指本发明的HPPH-胸苷轭合物，其中，横坐标为治疗后天数，单位为天；纵坐标为小鼠治愈率，单位为百分率(％，)； 

图7为本发明实施例7HPPH-胸苷轭合物用于肿瘤治疗的荧光成像图。 

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。 

实施例1：HPPH-胸苷轭合物的制备 

其中，HPPH编号为化合物1，HPPH-胸苷轭合物编号为化合物3；具体制备方法如下： 

将HPPH(300mg，0.48mmol)、苯并三氮唑-1-基-氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(255mg、0.58mmol)、胸苷(1800mg，7.2mmol)和三乙胺(约0.5mL)溶解于约20mL的无水二甲基甲酰胺(DMF)中，过夜搅拌反应混合液，高真空除去DMF后，通过色谱层析法，用15％MeOH/CH₂Cl₂作洗脱液纯化该混合物，得到的目标产物收率达52％以上(210mg)，其电子吸收谱如附图1所示(紫外-可见光，甲醇浓度为7.7μM)，λ_max(MeOH)，nm(ε)：663nm(5.25×10⁴)，606nm(7.49×10³)，538nm(7.51×10³)，507nm(7.28×10³)，412nm(10.52×10⁴). 

NMR如附图2所示，¹HNMR(CDCl₃；400MHz)：δ9.81，9.79(each peak for1/2proton，H-5)，9.40(s，1H，H-10)，8.53(s，1H，H-15)，8.46(s，1H，ArH)，7.18-6.89(m，3H，)，5.89(q，J＝6.5Hz，1H，3¹-H)，5.25(d，J＝17.5Hz，1H，13²-CH₂)，5.07(d，J＝17.5Hz，1H，13²-CH₂)，4.52-4.41(m，1H，18H)，4.34-4.26 (m，1H，17H)，4.14-4.00(m，1H，)，3.97-3.83(m，1H，)，3.71-3.49(m，7H，2H for3¹-OCH₂(CH₂)₄CH₃，2H for8-C-H₂CH₃，3H for7-CH₃)，3.36(s，3H，2-CH₃)，3.23(s，3H，12-CH₃)，2.73-2.63(m，1H，17¹-H)，2.62-2.51(m，1H，17¹-H)，2.38-2.26(m，2H，)，2.19-2.13(m，2H，172-H)，2.09(d，J＝6.5Hz，3H，3²-CH₃)，1.78(d，J＝7.5Hz，3H，18-CH₃)，1.70-1.57(m，8H，3H for8-CH₂CH₃，3H for Ar-CH₃，2H for3¹-OCH₂CH₂(CH₂)₃CH₃)，1.39-1.30(m，6H，3¹-O(CH₂)₂(CH₂)₃CH₃)，0.77(t，J＝10Hz，3H，3¹-OCH₂(CH₂)₄CH₃).Mass calcd forC₄₉H₆₀N₆O₈：860.4，found：861.7(MH)，883.6(M+Na)。 

实施例2：含取代苯基的靶向胸苷激酶光敏剂的制备 

含取代苯基的靶向胸苷激酶光敏剂即17³-胸苷基-20-(4-胸苷基氧羰基)苯基-3-((1′-正己氧基)乙基)-3-去乙烯基-焦脱镁叶绿酸的制备线路及具体实验如下(本发明将其编号为化合物6)： 

步骤1、化合物4的制备： 

将HPPH1(300mg，0.47mmol)和吡啶鎓三溴化物(196mg，0.61mmol)溶解在10mL二氯甲烷中；将3滴吡啶加到反应混合物中。将反应混合物搅拌40分钟。后处理之后，通过色谱层析法使用5％MeOH/CH₂Cl₂作为洗脱溶剂将该混合物纯化。获得目标化合物收率48％(160mg)。UV-可见光，λ_max(CH₂Cl₂)，nm(ε)：672nm(4.65×10⁴)，552nm(1.69×10⁴)，418nm(11.1×10⁴).¹HNMR(CDCl₃；400MHz)：δ10.02(br，s，-COOH)，7.23-6.53(m，2H，two meso-protons)，5.87(br，1H，3¹-H)，5.26(m，1H，13²-CH₂)，5.09(m，1H，13²-CH₂)，4.53-4.42(m，1H，18H)， 4.35-4.27(m，1H，17H)，3.73-3.47(m，7H，2H for3¹-OCH₂(CH₂)₄CH₃，2H for8-CH₂CH₃，3H for7-CH₃)，3.37(m，3H，2-CH₃)，3.25(m，3H，12-CH₃)，2.74-2.65(m，1H，17¹-H)，2.64-2.53(m，1H，17¹-H)，2.18-2.14(m，2H，17²-H)，2.10(m，3H，3²-CH₃)，1.79(m，3H，18-CH₃)，1.71-1.58(m，8H，3H for8-CH₂CH₃，3H for Ar-CH₃，2H for3¹-OCH₂CH₂(CH₂)₃CH₃)，1.38-1.29(m，6H，3¹-O(CH₂)₂(CH₂)₃CH₃)，0.71(m，3H，3¹-OCH₂(CH₂)₄CH₃).Mass calcd for C₃₉H₄₇BrN₄O₄：714.3，found：715.32(MH). 

步骤2、化合物5的制备： 

将化合物4(120mg，0.17mmol)、4-(叔丁氧羰基)苯基硼酸频哪醇酯(1551mg，5.1mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(79mg，0.068mmol)和磷酸钾(408mg，3.4mmol)溶解在50mL无水四氢呋喃THF中，将反应混合物回流20小时； 

后处理之后，通过色谱层析法使用10％MeOH/CH₂Cl₂作为洗脱溶剂将该混合物纯化； 

将获得的化合物溶解在约20mL CH₂Cl₂中，然后加入约12mL三氟乙酸TFA，在氩气下搅拌2小时；后处理之后，通过10％MeOH/CH₂Cl₂纯化化合物，获得目标化合物5收率40％(51.5mg)。 

UV-可见光，λ_max(CHCl₃)，nm(ε)：670nm(4.45×10⁴)，551nm(1.61×10⁴)，416nm(10.5×10⁴). 

¹HNMR(CDCl₃；400MHz)：δ9.51(br，s，-COOH)，7.89(m，2H，two meso-protons)，7.04(m，2H，Ar-H)，6.82(m，2H，Ar-H)，5.81(br，1H，3¹-H)，5.28(m，1H，13²-CH₂)，5.11(m，1H，13²-CH₂)，4.53-4.44(m，1H，18H)，4.36-4.27(m，1H，17H)，3.74-3.46(m，7H，2H for3¹-OCH₂(CH₂)₄CH₃，2H for8-CH₂CH₃，3H for7-CH₃)，3.39(m，3H，2-CH₃)，3.24(m，3H，12-CH₃)，2.75-2.67(m，1H，17¹-H)，2.65-2.52(m，1H，17¹-H)，2.20-2.16(m，2H，17²-H)，2.11(m，3H，3²-CH₃)，1.77(m，3H，18-CH₃)，1.72-1.59(m，8H，3H for8-CH₂CH₃，3H for Ar-CH₃，2H for3¹-OCH₂CH₂(CH₂)₃CH₃)，1.37-1.27(m，6H，3¹-O(CH₂)₂(CH₂)₃CH₃)，0.74(m，3H，3¹-OCH₂(CH₂)₄CH₃).Mass calcd for C₄₆H₅₂N₄O₆：756.4，found：756.75. 

步骤3、化合物6的制备： 

将化合物5(112mg，0.148mmol)、BOP(408mg，0.92mmol)、胸苷(2520mg，10.36mmol)和三乙胺(约1.0mL)溶解在约15mL的无水DMF中，将反应混合物搅拌过夜；在高真空下除去DMF之后，通过色谱层析法使用5％MeOH/CH₂Cl₂作为洗脱溶剂纯化该混合物，获得目标化合物收率41％(73mg)。UV-可见光，λ_max(CHCl₃)，nm(ε)：671nm(4.46×10⁴)，553nm(1.63×10⁴)，416nm(10.7×10⁴).¹HNMR(CDCl₃；400MHz)：8.46(m，2H，2x ArH)，7.89(m，2H，two meso-protons)，7.18-7.05(m，6H，2x)，7.04(m，2H，Ar-H)，6.82(m，2H，Ar-H)，5.81(br，1H，3¹-H)，5.28(m，1H，13²-CH₂)，5.11(m，1H，13²-CH₂)，4.53-4.44(m，1H，18H)，4.36-4.27(m，1H，17H)，4.14-4.00 (m，2H，2x)，3.97-3.83(m，2H，2x)，3.74-3.46(m，7H，2H for3¹-OCH₂(CH₂)₄CH₃，2H for8-CH₂CH₃，3H for7-CH₃)，3.39(m，3H，2-CH₃)，3.24(m，3H，12-CH₃)，2.75-2.67(m，1H，17¹-H)，2.65-2.52(m，1H，17¹-H)，2.38-2.26(m，4H，2x)，2.20-2.16(m，2H，17²-H)，2.11(m，3H，3²-CH₃)，1.77(m，3H，18-CH₃)，1.72-1.59(m，8H，3H for8-CH₂CH₃，3H for Ar-CH₃，2H for3¹-OCH₂CH₂(CH₂)₃CH₃)，1.37-1.27(m，6H，3¹-O(CH₂)₂(CH₂)₃CH₃)，0.74(m，3H，3¹-OCH₂(CH₂)₄CH₃).Mass calcd for C₆₆H₇₆N₈O₁₄：1204.55，found：1205.67(MH). 

实施例3：含额外N杂环的靶向胸苷激酶光敏剂的制备 

制备线路： 

具体如下： 

将3-(1-(正丁氧基)乙基)红紫素-18-N-丁酰胺-17-丙酸7(120mg，0.173mmol)、BOP(169mg，0.38mmol)、胸苷(1050mg，4.32mmol)和三乙胺(about0.5mL)溶解在约15mL无水DMF中，将反应混合物搅拌过夜；在高真空下除去DMF之后，通过色谱层析法使用5％MeOH/CH₂Cl₂作为洗脱溶剂纯化混合物，获得目标化合物收率51％(80mg)。UV-可见光，λ_max(MeOH)，nm(ε)：699nm(4.51×10⁴)，642(7.31×10³)，543(1.79×10⁴)，507(7.29×10³)，413(12.52×10⁴).¹HNMR(CDCl₃；400MHz)：δ9.79，(s，1H，H-5)，9.66(s，1H，H-10)，8.53(s，1H，H-15)，7.21(s，1H，ArH)，7.03(m，1H，)，6.80(m，3H，)，6.22(m，3H，)，5.80(q，J＝6.5Hz，1H，3¹-H)，5.37(m，2H，-NCH₂(CH₂)₂CH₃)，4.52-4.41(m， 1H，18H)，4.34-4.26(m，1H，17H)，4.14-4.00(m，1H，)，3.97-3.83(m，1H， )，3.71-3.49(m，7H，2H for3¹-OCH₂(CH₂)₂CH₃，2H for8-CH₂CH₃，3Hfor7-CH₃)，3.35(s，3H，2-CH₃)，3.23(s，3H，12-CH₃)，2.73-2.63(m，1H，17¹-H)，2.62-2.51(m，1H，17¹-H)，2.38-2.26(m，2H，)，2.19-2.13(m，2H，17²-H)，2.09(d，J＝6.5Hz，3H，3²-CH₃)，1.78(d，J＝7.5Hz，3H，18-CH₃)，1.70-1.57(m，8H，3H for8-CH₂CH₃，3H for Ar-CH₃，2H for3¹-OCH₂(CH₂)₂CH₃)，1.39-1.30(m，6H，3¹-O(CH₂)₂(CH₂)₃CH₃)，1.07(t，J＝10Hz，3H，-NCH₂(CH₂)₂CH₃)，0.88(t，J＝9.8Hz，3H，3¹-OCH₂(CH₂)₄CH₃).质谱理论值：C₅₁H₆₃N₇0₉：917.47，实测值：918.5(MH).。 

实施例4：HPPH，HPPH-胸苷轭合物以及HPPH-胸苷轭合物联用化疗剂紫杉醇在体外的PDT疗效比较 

本发明采用体外光细胞毒性试验比较HPPH，HPPH-胸苷轭合物以及HPPH-胸苷轭合物联用化疗剂紫杉醇在体外的PDT疗效。 

实验方法：选用具有高度转移性和依赖雄性激素的前列腺癌细胞-PC3细胞系，在37℃，CO₂含量为5％而空气含量为95％和湿度100％的条件下，将PC3系细胞培养于含10％胎牛血清、L-谷酰胺、青霉素、链霉素的RPMI1640培养液中；然后将PC3系细胞接种于96孔板的完全培养基中，每个孔板接种5×10³个细胞，设6个复孔；在37℃隔夜培养后，用梯度浓度的光敏剂或紫杉醇在黑暗中处理24小时；对于HPPH-胸苷轭合物与紫杉醇联用的治疗法，曝光前8小时另注射紫杉醇，紫杉醇和光敏剂浓度均进行等同的梯度浓度设置。 

用新鲜培养基替换含药培养基，通过氩泵染料激光器发射的665nm、剂量率3.2mW/cm²的光照射该细胞。 

经PDT疗法或单用紫杉醇处理后，在37℃下，将细胞于黑暗中培养48小 时，光毒性(其试品同未经处理的细胞进行相对存活量的比较)由MTT法测定，同时形成细胞的应答剂量存活曲线，每个数据点取3次单独实验的平均值，其误差线为标准偏差。统计实验结果见图3。其中，各处理中所用为化合物3即HPPH-胸苷轭合物的浓度均为0.06μM，化合物1即HPPH的浓度亦为0.06μM，紫杉醇浓度为2nM。 

由图3结果可见HPPH-胸苷轭合物的PDT疗效同比均高于HPPH，HPPH-胸苷轭合物与紫杉醇的联用进一步提高了疗效：用最少有效剂量(2nM)的紫杉醇对细胞进行预处理，药物3(即HPPH-胸苷轭合物)PDT治疗时IC₅₀的光照剂量明显从0.13J/cm²减少到0.067J/cm²(P＜0.001)。另外，通过DAPI染色法对形态学上变化的评价，得出如下结论：紫杉醇根据凋亡机制进行细胞预处理，诱导细胞死亡。 

另一方面，进一步的实验发现，紫杉醇预处理后，再用药物3作光敏剂(浓度为0.003μM和光照剂量设定为0.25J/cm²)对细胞进行处理同样会增加紫杉醇对细胞的毒性：在这低浓度的药物和光剂量的作用下，PDT本身并不能杀死癌细胞，但它能降低细胞的存活率，紫杉醇(0.0007μM)条件下，细胞的存活率百分比从100％降低到80％。 

实施例5：本发明实施例2、3的光敏剂的体外PDT疗效 

采用体外光细胞毒性试验在体外PC-3(人前列腺癌)细胞系中测定比较下述化合物的体外PDT疗效。实验方法同实施例4，先将PC3细胞涂覆到96孔板中并让其附着到孔板上6-24hr，接着使细胞被各种浓度的PDT光敏剂化合物处理24hr，之后再在675nm(剂量率3.2mW/cm²)或703nm(剂量率3.2mW/cm²)以各种高剂量照射；48小时后使用比色测定评估细胞的生长，其中将MTT法产生的不溶的formazan产物溶解并且在570nm通过光密度测定其浓度。 

675nm处理结果如图4所示，其中PLH-14为实施例2中的化合物5，PLH-13为实施例2中的化合物6即化合物5的胸苷轭合物，PLH-13和PLH-14浓度均为0.7μM；703nm处理结果如图5所示，其中277-COOH为实施例3中的化合物7，PLH-12为实施例3中的化合物8即化合物7的胸苷轭合物，277-COOH和PLH-12浓度均为0.05μM。由图4和图5可见，化合物5、化合物6、化合物7和化合物8与胸苷轭合，提高了光敏剂的体外PDT疗效。 

实施例6：HPPH，HPPH-胸苷轭合物以及HPPH-胸苷轭合物联用紫杉醇在体内的PDT疗效比较 

采用检测光敏剂体内活性的方法，通过具有PC3系肿瘤细胞(尺寸4×4mm)的Scid小鼠实验来确定HPPH，HPPH-胸苷轭合物及HPPH-胸苷轭合物联用紫杉醇在体内的相对疗效。 

实验方法：给予小鼠皮下注射3×10⁵个肿瘤细胞，让细胞增长至其直径达4-5mm。在激光光照前一天，接种位点的毛发需被全部去除，该小鼠通过静脉注射不同浓度的光敏剂。在注射光敏剂(如化合物1或3)24小时后，小鼠未麻醉，通过塑料圈限制其活动，然后设定氩泵染料激光器单色仪，将发射波长调谐到药物激活波长后进行光处理；其中，对联用治疗实验组，紫杉醇是要在曝光前8小时另注射的。治疗所需的参数包括1cm²直径大小、积分通量率为75mW/cm²和总光剂量为135J/cm²。 

每日观察小鼠是否有体重减轻、坏死性炉瘤形成或肿瘤复发迹象。如果观察到肿瘤生长，则使用两个正交测量值L和W(垂直于L)测定，被测肿瘤体积可用公式V＝(L×W²)/2计算和记录。如果通过PDT治疗60天后无再生迹象，则可认为该小鼠被治愈。每一浓度对应每组十只小鼠。 

本实验所用HPPH、HPPH-胸苷轭合物的剂量均为0.5μmol/kg，曝光前8小时另注射紫杉醇的单剂量为35mg/kg，光照为：665nm、135J/cm²、75mW/cm²。进行为期60天的肿瘤复发再生监测，结果如图6，可通过此公式简单计算小鼠治愈率：肿瘤未再生的小鼠数量×100％除以小鼠总数，例如，给予化合物3即本发明的HPPH-胸苷轭合物60天后，有5只小鼠肿瘤未再生，而每组小鼠总数为10只，则肿瘤治愈率为5×100％/10，即50％。 

由图6可知，HPPH治愈率30％(3/10小鼠60天肿瘤未见复发)，而与HPPH相比，等当量的胸苷类似物治愈率达到50％(5/10小鼠60天肿瘤未见复发)；另外，HPPH-胸苷轭合物与紫杉醇的联用进一步提高了PDT法的体内疗效，60天后7/10的小鼠肿瘤消失(未见复发)。 

实施例7：HPPH-胸苷轭合物的荧光成像性能 

采用荧光成像实验检测HPPH-胸苷轭合物的荧光成像性能 

荧光成像实验的原理：体内荧光成像是通过的二元光照系统来实现的 (Lightools Research，Encinitas，CA)，该系统专为研究小动物而设计。真彩色荧光成像是通过使用绝缘的长型过滤器(Chroma Tech)和一个彩色数码摄像机(Optronics，Magnafire SP，Olympus America)来获得。波长分辨频谱成像的方法是通过使用一个包含光学头的Nuance多谱成像系统(CRI，Inc.，Woburn，MA)来实现的，该系统包括Varispec液晶可调谐滤波器(LCTFs，带宽为20nm、扫描波长范围为400-720nm)、一个光耦合器和高分辨率CCD摄像机，还附带包含图像采集与分析软件。相机在每个固定曝光波长下捕捉图像时，可调谐滤波器会自动以10nm的幅度从550nm增加到720nm。产生的27幅TIFF图像会被输入内存中的一个单独的数据结构，每个像素叠加形成光谱。自荧体光谱和光敏剂(PS)荧光光谱是通过使用电脑鼠标选择合适区域来手动选择得到的光谱图像。光谱混合离析算法(由CRI公司提供)可运用于纯的自体荧光和PS荧光信号分离图像的形成。利用图像分析软件Image J再次分析所有的图像可得假色荧光反射(FRI)图像。 

实验方法： 

依据IACUC规定的法案，给予联合免疫缺陷(Scid)鼠皮下注射50μL由RPMI-1640免疫血清培养基培养的1×10⁶Colon26cell(结肠癌26细胞，于右侧后腋下)，并让肿瘤生长至其直径达到4-5mm。在注射光敏剂PS前一天，清除小鼠接种位点的毛发并对其进行全身麻醉后成像(腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪混合物)。在一个黑盒子里，由光纤照明设备提供540/40xnm(绿光)光照，并通过长型过滤器滤过散射光且只让667nm的Stoke-shifted PS荧光通过。在等同条件下，老鼠分别在注射化合物3后的24小时和48小时成像(治疗剂量为0.5μmol/kg或1μmol/kg)。 

参照上述方法，本实验给患有前列腺癌的小鼠(3只小鼠/组)注射HPPH-胸苷轭合物的量为0.5μmol/kg，其体内的PC3系肿瘤细胞分别在注射后的4h、14h、24h和48h各时间变化点成像(电子吸收光谱法，激发波长：665nm，发射波长：710-720nm)。结果见图7。 

由图7可知：本发明所述HPPH-胸苷轭合物具有良好的成像性能(荧光性)，注射该药物24h后能够获得最好的肿瘤吸收/成像效果，肿瘤块显示得最完整、集中、清楚，这种特性能够帮助前列腺癌和其他癌症进行成像引导治疗。