用种子代谢物含量鉴定粳籼稻品种的方法

摘要

本发明提供了一种用种子代谢物含量鉴定粳籼稻品种的方法；其以水稻种子中天冬酰胺和丙氨酸重量百分比含量的比值高低来鉴定粳稻和籼稻品种。具体以籼稻品种广陆矮4号种子中天冬酰胺和丙氨酸重量百分比含量的比值作为参考值，在相同的测试条件下，若待测品种种子中天冬酰胺和丙氨酸重量百分比含量的比值大于参考值，则判断待测品种为籼稻，若待测品种种子中天冬酰胺和丙氨酸重量百分比含量的比值小于参考值，则判断待测品种为粳稻。本发明首次提出用种子中天冬酰胺和丙氨酸重量百分比含量的比值作为鉴定粳籼稻的方法，该方法对水稻功能基因组研究及粳籼稻分化研究具有重要的指导作用，也可以促进粳籼稻杂交育种及物种对环境适应等方面的科学研究。

说明书

技术领域

本发明属于生物鉴别技术领域；具体涉及一种用种子代谢物含量鉴定粳籼稻品种的 方法。

背景技术

水稻是世界上50％以上人口的主食。栽培稻由一个共同的祖先野生稻(Oryza  rufipogon)驯化而来，在自然选择和人工选择双重作用下，栽培稻呈现出成千上万种 具有显著遗传差异的品种。当前，主要栽培稻有两大亚种，即粳稻(Oryza sativa L. subsp.Japonica Kato)和籼稻(Oryza sativa L.subsp.Indica Kato)，典型的粳 稻和籼稻之间存在着明显的生殖隔离。一般来说，粳稻品种适合在高纬度或者高海拔的 温带地区种植，而籼稻品种适合在低纬度或者低海拔的热带或者亚热带地区种植。为了 适应不同的生态环境，粳稻和籼稻在形态(例如叶片和种壳上毛的长度及分布和种子的 长宽比)、生理生化特性(例如耐寒耐热性、酚反应)及品质方面(例如米质粘性)都 存在显著地差异。正因为两个亚种存在显著的表型和遗传差异，利用两者之间的强大的 杂种优势，对杂交水稻育种具有重大的应用价值。

鉴定粳稻和籼稻的传统方法是“程式法”：包括稃毛的长度及在种壳的分布情况、 酚反应后种子的颜色变化、叶毛的分布、种壳的颜色、穗节的长短和种子的长宽比。近 年来出现了应用分子标记同工酶进行粳籼稻鉴定的方法。随着代谢组学的逐步发展，也 出现了利用糙米中的棉籽糖含量来区分粳籼稻品种的方法。

但是，至今为止未曾有人发现过粳籼稻品种中天冬酰胺和丙氨酸含量的比值存在显 著差异，并且利用这个特征来进行粳籼稻的区分。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用种子代谢物含量鉴定粳籼稻品种的方法，具体地说， 是一种利用种子中天冬酰胺和丙氨酸重量百分比含量的比值鉴定粳稻和籼稻的方法。其 原理是利用粳、籼稻种子中天冬酰胺和丙氨酸重量百分比含量比值的差异来区分粳稻和 籼稻品种。本发明研究人员经过大量的分析研究，发现粳稻种子中天冬酰胺和丙氨酸重 量百分比含量的比值显著低于籼稻种子中两者重量百分比含量的比值，并发现可以以籼 稻品种广陆矮4号中天冬酰胺和丙氨酸重量百分比含量的比值作为一个临界点，来鉴别 粳籼稻品种。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种用种子代谢物含量鉴定粳籼稻品种的方法，以水稻种子中天冬酰胺 和丙氨酸重量百分比含量比值的高低来鉴定粳稻和籼稻品种。

优选地，以籼稻品种广陆矮4号中天冬酰胺和丙氨酸重量百分比含量比值作为参照 值，待测品种种子中天冬酰胺和丙氨酸重量百分比含量比值大于所述参照值的，判断为 籼稻品种，该比值小于所述参照值的，判断为粳稻品种。广陆矮4号是水稻品种一个骨 干亲本，在杂交育种中被广泛应用，属于典型的籼稻品种，其种子可以从种子公司购得。 其中天冬酰胺和丙氨酸都属于组成蛋白质的20种标准氨基酸。天冬酰胺属于不带电荷 的极性氨基酸，其分子式为C₄H₈N₂O₃，相对分子质量为132.12。丙氨酸属于非极性的脂 肪族氨基酸，其分子式为C₃H₇O₂N，分子量为89.09。

优选地，所述方法具体包括如下步骤：

A、检测籼稻品种广陆矮4号中天冬酰胺和丙氨酸重量百分比含量的比值，将其设 为参照值；

B、以与步骤A相同的检测条件，检测待测品种种子中天冬酰胺和丙氨酸重量百分 比含量比值；将其与所述参照值进行比较，该比值大于所述参照值的，判断为籼稻品种， 该比值小于所述参照值的，判断为粳稻品种。

种子中代谢物含量的检测方法有多种，用不同的处理手段和检测方法检测同一个样 品中的天冬酰胺和丙氨酸重量百分比含量会有很大差异，所以必须以同一条件下的广陆 矮4号作为参照。因此，在鉴定待测样品过程中，以同等条件下以广陆矮4号作为参考 样品进行检测，如果待测样品中天冬酰胺和丙氨酸的重量百分比比值大于广陆矮4号中 对应的比值时，则判断待测样品为籼稻，如果待测样品中天冬酰胺和丙氨酸重量百分比 的比值小于广陆矮4号中对应的比值时，则判断待测样品为粳稻。

优选地，所述天冬酰胺和丙氨酸重量百分比含量比值的检测方法为GC-MS法(气相 色谱-质谱联用)或LC-MS法(液相色谱-质谱联用)。

优选地，检测前水稻种子的处理方法具体为：将水稻种子晒干，低温条件下(液氮) 磨粉，-80℃保存备用。

优选地，检测前还包括如下步骤：将所述保存备用的水稻种子粉加水和有机溶剂进 行提取。

优选地，所述有机溶剂为氯仿、乙腈、乙酸乙酯或甲醇。

本发明研究人员利用粳籼稻品种种子中天冬酰胺和丙氨酸含量的比值差异显著的 特征，对水稻品种所属的亚种类型进行鉴定。本发明具有如下有益效果：

1、该方法操作方便，快捷高效。

2、该方法只要以种子为材料，不需要种植植株，耗时短。

3、鉴别过程中用样量少。

4、本发明首次提出用种子中天冬酰胺和丙氨酸重量百分比含量的比值作为鉴定粳 籼稻的方法，该方法对水稻功能基因组研究及粳籼稻分化研究具有重要的指导作用，也 可以促进粳籼稻杂交育种及物种对环境适应等方面的科学研究。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人 员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技 术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于 本发明的保护范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件和说 明书的要求，例如GC-MS(气质联用)，LC-MS(液质联用)等常规的化学含量检测方法。

实施例

本实施例采用GC-MS的方法检测水稻种子样品中天冬酰胺和丙氨酸的重量百分比 含量，具体见表1；发现粳稻和籼稻品种之间天冬酰胺和丙氨酸的重量百分比含量的比 值具有显著差异，选定广陆矮4号作为临界值对照品种。

表1 实施例所用实验材料类型及天冬酰胺和丙氨酸的重量百分比含量的比值

序号 水稻品种 来源 亚种类别 天冬酰胺/丙氨酸 1 扬稻6号/9311 江苏 籼稻 15.32 2 青二矮 广东 籼稻 12.69 3 矮脚南特 广东 籼稻 12.18 4 特三矮2号 广东 籼稻 11.37

5 叶青伦 广东 籼稻 11.19 6 湘晚籼13号 湖南 籼稻 10.94 7 丰澳占 广东 籼稻 10.44 8 华新占 广东 籼稻 10.23 9 低脚乌尖 台湾 籼稻 9.78 10 浙733 浙江 籼稻 9.56 11 广场13 广东 籼稻 9.34 12 台中在来1号 台湾 籼稻 9.18 13 桂朝2号 广东 籼稻 8.86 14 矮仔占 广西 籼稻 8.80 15 粤香占 广东 籼稻 8.71 16 IR26 菲律宾 籼稻 8.55 17 多系1号 四川 籼稻 8.52 18 特青 广东 籼稻 8.34 19 长丝占 广东 籼稻 8.34 20 CDR22 四川 籼稻 8.21 21 珍珠矮11号 广东 籼稻 8.08 22 IR8 菲律宾 籼稻 7.98 23 嘉育293 浙江 籼稻 7.97 24 IR661-1 菲律宾 籼稻 7.82 25 广场矮3784 广东 籼稻 7.36 26 丰矮占1号 广东 籼稻 7.36 27 明恢86 福建 籼稻 7.27 28 密阳23 韩国 籼稻 7.04 29 BG90-2 斯里兰卡 籼稻 7.00 30 浙辐802 浙江 籼稻 7.00 31 扬辐糯4号 江苏 籼稻 6.96 32 陆财号 福建 籼稻 6.80 33 青丰矮 广东 籼稻 6.79

34 湘晚籼5号 湖南 籼稻 6.29 35 成恢448 四川 籼稻 5.90 36 IR24 菲律宾 籼稻 5.87 37 密阳46 韩国 籼稻 5.58 38 南特号 江西 籼稻 5.32 39 测64-7 湖南 籼稻 5.23 40 胜利籼 湖南 籼稻 5.09 41 广陆矮4号 广东 籼稻 4.95 42 春江025 浙江 粳稻 3.94 43 秀水134 浙江 粳稻 3.91 44 秀水110 浙江 粳稻 3.90 45 武运粳7号 江苏 粳稻 3.72 46 秋田小町 日本 粳稻 3.59 47 沈农265 辽宁 粳稻 3.49 48 武运粳8号 江苏 粳稻 3.44 49 花优14 上海 粳稻 3.42 50 甬优1号 浙江 粳稻 3.39 51 越光 日本 粳稻 3.13 52 合江23号 黑龙江 粳稻 3.10 53 巴利拉 意大利 粳稻 3.04 54 秀水09 浙江 粳稻 3.03 55 秀水11 浙江 粳稻 2.99 56 京都旭 日本 粳稻 2.90 57 西南175 重庆 粳稻 2.88 58 宝农203 上海 粳稻 2.81 59 苏沪香粳 江苏 粳稻 2.79 60 农垦57 日本 粳稻 2.78 61 农垦58 日本 粳稻 2.67 62 徐稻3号 江苏 粳稻 2.62

63 桂花黄 江苏 粳稻 2.59 64 秀水04 浙江 粳稻 2.56 65 镇稻88 江苏 粳稻 2.56 66 甬粳44 浙江 粳稻 2.51 67 广陵香糯 江苏 粳稻 2.50 68 西湖明珠 浙江 粳稻 2.50 69 沈稻2号 辽宁 粳稻 2.49 70 香粳111 江苏 粳稻 2.40 71 黄金晴 日本 粳稻 2.38 72 南粳11 江苏 粳稻 2.36 73 辽粳9号 辽宁 粳稻 2.34 74 宁粳12号 宁夏 粳稻 2.32 75 江洲香糯 江苏 粳稻 2.24 76 太湖糯 江苏 粳稻 2.20 77 扬粳4038 江苏 粳稻 2.06 78 秀水24 浙江 粳稻 2.05 79 双丰1号 上海 粳稻 1.92 80 沪旱3号 上海 粳稻 1.86 81 镇稻2号 江苏 粳稻 1.82 82 日本晴 日本 粳稻 1.81 83 申优254 上海 粳稻 1.72 84 秀水63 浙江 粳稻 1.66 85 宝农219 上海 粳稻 1.57 86 秀水223 浙江 粳稻 1.13

利用GC-MS对水稻种子进行代谢组学分析，按照常规的方法进行前处理、定性和定 量，最后以标样验证。样品晒干，液氮下磨粉，称出40mg粉末，加适量体积超纯水， 震荡悬浮，吸取悬浮液100μl至96深孔板中，加入适量甲醇提取液(包含4种不同标 准样品)用于沉淀样品中的蛋白质，使用Geno/Grinder 2000(Glen Mills INC.，Clifton， NJ)680r/min振荡2min，振荡结束后2800r/min离心8min，吸取三上清。样品用氮气 吹干仪吹干，然后放入冷冻抽干机抽干24h。对样品进行衍生化处理。衍生之后的样品 通过气相色谱质谱(Thermo-Finnigan Trace DSQ快速扫描单四级杆质谱)检测，使用 的柱子是20m×0.18mm，含有5％的苯，扫描温度在16分钟以内从40℃上升到300℃， 载气为氮气，质谱扫描范围为50～750amu。

本实施例共用了86个来自国内和国外的水稻品种，检测到了121个准确的化合物， 并根据常规的“程式法”对这86个品种进行了粳籼稻分类。经过以上实验，发明人发 现一个规律，籼稻品种种子中天冬酰胺和丙氨酸的重量百分比含量比值都显著高于粳稻 品种。还发现广陆矮4号种子中天冬酰胺和丙氨酸的比值与粳籼稻品种该比值差异的临 界值接近，所以本发明把籼稻品种“广陆矮4号”用作参考品种。根据天冬酰胺和丙氨 酸的重量百分比含量比值来鉴定粳籼稻的结果与用传统形态指标鉴定的结果一致。上述 试验结果说明了本发明方法的可行性和可靠性，是区分粳稻和籼稻品种的一种有效方 法。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特 定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影 响本发明的实质内容。