一种运用人脐带间充质干细胞作为饲养层培养人诱导多能干细胞的方法

摘要

本发明公开了一种运用人脐带间充质干细胞作为饲养层培养人诱导多能干细胞的方法，它包括如下步骤：（1）制备饲养层：取人脐带间充质干细胞，接种至培养皿上，至细胞汇合度为40%～60%时，加入5～15μg/ml的丝裂霉素C，处理2～4h，去除丝裂霉素C，即得饲养层；（2）培养：将人诱导多能干细胞接种至步骤（1）制备的饲养层上，培养，即可。本发明方法可以长期有效培养人诱导多能干细胞，无异源细胞和异源蛋白的污染，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种以人脐带间充质干细胞作为饲养层培养人诱导多能干细 胞的方法。

背景技术

干细胞是人体的最重要细胞，干细胞能形成肌肉、肝脏、脑和心脏等不 同组织。人胚胎干细胞来自人胚胎，可以分化成人体的各种组织细胞，被称 为多能干细胞。研究表明：人类胚胎干细胞可以修复受损的器官，治疗心肌 梗死或心脏病受损的心脏。人类胚胎干细胞的进一步应用，将为移植疗法和 治疗肌肉萎缩症，帕金森等疑难病症开辟新的途径。然而，由于人类胚胎干 细胞来源于人的胚胎，因而用人类胚胎研究干细胞有悖道德伦理。

2007年，日本山中伸弥研究组首次发表了用人体细胞诱导重编程得到人 诱导多能干细胞。诱导多能干细胞（iPSCs），具有和人胚胎干细胞（ES细胞） 相似的自我更新能力和向三个胚层分化的能力，有望替代胚胎干细胞用于疾 病医治，并且巧妙地绕开了ES细胞无法避免的伦理问题，因此这一研究一 经发表就引起全世界医学界的轰动，成为近年来干细胞研究领域的标志性事 件。他们使用几个与胚胎干细胞（ES细胞）多潜能性相关的转录因子（OCT4、 SOX2、C-MYC和KLF4）在体细胞内过表达，从而诱导其重编程为类似胚 胎干细胞的一种细胞类型——诱导多能干细胞（iPSCs）。这种通过将完全分 化的体细胞重编程，不经胚胎阶段而直接逆转至多能干细胞状态的iPS细胞 被科学家们视为最有希望运用到再生医学、疾病机理研究及新药开发的重要 资源，为人类各种遗传性及功能性疾病的研究和治疗带来了新希望。

目前，研究者们已经将多种体细胞来源的iPSCs成功分化为各种组织细 胞，如视网膜色素上皮细胞、造血干/祖细胞、心肌细胞、红细胞、巨核细胞、 血小板、肝细胞、胰岛β细胞等；利用组织工程从iPSCs培育出软骨、肾小 管、心脏组织、肝脏等组织器官；建立了肌萎缩侧索硬化症（ALS）、帕金森 症、老年痴呆症、老年黄斑病变、镰刀形细胞贫血症、血友病A等多种基因 遗传病的疾病模型，可用于疾病机理研究、药物筛选和基因治疗研究。2013 年7月，日本正式启动了世界首例iPSCs临床研究——iPSCs治疗年龄相关 性黄斑病变，为iPSCs走向临床运用迈出了坚实的一步。

人iPSCs持续培养需要基质、细胞因子、细胞间相互作用来维持其自我 更新和多向分化潜能。经典的人iPSCs培养过程中通常使用小鼠胚胎成纤维 细胞（MEF）或小鼠成纤维细胞系（SNL）作为人iPSCs的饲养层细胞，以 维持其生长。但使用这些细胞作为饲养层会不可避免地引入动物源性成分及 未知病原，从而限制人iPSCs的临床应用。这些免疫原性污染很难从共培养 体系中去除，而目前人iPSCs的无饲养层培养基价格较为昂贵，因此寻找适 合人iPSCs培养的人源饲养层细胞显得尤为迫切和需要。

2010年，Christian等用人皮肤成纤维细胞作为饲养层培养人iPSCs，可 以维持iPSCs的生长，但是其维持时间较短，培养代数仅7代；公开号为 CN102161980的专利申请公开了以人骨髓间充质干细胞作为饲养层培养人 iPSCs，可以维持iPSCs的生长，但是维持时间仍然较短，培养代数仅14代， 并且，该饲养层采用含胎牛血清的培养基培养得到，含有异源蛋白，用于临 床应用仍然存在潜在风险。

因此，进一步研究开发人iPSCs的人源化培养体系，长期维持iPSCs细 胞的生物学特性和多向分化潜能，对人iPSCs最终走向临床应用显得尤为重 要。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种运用人脐带间充质干细胞作为饲养 层培养人诱导多能干细胞（人iPSCs）的方法。

本发明人诱导多能干细胞的培养方法，它包括如下步骤：

（1）制备饲养层：取人脐带间充质干细胞，接种至培养皿上，培养至细 胞汇合度为40%～60%时，加入5～15μg/ml的丝裂霉素C，处理2～4h，去除 丝裂霉素C，即得饲养层；

（2）培养：将人诱导多能干细胞接种至步骤（1）制备的饲养层上，培 养，即可。

在无菌条件下用机械法将人诱导多能干细胞均匀切割成大小合适的小团 块，再将其挑起悬浮于培养基中，当小团块平均铺在传代培养皿上后，呈单 个独立的状态，随着细胞生长，就会向周围平铺，形成一个一个克隆，随着 克隆的增大，临近的两个克隆会发生汇合。细胞汇合度就是指两两连接在一 起的克隆数目占总克隆数目的比率。

步骤（1）中，所述人脐带间充质干细胞是第三代至第七代人脐带间充质 干细胞。

步骤（1）中，间充质干细胞接种的密度为0.7～1.5×10⁴细胞/cm²。优选 地，所述间充质干细胞的接种密度为1×10⁴细胞/cm²。

步骤（1）中，细胞的汇合度为50%%。

步骤（1）中，所述丝裂霉素C的浓度为10μg/ml。

步骤（1）中，丝裂霉素C处理的时间为3h。

步骤（1）中，培养人脐带间充质干细胞采用的培养基为人间充质干细胞 无血清培养基。

所述无血清培养基为Lonza公司（Lonza group LTD.）货号为190632的 无血清培养基、Life公司（Life Technologies Corporation）货号为A10332-01 的无血清培养基、biological industries公司（BIOLOGICAL INDUSTRIES  ISRAEL BEIT HAEMEK LTD.）货号为05-200-1A（含05-201-1U）的无血清 培养基、BD公司（Becton,Dickinson and Company）货号为355701的无血清 培养基、天津灏洋公司（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）货号为 TBD2012MSCM的无血清培养基。

步骤（2）中，所述人诱导多能干细胞采用如下方法制备：

a、取人包皮成纤维细胞，感染含OCT4、SOX2、C-MYC、KLF4、NANOG 和LIN28六种转录因子的逆转录病毒，再接种至步骤（1）制备的饲养层上 培养；

b、培养1天后，将培养基替换为人诱导多能干细胞培养基，并每天换液； 所述人诱导多能干细胞培养基以DMEM/F12为基础培养基，并在每升基础培 养基中添加有0.2L knockout血清替代物、0.01L非必需氨基酸、2mmol L-谷 氨酰胺、0.1mmolβ-巯基乙醇、4mg成纤维细胞生长因子、0.01L青霉素以及 0.01L链霉素；

c、培养12天后，挑选类似胚胎干细胞的细胞克隆，即为人诱导多能干 细胞。

步骤a中，所述逆转录病毒为慢病毒。

步骤（2）中，培养人诱导多能干细胞的培养基以DMEM/F12为基础培 养基，并在每升基础培养基中添加有0.2L knockout血清替代物、0.01L非必 需氨基酸、2mmol L-谷氨酰胺、0.1mmolβ-巯基乙醇、4mg成纤维细胞生长 因子、0.01L青霉素以及0.01L链霉素。

步骤（2）中，培养时，每4～7天传代一次，传代比例为1:2～1:4。

本发明培养方法采用人脐带干细胞作为饲养层培养人诱导多能干细胞， 能够长期维持其生物学特征和多潜能性，同时，人源饲养层采用无血清培养 基培养得到，不含血清等存在安全隐患的成分，安全，具有良好的临床应用 前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段， 在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、 替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步 的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。 凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1人脐带间充质干细胞在倒置相差显微镜下的形态

图2人脐带间充质干细胞流式细胞术检测分析

图3人脐带间充质干细胞经不同浓度丝裂霉素C处理后的细胞增殖情况

图4人脐带间充质干细胞经丝裂霉素C处理前后的形态比较。A为处理前的 脐带间充质干细胞；B为处理后的脐带间充质干细胞。

图5人包皮成纤维细胞转染诱导培养12天后的形态，形成近似于人胚胎干 细胞样的细胞克隆

图6本发明人脐带间充质干细胞饲养层（A）和小鼠胚胎成纤维细胞饲养层 （B）上培养至20代后人iPSCs形态比较

图7在人脐带间充质干细胞为饲养层的培养体系中连续培养至20代后人 iPSCs克隆的染色体核型分析

图8免疫荧光化学法鉴定在人脐带间充质干细胞饲养层上培养至20代后人 iPSCs

图9Real-time PCR法检测人iPSCs分别在人脐带间充质干细胞和小鼠成纤细 胞（MEF）两种饲养层上连续培养20代后的基因相对表达情况

图10细胞免疫荧光化学法鉴定人iPSCs在人脐带间充质干细胞为饲养层的 培养体系中培养20代后的体外三胚层分化情况

图11在人脐带间充质干细胞为饲养层的培养体系中连续培养至20代后人 iPSCs在NOD SCID小鼠体内形成畸胎瘤情况。A为畸胎瘤内形成的腺 样组织；B为畸胎瘤内形成的神经样组织；C为畸胎瘤内形成的肌肉样 组织。

具体实施方式

本发明所用的试剂、耗材及仪器如下表所示：

实施例1人脐带间充质干细胞的分离培养与鉴定

1、试验方法

1.1分离培养方法

从分娩胎儿中无菌获取长度约10cm的人脐带组织，以无菌操作方式纵 向切开脐带，并去除脐动脉和脐静脉，然后用PBS清洗3次。剩余组织机械 剪成约0.2cm³大小，采用组织块贴壁法将组织块贴于10cm细胞培养皿中， 加入含1%双抗的间充质干细胞无血清培养基（Lonza），置于37℃5%CO₂细 胞培养箱中培养，每3天换液1次。细胞达90%汇合度后，用0.05%胰酶消 化，按1:4比例传代培养为P1细胞，此后继续以1:4比例传代，每3天换液 1次。

1.2鉴定方法

采用流式细胞仪对从人脐带组织中分离得到的细胞的表面标志物 CD90、CD105呈阳性、CD45和HLA-DR进行鉴定。

2、实验结果

7-9天后可见有梭形贴壁细胞从组织块周围爬出（见图1）；14天左右可 见原代贴壁细胞汇合度超过90%，呈旋涡状围绕在组织块周围。

流式细胞鉴定结果为CD90和CD105呈阳性，CD45和HLA-DR呈阴性 （见图2）。

结果证明，从人脐带组织中分离得到的细胞确实为人脐带间充质干细胞 （hUCMSC）。

实施例2饲养层的制备

1、丝裂霉素C浓度的筛选

实验方法：取实施例1分离的人脐带间充质干细胞（hUCMSC），传代 后接种至6cm细胞培养皿中，采用间充质干细胞无血清培养基（Lonza）培养， 次日分别用5μg/ml、10μg/ml和15μg/ml丝裂霉素C处理3小时，不加丝 裂霉素C组作为空白对照组，实验组处理后用PBS洗3次，换成间充质干细 胞无血清培养基（Lonza）置于37℃5%CO₂细胞培养箱中培养。在各组处理 后第0天、第1天、第2天和第3天进行胰酶消化，用台盼蓝染色计数，设 3个复孔。

实验结果：空白对照组细胞正常增殖，而实验组的增殖则显著被抑制， 其中，10μg/ml组第3天细胞总数基本与处理前一致，5μg/ml组细胞总数 呈上涨趋势，15μg/ml组细胞总数整体呈下降趋势（见图3）。

实验结果说明，用5～15μg/ml丝裂霉素C可以有效抑制人脐带间充质 干细胞的增殖，其中，用10μg/ml浓度处理hUCMSC后，细胞总数稳定， 能更好地为人iPSCs生长提供支持，也不会因为饲养层细胞快速增殖导致人 iPSCs克隆生长空间变小从而阻碍其生长。

2、准备人脐带间充质干细胞作为饲养层

实验方法：取实施例1分离的第三至第七代人脐带间充质干细胞 （hUCMSC）作为饲养层。人脐带间充质干细胞经0.05%胰酶消化后，用台 盼蓝染色计数，以1×10⁴细胞/cm²密度接种至6cm培养皿上，采用间充质干 细胞无血清培养基（Lonza）培养，次日细胞汇合度为50%。加入终浓度为10 μg/ml的丝裂霉素C，置于细胞培养箱中处理3h，处理后用PBS洗3次， 换成间充质干细胞无血清培养基（Lonza），即得本发明人脐带间充质干细胞 饲养层，并在24h内使用。

实验结果：显微镜下观察人脐带间充质干细胞经丝裂霉素C处理前后的 形态，实验结果显示处理前后人脐带间充质干细胞形态保持一致，说明丝裂 霉素C仅仅抑制了人脐带间充质细胞的增殖，并未影响其他特性（见图4）。

实施例3饲养层的制备

实验方法：取实施例1分离的第三至第七代人脐带间充质干细胞 （hUCMSC）作为饲养层。人脐带间充质干细胞经0.05%胰酶消化后，用台 盼蓝染色计数，以0.7×10⁴细胞/cm²密度接种至10cm培养皿上，采用无血 清培养基（Life）培养，次日细胞汇合度约为40%。加入终浓度为10μg/ml 的丝裂霉素C，置于细胞培养箱中处理2h，处理后用PBS洗3次，换成无血 清培养基（Life），即得本发明人脐带间充质干细胞饲养层，并在24h内使用。

实施例4饲养层的制备

实验方法：取实施例1分离的第三至第七代人脐带间充质干细胞 （hUCMSC）作为饲养层。人脐带间充质干细胞经0.05%胰酶消化后，用台 盼蓝染色计数，以1.5×10⁴细胞/cm²密度接种至6cm培养皿上，用无血清培 养基（biological industries）培养，次日细胞汇合度约为60%。加入终浓度为10 μg/ml的丝裂霉素C，置于细胞培养箱中处理4h，处理后用PBS洗3次， 换成无血清培养基（biological industries），即得本发明人脐带间充质干细胞饲养 层，并在24h内使用。

实施例5人iPSCs的诱导和培养

1、将人包皮纤维细胞诱导为人iPSCs

实验方法：用含OCT4、SOX2、C-MYC、KLF4、NANOG和LIN28六 种转录因子的慢病毒感染第5代以内的人包皮成纤维细胞（HDF细胞）一次， 感染后第1天用PBS洗3遍，0.05%胰酶消化，台盼蓝计数后取1×10⁴个HDF 细胞接种至含有实施例2制备的人脐带间充质干细胞饲养层的10cm细胞培 养皿中，置于37℃5%CO₂细胞培养箱中培养。培养第2天开始换成人iPSCs 培养基（DMEM/F12中加入20%knockout血清替代物、1%非必需氨基酸、 2mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇、4ng/ml成纤维细胞生长因子、1%青 霉素和链霉素），此后每天换液。

实验结果：每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况，观察发现，培养12 天后，出现类似ES的克隆，克隆边界清晰，细胞紧密、核仁明显（见图5）。

2、以人脐带间充质干细胞为饲养层培养人iPSCs

实验方法：倒置显微镜下观察类似胚胎干细胞的细胞克隆，用无菌枪头 机械挑取克隆并切割成小团块，接种到实施例2制备的人脐带间充质干细胞 饲养层上，用人iPSCs培养基（DMEM/F12中加入20%knockout血清替代物、 1%非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇、4ng/ml成纤维细 胞生长因子、1%青霉素和链霉素），在37℃5%CO₂培养箱中培养，每天换 液。人iPSCs每4-7天传代一次，传代按1:2至1:4比例传代。

实验结果：人iPSCs在本发明实施例2制备的人脐带间充质干细胞饲养 层上连续培养20代，仍然能够很好地维持典型的人ES样克隆，克隆边界清 晰，细胞紧密、核仁明显（见图6A），与在经典的饲养层——小鼠胚胎成纤 维细胞饲养层（MEF饲养层）上培养的人iPSCs形态相似（见图6B）。

实验结果说明，本发明饲养层可以很好地维持人诱导多能干细胞的生物 学特性，能够替代经典的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，用于培养人诱导多能 干细胞。

实施例6本发明培养的人iPSCs的稳定性分析及生物学性质鉴定

1、人iPSCs染色体核型分析

实验方法：将实施例5中人iPSCs在实施例2制备的人脐带间充质干细 胞饲养层上连续培养至20代后，将人iPSCs传代至无饲养层培养体系中培养， 以去除饲养层细胞对人iPSCs核型分析结果的干扰，培养3天后，加入0.1 μg/ml的秋水仙素作用2h使细胞停留在分裂中后期，PBS洗2次，0.05%胰 酶消化，1000r/min离心10分钟，经0.075%KCl低渗处理、固定、滴片后， 用Giemsa染色。显微镜下观察并记录至少10个分裂相。

实验结果：如图7所示，核型分析未见异常，表明人iPSCs在人脐带间 充质干细胞饲养层上连续培养20代后仍保持正常的染色体核型。

2、人iPSCs表面标志物鉴定

实验方法：将实施例5中人iPSCs在实施例2制备的人脐带间充质干细 胞饲养层上连续培养至20代后，用细胞免疫荧光化学法鉴定其表面标志物。 饲养层上的人iPSCs弃培养基后用PBS洗2次，用4%多聚甲醛固定，一抗 分别为兔抗人OCT4、兔抗人SOX2、兔抗人NANOG、鼠抗人SSEA4和鼠 抗人TRA-1-60，用DAPI染细胞核。染色后细胞避光保存，置于荧光倒置显 微镜下观察。

实验结果：如图8所示，人iPSCs表面标志物鉴定为阳性（均表达OCT4、 SOX2、NANOG、SSEA4和TRA-1-60）。

3、人iPSCs基因表达分析

实验方法：分别在以本发明实施例2制备人脐带间充质干细胞饲养层和 经典的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上扩增培养实施例5的人iPSCs至 20代后，将经过两种饲养层培养的人iPSCs传代至无饲养层培养体系中培养， 以去除饲养层细胞对人iPSCs基因表达分析结果的干扰。收集两种人iPSCs， 用Trizol提取细胞总RNA，用Transcriptor cDNA Synth kit逆转录得到cDNA， 随后以GAPDH作为内参基因进行real-time PCR，分析人iPSCs在两种饲养 层中OCT4、SOX2、C-MYC、NANOG和REX1五个基因的相对表达量。

检测结果：如图9所示，OCT4、SOX2两个多潜能关键基因表达量在 两种饲养层中无差异，本发明人脐带间充质干细胞作为饲养层培养的人 iPSCs的C-MYC、NANOG和REX1基因表达量较MEF饲养层上的人iPSCs 低，但是两者差异均不显著（P>0.05），说明本发明人脐带间充质干细胞可以 较好地维持人诱导多能干细胞的生物学特性。

4、人iPSCs体外三胚层分化鉴定

实验方法：使用人多能干细胞功能鉴定试剂盒对人iPSCs体外三胚层分 化进行鉴定。将实施例5中人iPSCs在实施例2制备的人脐带间充质干细胞 饲养层上连续培养至20代后，采用无菌枪头机械挑取人iPSCs克隆，并用 Accutase消化后台盼蓝计数，以1.1×10⁵细胞/cm²接种到Cultrex PathClear  BME包被的24孔板中用ips培养基培养。当细胞汇合度达到50%时，将培 养基分别换成三个胚层的分化培养基培养3天。用细胞免疫荧光化学法对三 个胚层细胞表面标志物进行鉴定。一抗分别为山羊抗人SOX17（内胚层细胞 表面标志物）、山羊抗人OTX2（外胚层细胞表面标志物）和山羊抗人 Brachyury（中胚层细胞表面标志物），二抗为罗丹明标记，DAPI染细胞核。 染色后细胞避光保存，置于荧光倒置显微镜下观察。

实验结果：如图10所示，三胚层细胞表面标志物SOX17、OTX2和 Brachyury均表达，说明本发明人脐带间充质干细胞饲养层可以有效维持人 iPSCs在体外向三个胚层分化的能力。

5、人iPSCs在动物体内形成畸胎瘤实验

实验方法：将实施例5中人iPSCs在实施例2制备的人脐带间充质干细 胞饲养层上连续培养至20代后，用collagenase IV处理人iPSCs，处理后收 集至离心管中离心，离心后用DMEM/F12重悬，注射至NOD-SCID小鼠背 部两侧皮下，每个注射点细胞数约为二分之一个10cm细胞培养皿中的人 iPSCs，注射剂量为100μl。注射后饲养9周左右观察成瘤情况。成瘤后处 死小鼠取出畸胎瘤进行冰冻切片和HE染色。观察其向三个胚层的分化情况。

实验结果：如图11所示，本发明人iPSCs在动物体内可以形成畸胎瘤， 切片发现其有腺样组织、神经样组织和肌肉样组织形成（见图11A、B、C）， 说明本发明人脐带间充质干细胞饲养层可以有效维持人iPSCs体内向三个胚 层分化的能力。

综上，采用本发明方法以人脐带间充质干细胞作为饲养层培养人诱导多 能干细胞，连续传代20代后，人诱导多能干细胞的各种生物学特征和多潜能 性仍然优良，说明本发明方法可以长期维持人诱导多能干细胞的生物学特性 和多潜能性，为人诱导多能干细胞进入临床应用提供了可能。