一种同时测定复配制剂中甲基托布津和醚菌酯的含量的高效液相色谱分析方法

摘要

本发明属于分析技术领域，具体涉及一种同时测定复配制剂中甲基托布津和醚菌酯的含量的高效液相色谱分析方法，该方法采用流动相为甲醇的体积分数为60%至80%的甲醇与水的混合溶液，柱箱温度为10-50℃，流动相流速为1ml/min，每次样品的进样体积为5微升，在检测波长为245-275nm的范围内可以实现杂质峰与主峰分离完全，色谱峰形好，积分计算结果准确、重复性好，分析快速，所得的结果可信度高，特别适用于农药制剂产品中甲基托布津和醚菌酯有效成分的质量控制，满足高质量的质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯复配制剂的生产要求。

说明书

技术领域

本发明属于分析技术领域，具体涉及一种同时测定复配制剂中甲基托布津和醚菌酯的含量的高效液相色谱分析方法。 

背景技术

甲基托布津是一种广谱性内吸低毒杀菌剂，能防治多种作物病害，具有内吸、预防和治疗作用，能具体防治麦类黑穗病、赤霉病；水稻稻瘟病、纹枯病；棉花病害；瓜类白粉病、炭疽病、灰霉病；菜豆灰霉病害等。醚菌酯是一种高效、广谱、新型杀菌剂，对半知菌、子囊菌、担子菌、卵菌纲等真菌引起的多种病害具有很好的活性，对葡萄白粉病、马铃薯疫病、水稻稻瘟病等病害，特别对草莓白粉病、甜瓜白粉病、黄瓜白粉病、梨黑星病有特效。 

甲基托布津和醚菌酯复配制剂是由甲基托布津和醚菌酯两种杀菌剂混配而成，具有高效、广谱的杀菌活性，兼具有良好的预防、保护和治疗作用。与其它常用的杀菌剂无交互抗性，且比常规杀菌剂持效期长，具有高度的选择性，对作物、人畜及有益生物安全，对环境基本无污染。在甲基托布津和醚菌酯复配制剂的生产过程中因沾釜、结晶、高温分解等原因会造成实际含量与理论含量不相符，因此对于有效成分甲基托布津和醚菌酯的含量是在复配过程中需要严格控制的；有效成分含量低，在使用过程中起不到应有的药效；有效成分含量高，会使土壤中残留大量的甲基托布津和醚菌酯，不但污染了土壤环境，同时对后茬多种敏感作物造成药害。因此，生产中急需一种快速、有效、准确的测定方法，来确定有效成分甲基托布津和醚菌酯的准确含量。 

现有技术中测定甲基托布津、醚菌酯的含量的方法主要有气相色谱法、络合滴定法、分光光度法等，其中气相色谱法中进样室和色谱柱的高温会破坏甲基托布津和醚菌酯两种有效成分，络合滴定法、分光光度法技术中样品前处理的过程较为繁琐，比较费时费力。 

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种同时测定复配制剂中甲基托布津和醚菌酯的含量的高效液相色谱分析方法，专属性强，精密度好，回收率高，特别适用于农药制剂产品中甲基托布津和醚菌酯有效成分的质量控制，满足高质量的质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯复配制剂的生产要求。 

本发明同时测定复配制剂中甲基托布津和醚菌酯的含量的高效液相色谱分析方法，其具体步骤是： 

（1）标准溶液的配制 

分别称取甲基托布津、醚菌酯标样，依次加入到容量瓶中，加入有机溶剂，超声震荡，以便使得标样与有机溶剂混合均匀，标样溶解后冷却至室温，用有 机溶剂定容，所得标样溶液的甲基托布津、醚菌酯的浓度分别为500mg/l、125mg/l，在操作中所配置的标样溶液的甲基托布津、醚菌酯的浓度分别在500-505mg/l、125-130mg/l之间都可以； 

所述的步骤（1）和步骤（2）中的有机溶剂是甲醇、乙腈、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯的一种或几种混合液，优选甲醇，所选用的有机溶剂既能溶解甲基托布津和醚菌酯又不与其反应。 

（2）试样溶液的配制 

称取试样，加入到容量瓶中，加入有机溶剂，超声震荡，以便使得试样与有机溶剂混合均匀，试样溶解后冷却至室温，用有机溶剂定容，采用规格为0.22μm有机滤膜过滤后待测； 

所述的试样是甲基托布津和醚菌酯复配制剂所述的复配制剂，特别是标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯复配制剂，采用本方法可以用来测定生产的试样是否满足以上质量分数的要求，从而时刻监测实际生产，保证高质量40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯复配制剂的生产； 

所述的试样是水剂、乳油、微乳剂和悬浮剂中的一种； 

采用规格为0.22μm有机滤膜过滤是为了除去试样中一些微小的固体不溶物及纤维物质，以避免堵塞色谱柱和进样阀，对色谱柱和仪器起到保护作用，同时消除不溶性杂质对分析结果的影响，使得分析结果更准确，通过过滤，除去了复配制剂中的不溶性杂质，而除有效成分甲基托布津和醚菌酯之外的其他可溶性杂质，在所述检测条件下能够使得杂质与甲基托布津和醚菌酯达到基线分离，从而确保分析结果的准确性。 

（3）测定与数据处理 

将步骤（2）的待测样品使用不同极性的高效液相色谱柱，流动相为甲醇的体积分数为60%至80%的甲醇与水的混合溶液，柱箱温度为10-50℃，优选柱箱温度为室温，这可以保证流动相在流过柱子洗脱样品时，流动相和柱子之间的温差不会太大，不会因为温度的不同导致峰变形；流动相流速为1ml/min，每次样品的进样体积为5微升，这样能保证各样品有良好的响应，检测波长为245-275nm的色谱条件下，采用二极管阵列检测器，仪器基线稳定后按标样、试样、试样、标样的顺序依次进样，先设定好测试条件，在此测试条件下平衡半个小时，待基线走平、仪器平稳、色谱柱平衡好时，进样，先进一针标样，待甲基托布津和醚菌酯都洗脱出来后停止方法运行，然后再进一针试样，待甲基托布津和醚菌酯都洗脱出来后停止方法运行；接着进一针试样，待甲基托布津和醚菌酯都洗脱出来后停止方法运行，然后再进一针标样，待甲基托布津和醚菌酯都洗脱出来后停止方法运行；分别对标样和试样中的甲基托布津和醚菌酯峰面积进行平均，得其峰面积平均值； 

按照下式对甲基托布津和醚菌酯的质量分数进行计算： 

$X_1=\frac{A_2·m_1·P_1}{A_1·m_2}$

式中 

A₁——标样中，甲基托布津/醚菌酯峰面积的平均值； 

A₂——试样中，甲基托布津/醚菌酯峰面积的平均值； 

m₁——甲基托布津/醚菌酯的质量； 

m₂——甲基托布津/醚菌酯的质量； 

P₁——标样中甲基托布津/醚菌酯的质量分数； 

X₁——试样中甲基托布津/醚菌酯的质量分数。 

为了达到更好的检测效果和准确度，开启机器自检通过后，在规定的操作条件下，仪器基线稳定后连续注入数针标样，计算各针相对响应值，达到相邻两针相对响应值变化小于1.0%时再进行依次进样，这样可以有效的降低由于仪器开机后的不稳定而造成的误差，提高最终检测结果的准确度。 

该过程，由于甲基托布津在色谱柱中的保留行为要弱于醚菌酯，因此甲基托布津先被洗脱出来，醚菌酯后洗脱出来；所述的流动相优选甲醇的体积分数为75%的甲醇与水溶液的混合溶液，这样可以使目标分析物与其他杂质得到基线分离且分析时间在可接受的时间范围内；所述的不同极性的高效液相色谱柱是硅胶柱或C8柱或C18柱，优选C18柱，选用C18柱可以使混合物在很短时间内就能达到很好的分离，使其拥有出色的峰型，并且具有很好的操作一致性，且能保证在低压使用时，达到很高的柱效；所述的检测波长为245-275nm，在这个波长范围内，能够使得甲基托布津和醚菌酯与杂质达到基线分离，所述检测波长优选275nm，在此波长下，甲基托布津和醚菌酯的紫外吸收最佳，其它杂质基本无吸收。 

综上所述，本发明提供了一种同时测定复配制剂中甲基托布津和醚菌酯的含量的方法，填补了现有技术中相应领域的技术空白，避免了气相色谱法中进样室和色谱柱的高温会破坏甲基托布津和醚菌酯两种有效成分，样品的处理过程简单，采用本发明检测复配制剂中甲基托布津、醚菌酯含量，可以实现杂质峰与主峰分离完全，色谱峰形好，积分计算结果准确、重复性好，分析快速，只需一次进样，即可在20分钟内快速同时测出甲基托布津、醚菌酯的含量，所得的结果可信度高，特别适用于农药制剂产品中甲基托布津和醚菌酯有效成分的质量控制，对于高质量的质量分数40%甲基托布津、质量分数10%醚菌酯复配制剂的实际生产的质量控制，具有重要意义。 

具体实施方式

下面结合具体实施案例对发明作进一步说明，但不作为对发明内容的限制，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。本发明中所用原料均为市售产品。实施过程中所采用的高效液相色谱仪为岛津公司的 LC-20A高效液相色谱仪，配有SIL-20A自动进样器、LC-20AT输液泵、DGU-20A3脱气机、SPD-M20A二极管阵列检测器、CTO-10AS vp柱温箱、LC solution。 

实施例一 

现生产一批标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯水剂，为了检测有效成分甲基托布津和醚菌酯的含量，采用高效液相色谱分析方法对标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯水剂进行分析： 

1.检测条件：Shim pack VP-ODS C18色谱柱：15cm×4.6mm×5μm，理论塔板数3000，流动相：甲醇:水=75:25（V/V），波长为275nm，柱温：室温，流速：1ml/min，进样体积为5微升； 

2.标样溶液的配制 

分别称取50.2mg甲基托布津、12.5mg醚菌酯标样，依次加入到100ml容量瓶中，加入甲醇，超声震荡，标样溶解后冷却至室温，用甲醇定容； 

3.试样溶液的配制 

称取125mg标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯水剂试样，加入到100ml容量瓶中，加入甲醇，超声震荡，试样溶解后冷却至室温，用甲醇定容，采用规格为0.22μm有机滤膜过滤后待测； 

4.测定与数据处理 

开启机器自检通过后，在规定的操作条件下，仪器基线稳定后，连续注入数针标样，计算各针相对响应值，达到相邻两针相对响应值变化小于1.0%时，按标样、试样、试样、标样的顺序依次进样，得数据如下： 

带入公式 

$X_1=\frac{A_2·m_1·P_1}{A_1·m_2}$

计算可得该标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯水剂中 甲基托布津的质量分数为40.1%，醚菌酯的质量分数为10.0%。 

实施例二 

现生产一批标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯乳油，为了检测有效成分甲基托布津和醚菌酯的含量，采用高效液相色谱分析方法对标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯乳油进行分析： 

1.检测条件：Shim pack VP-ODS C18色谱柱：15cm×4.6mm×5μm，理论塔板数3000，流动相：甲醇:水=60:40（V/V），波长245nm，柱温：40℃，流速：1ml/min，进样体积为5微升； 

2.标样溶液的配制 

分别称取50.5mg甲基托布津、12.5mg醚菌酯标样，依次加入到100ml容量瓶中，加入乙腈，超声震荡，标样溶解后冷却至室温，用乙腈定容； 

3.试样溶液的配制 

称取126mg标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯乳油试样，加入到100ml容量瓶中，加入乙腈，超声震荡，试样溶解后冷却至室温，用乙腈定容，采用规格为0.22μm有机滤膜过滤后待测； 

4.测定与数据处理 

开启机器自检通过后，在规定的操作条件下，仪器基线稳定后，连续注入数针标样，计算各针相对响应值，达到相邻两针相对响应值变化小于1.0%时，按标样、试样、试样、标样的顺序依次进样，得数据如下： 

带入公式 

$X_1=\frac{A_2·m_1·P_1}{A_1·m_2}$

计算可得该标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯乳油中甲基托布津的质量分数为40.0%，醚菌酯的质量分数为9.9%。 

实施例三 

现生产一批标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯微乳剂，为了检测有效成分甲基托布津和醚菌酯的含量，采用高效液相色谱分析方法对标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯微乳剂进行分析： 

1.检测条件：Agilent ZORBAX C8色谱柱：25cm×4.6mm×5μm，理论塔板数4000，流动相：甲醇:水=80:20（V/V），波长250nm，柱温：10℃，流速：1ml/min，进样体积为5微升； 

2.标样溶液的配制 

分别称取50.1mg甲基托布津、12.6mg醚菌酯标样，依次加入到100ml容量瓶中，加入正己烷和二氯甲烷的体积比为1:1的混合溶液，超声震荡，标样溶解后冷却至室温，用正己烷和二氯甲烷的体积比为1:1的混合溶液定容； 

3.试样溶液的配制 

称取126mg标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯微乳剂试样，加入到100ml容量瓶中，加入正己烷和二氯甲烷的体积比为1:1的混合溶液，超声震荡，试样溶解后冷却至室温，用正己烷和二氯甲烷的体积比为1:1的混合溶液定容，采用规格为0.22μm有机滤膜过滤后待测； 

4.测定与数据处理 

开启机器自检通过后，在规定的操作条件下，仪器基线稳定后，连续注入数针标样，计算各针相对响应值，达到相邻两针相对响应值变化小于1.0%时，按标样、试样、试样、标样的顺序依次进样，得数据如下： 

带入公式 

$X_1=\frac{A_2·m_1·P_1}{A_1·m_2}$

计算可得该标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯微乳剂中甲基托布津的质量分数为39.9%，醚菌酯的质量分数为9.9%。 

实施例四 

现生产一批标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯悬浮剂，为了检测有效成分甲基托布津和醚菌酯的含量，采用高效液相色谱分析方法对标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯悬浮剂进行分析： 

1.检测条件：Inertsil ODS-SP C18色谱柱：15cm×4.6mm×5μm，理论塔板数3000，流动相：甲醇:水=75:25（V/V），波长260nm，柱温：50℃，流速：1ml/min，进样体积为5微升； 

2.标样溶液的配制 

分别称取50.4mg甲基托布津、12.6mg醚菌酯标样，依次加入到100ml容量瓶中，加入三氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯的体积比为1:1:1:1的混合溶液，超声震荡，标样溶解后冷却至室温，用三氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯的体积比为1:1:1:1的混合溶液定容； 

3.试样溶液的配制 

称取126mg标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯悬浮剂试样，加入到100ml容量瓶中，加入三氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯的体积比为1:1:1:1的混合溶液，超声震荡，试样溶解后冷却至室温，用三氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯的体积比为1:1:1:1的混合溶液定容，采用规格为0.22μm有机滤膜过滤后待测； 

4.测定与数据处理 

开启机器自检通过后，在规定的操作条件下，仪器基线稳定后，连续注入数针标样，计算各针相对响应值，达到相邻两针相对响应值变化小于1.0%时，按标样、试样、试样、标样的顺序依次进样，得数据如下： 

带入公式 

$X_1=\frac{A_2·m_1·P_1}{A_1·m_2}$

计算可得该标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯悬浮剂 中甲基托布津的质量分数为40.0%，醚菌酯的质量分数为9.9%。 

实施例五 

现生产一批标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯水乳剂，为了检测有效成分甲基托布津和醚菌酯的含量，采用高效液相色谱分析方法对标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯水乳剂进行分析： 

1.检测条件：Shim pack VP-ODS C18色谱柱：25cm×4.6mm×5μm，理论塔板数4000，流动相：甲醇:水=80:20（V/V），波长270nm，柱温：30℃，流速：1ml/min，进样体积为5微升； 

2.标样溶液的配制 

分别称取50.5mg甲基托布津、12.7mg醚菌酯标样，依次加入到100ml容量瓶中，加入甲醇，超声震荡，标样溶解后冷却至室温，用甲醇定容； 

3.试样溶液的配制 

称取127mg标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯水乳剂试样，加入到100ml容量瓶中，加入甲醇，超声震荡，试样溶解后冷却至室温，用甲醇定容，采用规格为0.22μm有机滤膜过滤后待测； 

4.测定与数据处理 

开启机器自检通过后，在规定的操作条件下，仪器基线稳定后，连续注入数针标样，计算各针相对响应值，达到相邻两针相对响应值变化小于1.0%时，按标样、试样、试样、标样的顺序依次进样，得数据如下： 

带入公式 

$X_1=\frac{A_2·m_1·P_1}{A_1·m_2}$

计算可得该标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯水乳剂中甲基托布津的质量分数为40.1%，醚菌酯的质量分数为10.0%。 

为了验证上述本发明所述方法的可行性和准确性，发明人进行了如下验证 

试验： 

试验例1 

（1）标准溶液的配制 

分别称取50mg甲基托布津、12.5mg醚菌酯标样加入到同一100ml容量瓶中，用甲醇超声震荡使其快速溶解，冷却至室温后定容。 

（2）试样溶液的配制 

称取125mg（精确至0.2mg）标示质量分数40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯水剂试样5份，分别加入到100ml容量瓶中，加入甲醇溶解，超声波震荡使其快速溶解，后用甲醇定容，采用规格为0.22μm有机滤膜过滤后待测。 

（3）测定与数据处理 

检测条件：Shim pack VP-ODS C18色谱柱：25cm×4.6mm×5μm，理论塔板数4000，流动相：甲醇:水=80:20（V/V），波长270nm，柱温：30℃，流速：1ml/min，进样体积为5微升。 

开启机器通过自检过后，在规定的操作条件下，仪器基线稳定后，连续注入数针替代标样，计算各针相对响应值，达到相邻两针相对响应值变化小于1.5%时，按替代标样、试样、试样、替代标样的顺序依次进样，按式（2）计算试样的有效成分含量，检测结果如下表所示： 

由表中数据可知，该方法的实验结果重复性良好。 

试验例2 

（1）标准溶液的配制 

分别称取100mg甲基托布津、25mg醚菌酯标样加入到同一100ml容量瓶中，用甲醇超声震荡使其快速溶解，冷却至室温后定容。然后摇匀后用移液管准确量取混合标准溶液4ml、8ml、12ml、16ml、20ml，分别置于5个100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，待测。 

（2）测定 

检测条件：Shim pack VP-ODS C18色谱柱：15cm×4.6mm×5μm，理论 塔板数3000，流动相：甲醇:水=75:25（V/V），波长275nm，柱温：室温，流速：1ml/min，进样体积为5微升。 

以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算得甲基托布津的线性回归方程为y₁=124.7x＋9.8，R₁²=0.999,，醚菌酯的线性回归方程为y₂=125.6x-48.97，R₂²=0.999，可以得出，甲基托布津在9.5865-89.7812mg/l，醚菌酯在10.0125-108.7812mg/l范围内有良好的线性关系。 

试验例3 

称取125mg标示质量分数（精确至0.2mg）40%甲基托布津和质量分数10%醚菌酯乳油试样各5份分别加入到五个100ml容量瓶中，然后称取不同含量的甲基托布津和醚菌酯标样各五份，分别加入到上述五个100ml容量瓶中，用甲醇超声震荡使其快速溶解，冷却至室温后定容，采用规格为0.22μm有机滤膜过滤。 

采用Shim pack VP-ODS C18色谱柱：15cm×4.6mm×5μm，理论塔板数3000，流动相：甲醇:水=75:25（V/V），波长为275nm，柱温：室温，流速：1ml/min，进样体积为5微升，测其回收率，结果如下表所示。其平均回收率分别为99.11%和99.72%，结果表明该方法的加标回收率较好。 

由上述试验例可知，本发明所提供的一种同时测定甲基托布津和醚菌酯复配制剂中甲基托布津、醚菌酯含量的方法准确性高，可操作性好，重复性好，分析快速，只需一次进样，即可同时测出甲基托布津、醚菌酯的含量。