一种弄岗唇柱苣苔的离体保存方法

摘要

本发明提供一种弄岗唇柱苣苔的离体保存方法，其包括以下步骤：选取弄岗唇柱苣苔无菌苗材料；将试验材料接种到不同的培养基上，将试验材料接种到添加不同抑制剂的培养基中，将试验材料放置在四种光照强度下，总结出弄岗唇柱苣苔离体保存的最佳条件。采用本发明方法为濒危物种弄岗唇柱苣苔种质资源保存提供新技术支持及可持续利用的有效途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物离体保存方法，特别是一种弄岗唇柱苣苔离体保存方法。

背景技术

弄岗唇柱苣苔，为苦苣苔科唇柱苣苔属植物弄岗唇柱苣苔（Chirita longgangensis W. T. Wang in Guihaia），多年生草本。为广西特有的苦苣苔科药用植物，仅分布于天等、大新县等地，其根状茎可用于跌打损伤、风湿关节痛，是广西天等县生产的成药“桂花膏”的原料之一。

弄岗唇柱苣苔花冠淡紫色，筒白色至淡紫色，具有较高的观赏价值，由于其生长环境要求十分苛刻，适生的温度范围、湿度范围和土壤酸碱度范围比较小，种子细小，繁殖困难，引种难成活，2004年已经被收入《中国植物红皮书》。采用本发明所述的方法是实现濒危物种弄岗唇柱苣苔资源保存和可持续利用的有效途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种弄岗唇柱苣苔离体保存方法，它能够保存弄岗唇柱苣苔种质资源。

本发明通过以下技术方案达到上述目的：

一种弄岗唇柱苣苔离体保存方法，包括以下步骤：

（1）选取广西壮族自治区药用植物园离体保存库中弄岗唇柱苣苔试管苗在繁殖培养基上培养20d获得的丛生芽作为试验材料。

（2）将步骤（1）得到的1-2cm弄岗唇柱苣苔无菌丛生芽接种到试验设计MS、1/2MS、1/4MS三种培养基上，接种10瓶，每瓶5株单芽。培养基中25-30g/L蔗糖和3.8-4.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养温度25±1 ℃，光强1600 lx，光照12-14 h/d。

（3）将步骤（1）得到的1-2cm弄岗唇柱苣苔无菌丛生芽接种到添加不同浓度矮壮素（CCC）、脱落酸（ABA）、多效唑（PP₃₃₃）的培养基上，接种10瓶，每瓶5株单芽。培养基中25-30g/L蔗糖和3.8-4.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养温度25±1 ℃，光强1600 lx，光照12-14 h/d。

（4）将步骤（1）得到的1-2cm弄岗唇柱苣苔无菌丛生芽接种到以蔗糖、甘露醇、山梨醇的3个水平设计正交试验培养基，接种10瓶，每瓶5株单芽。培养基中25-30g/L蔗糖和3.8-4.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养温度25±1 ℃，光强1600 lx，光照12-14 h/d。

    （5）将步骤（1）得到的1-2cm弄岗唇柱苣苔无菌丛生芽接种到繁殖培养基，设计0、800 lx，1600 lx，2400 lx四种光照强度，每种光强接种10瓶，每瓶5株单芽。培养基中25-30g/L蔗糖和3.8-4.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养温度25±1 ℃，光照12-14 h/d。

（6）离体保存的弄岗唇柱苣苔试管苗的生长恢复情况考察：将生长健壮的弄岗唇柱苣苔试管苗单芽切下接种到最佳保存培养基上保存300d后存活的弄岗唇柱苣苔苣苔试管苗接种到MS+上，每30d继代1次，继代3次后，以株高、形态、叶长、叶宽、芽增殖倍数、平均生长率、单株生根率为指标考察弄岗唇柱苣苔试管苗的恢复情况。

通过选取弄岗唇柱苣苔无菌苗材料；将试验材料接种到不同的培养基上，将试验材料放置在四种光照强度下，总结出弄岗唇柱苣苔离体保存的最佳条件。

    本发明的突出优点在于：

（1）进行弄岗唇柱苣苔离体保存是实现为濒危物种弄岗唇柱苣苔资源保存和可持续利用的有效途径。

（2）常温下，在1/2MS保存培养基上添加0.5-1.5mg/L的矮壮素（CCC）可长时间保存弄岗唇柱苣苔试管苗，能够控制植株伸长，苗株生长缓慢，植株矮壮，根系发达。

    常温下，在1/2MS保存培养基中添加蔗糖30-60g/L可长时间保存弄岗唇柱苣苔试管苗，能够控制植株伸长，苗株生长缓慢，植株矮壮，根系发达。

    常温下，在1/2MS保存培养基中添加琼脂4.0-5.0g/L可长时间保存弄岗唇柱苣苔试管苗，能够控制植株伸长，苗株生长缓慢，植株矮壮，根系发达。

    常温下，在1/2MS保存培养基中添加山梨醇3-7 g/L可长时间保存弄岗唇柱苣苔试管苗，能够控制植株伸长，苗株生长缓慢，植株矮壮，根系发达。

    常温下，光强800-1600lx, 12 h/d可长时间保存弄岗唇柱苣苔试管苗，能够控制植株伸长，苗株生长缓慢，植株矮壮，根系发达。

（3）采用本发明所述的离体保存方法，获得的弄岗唇柱苣苔无菌苗经在外观形态、生长发育均与未经过离体保存处理材料无显著差异；表明该保存方法适合弄岗唇柱苣苔的种质资源长期保存。

具体实施方式

    下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

一种弄岗唇柱苣苔离体保存方法，包括以下步骤： 

（1）选取广西壮族自治区药用植物园离体保存库中红苞半蒴苣苔试管苗在繁殖培养基上培养20d获得的丛生芽作为试验材料。

（2）无机盐水平对弄岗唇柱苣苔试管苗离体保存的影响：将步骤（1）得到的外植体弄岗唇柱苣苔组培快繁适用的基本培养基为MS培养基，试验设计MS、1/2MS、1/4MS三种无机盐浓度水平，考察各无机盐浓度对试验材料生长状况的影响，以实验材料存活率不低于50%的保存时间作为种质保存的评价指标。25-30g/L蔗糖和3.8-4.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，每处理接种10瓶，每瓶5株单芽。培养温度25±1 ℃，光强1600 lx，光照12-14 h/d。(注：MS培养基是Murashige和Skoog二人1962年设计的，为目前使用最为普遍的培养基。)

表1 培养基对弄岗唇柱苣苔离体保存时间的影响

培养基保存时间（d）生长状况MS332芽株生长良好，植株嫩绿，5个月后开始死亡，260d后培养基消耗殆尽1/2MS310生长良好，植株嫩绿，4个月后开始死亡，260d后培养基消耗殆尽1/4MS203芽株生长缓慢，3个月后材料开始干枯死亡，200d后培养基消耗殆尽

（3）植物生长抑制剂对弄岗唇柱苣苔试管苗离体保存的影响：将步骤（1）中得到的试管苗接种到添加不同浓度的矮壮素（CCC）、脱落酸（ABA）、多效唑（PP₃₃₃）三种植物生长调节剂的1/2MS培养基中，考察各个因素对实验材料生长状况的影响，以实验材料存活率不低于50%的保存时间作为种质保存的评价指标。25-30g/L蔗糖和3.8-4.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，每处理接种10瓶，每瓶5株单芽。培养温度25±1 ℃，光强1600 lx，光照12-14 h/d。因素水平见表1。

表2 激素对弄岗唇柱苣苔保存时间的影响

激素浓度（mg/L）保存时间（d）生长状况CCC0.5251芽株生长良好，植株嫩绿，4个月后开始死亡CCC1.0317芽株生长良好，植株嫩绿，8个月后开始死亡CCC1.5295芽株生长良好，植株嫩绿，5个月后开始死亡PP₃₃₃0.5131芽株生长良好，植株嫩绿，3个月后开始死亡PP₃₃₃1.0164芽株生长良好，植株嫩绿，4个月后开始死亡PP₃₃₃1.5201芽株生长良好，植株嫩绿，5个月后开始死亡ABA0.5168芽株生长良好，植株嫩绿，3个月后开始死亡ABA1.0205芽株生长良好，植株嫩绿，5个月后开始死亡ABA1.5201芽株生长良好，植株嫩绿，5个月后开始死亡

（4）渗透压对弄岗唇柱苣苔试管苗离体保存的影响：以蔗糖、甘露醇、山梨醇的3个水平设计正交试验，考察各个因素对实验材料生长状况的影响，以实验材料存活率不低于50%的保存时间作为种质保存的评价指标。25-30g/L蔗糖和3.8-4.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，每处理接种10瓶，每瓶5株单芽。光照14～16 h，光强1600 lx，室温25±1 ℃。

表3渗透压正交实验L₉(3⁴)对弄岗唇柱苣苔离体保存影响

   注：K1为“1”水平所对应的保存时间的数值之和，K2、 K3分别为“2、3”水平所对应的保存时间的数值之和。

    （5）光强对弄岗唇柱苣苔试管苗离体保存的影响：弄岗唇柱苣苔组培快繁适用的光照条件为1600 lx，试验设计0、800 lx，1600 lx，2400 lx四种光照强度，考察各光强对试验材料生长状况的影响。以实验材料存活率不低于50%的保存时间作为种质保存的评价指标。25-30g/L蔗糖和3.8-4.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，每处理接种10瓶，每瓶5株单芽。光照14～16 h，室温25±1 ℃。

表4 光照强度对弄岗唇柱苣苔离体保存的影响

光照强度（lx）保存时间(d)生长状况048植株渐渐萎蔫死亡800187植株嫩绿，4个月后开始死亡1600332芽株生长良好，植株嫩绿，8个月后开始死亡24002212个月植株渐渐玻璃化，5个月后开始死亡

（6）离体保存的弄岗唇柱苣苔试管苗的生长恢复情况考察：将生长健壮的弄岗唇柱苣苔试管苗单芽切下接种到最佳保存培养基上保存300d后存活的弄岗唇柱苣苔苣苔试管苗接种到MS+上，每30d继代一1次，继代3次后，以株高、形态、叶长、叶宽、芽增殖倍数、平均生长率、单株生根率为指标考察弄岗唇柱苣苔试管苗的恢复情况。

表3 离体保存后恢复的试管苗和保存前试管苗的比较

材料平均生长率繁殖倍数生根率株高/cm正常7.15±0.327.11±0.5799.6±0.318.42±0.48保存6.85±0.296.67±0.3399.1±0.277.74±0.43

 结论：常温下弄岗唇柱苣苔离体保存最佳培养基为：MS+蔗糖60g/L+琼脂4.0g/L+山梨醇5 g/L+CCC1.0mg/L;最佳保存条件为光强1600lx, 12 h/d。