用于他汀引发的肌肉毒性的灵敏检测的生物标志物

摘要

本发明特别提供了通过检测生物样品的脂质浓度或脂质比率并将其与对照比较从而预测他汀引发的肌肉毒性或其并发症(例如肌痛、肌病和横纹肌溶解)的方法，以及所述方法的应用。所述方法已经鉴定出在检测这些他汀引发的肌肉毒性方面比当前应用的临床标志物更具特异性和灵敏度的脂质标志物。本发明还提供了针对所述脂质的抗体，以及所述抗体在预测、诊断他汀引发的肌肉毒性中的应用。本发明另外涉及包含脂质和/或其抗体的试剂盒，所述试剂盒用于预测和/或诊断他汀引发的肌肉毒性。

说明书

技术领域

本发明涉及预测或诊断他汀引发的肌肉毒性的涉及脂质水平的方法和应用。本发 明特别适用于确定受试对象是否需要调整他汀治疗和用于评估新降脂药引起的肌肉 毒性。所述方法包括分析生物样品的脂质水平，并将其与对照比较。

背景技术

他汀目前是最广泛使用的降脂药，这是因为他汀将不同患者群的严重心血管端点 事件(心血管死亡、心肌梗塞和中风)降低了25%至35%。这些群体包括患有稳定或不 稳定的冠心病、糖尿病的群体和带有其他风险因素的高血压患者。通常，虽然会发生 肌肉、肝脏和胃肠道的副作用，但他汀耐受良好。他汀可与多种肌肉副作用相关联， 从非特异性或非典型的肌痛到肌病和晚期横纹肌溶解综合征。

将肌痛定义为肌肉疼痛或肌肉酸痛的不适，其可以是全身性的，或者是局部的。 这种症状可在高达10%的患者中发生，可迫使医师降低剂量、采用试错法更换为其他 他汀或完全终止药物治疗。这些肌肉症状也可以导致相对高比例的患者在治疗的头2 年中停止他汀治疗。因此，甚至更多的良性肌肉症状可具有重要后果并限制了这些药 剂所可能带来的较大临床和社会经济效益。

肌病虽然危害小于横纹肌溶解，但还能够在他汀治疗之后发生，其被定义为肌肉 疼痛和/或衰弱，肌酸激酶(CK)水平比正常上限升高至少10倍。肌病的发病率为约1% 至5%。他汀相关的肌肉毒性的已知的诱病风险因素包括肾功能不全、甲状腺机能减 退、遗传性或获得性肌肉疾病、其他他汀或贝特类药物(fibrate)引起的肌肉毒性的病 史、纤维酸(fibric acid)衍生物的同时使用、酒精滥用、可能发生他汀血浆水平升高的 临床情况以及亚洲血统(Asian ancestry)。

横纹肌溶解是罕见事件(远低于0.1%的他汀使用者)，但构成了威胁生命的病况， 特征为严重的肌肉毒性、血浆肌酸激酶(CK)水平的大幅升高(超过10,000U/L)和肌红 蛋白毒性继发的肾功能不全。横纹肌溶解已引起了数例患者死亡并且已经导致一种他 汀西立伐他汀(Baycol,Bayer)的撤市。另一种HMG-CoA还原酶抑制剂辛伐他汀(Zocor, Merck&Co.)在以高剂量施用时(A至Z试验)最近也显示出使横纹肌溶解的发病率升 高。

目前，采用血浆/血清肌酸激酶(CK)测定作为他汀引发的肌肉毒性的生物标志物。 对于大多数病例，即使出现了症状，CK测定仍然不能提供充分信息。血浆/血清CK 是非特异性标志物，这是因为其可由于包括锻炼在内的多种其他原因而升高。更大的 局限是其灵敏度差，因为其仅在涉及CK从组织渗漏到血浆中的对肌肉细胞的实际损 害发生后才给出提示。因此，对于这一问题理所当然需要开发用于诊断他汀引发的肌 肉毒性的新的生物标志物。在组织病理学研究中对于从急性肌肉疼痛期间患者获得的 肌肉试样的早期研究(Phillips PS等：“Statin-associated myopathy with normal creatine  kinase level.”Ann Intern Med.2002oct1;137(7):581-5)已经例如证明了炎性细胞的累 积。

人体内脂质介体的数量很多。已经尝试通过质谱法和脂质生物化学的进展来辅助 对这些介体的鉴定和定量，现在能够同时对统称为脂质组的数个脂质类别中的数百种 分子脂质物质进行高通量鉴定和定量(Ejsing CS,等:Global analysis of the yeast  lipidome by quantitative gunshot mass spectrometry.Proc Natl Acad Sci U S A2009, 106:2136-2141;Stahlman M,等:High-throughput gunshot lipidomics by quadrupole  time-of-flight mass spectrometry.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci2009 Hiukka A,等:ApocIII-enriched LDL in type2diabetes displays altered lipid composition, increased susceptibility for sphingophosphase,and increased binding to biglycan. Diabetes2009,58:2018-2026;Linden D,等:Liver-directed overexpression of  mitochondrial glycerol-3-phosphate acyltransferase results in hepatic steatosis,increased  triacylglycerol secretion and reduced fatty acid oxidation.FASEB J2006,20:434-443.)。脂 质组学研究已经试图鉴定脂质细胞分布并描述其生物化学机理、相互作用和动力学。 脂质组学原则上能够对脂质组的确切化学组成进行定量(Han X,Gross RW:Global  analyses of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples by ESI  mass spectrometry:a bridge to lipidomics.J Lipid Res2003,44:1071-1079)。

现有技术中大量脂质数据表示了总和组成形式的脂质，即，磷脂酰胆碱(PC)34:1 (Brugger B,等：Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole  level by nano-electrospray ionization tandem mass spectrometry.Proc Natl Acad Sci U S  A1997,94:2339-2344)，其中分子脂质和所连接的脂肪酸尾仍未被鉴定。分子脂质物 质的鉴定，例如PC16:0/18:1(Ekroos K,等：Charting molecular composition of  phosphatidylcholines by fatty acid scanning and ion trap MS3fragmentation.J Lipid Res 2003,44:2181-2192)是高级脂质组学中的主要特征，其给出了高分辨的分子脂质物质， 而不是总的脂肪酸信息。例如，揭示了脂肪酸种类及其与构成具体PC分子的甘油骨 架的连接位置的信息。已有如薄层色谱结合气相色谱等常规技术，但这些常规技术不 仅需要相当大的样品量和费力的样品制备，它们还不能给出分子脂质物种。虽然多种 质谱技术能够表征脂质实体，但其中大多数技术在绝对或接近绝对浓度方面仍不能给 出可靠的高质量定量数据。

需要用于检测和诊断他汀引发的肌肉毒性的特异性且可靠的方法，以及用于这方 面的标志物。还需要改进他汀或降脂药的现有的治疗方案。

发明内容

本发明特别提供用于检测和诊断他汀引发的肌肉毒性的新型脂质组学标志物，所 述他汀引发的肌肉毒性是诸如与肌肉疾病、肌营养不良、肌痛、肌炎、肌病或横纹肌 溶解相关的他汀引发的肌肉毒性。

在本发明的一个方面，本文特别公开和/或要求保护用于检测与从非特异性或非 典型的肌痛到肌病和晚期横纹肌溶解综合征的他汀相关的肌肉副作用的方法、脂质组 学标志物、诸如抗体等试剂以及试剂盒。肌痛被定义为肌肉疼痛或肌肉酸痛的不适， 其可以是全身性的，或者是局部的。肌病危害小于横纹肌溶解，但还能够在他汀治疗 之后发生，其被定义为肌肉疼痛和/或衰弱，CK水平比正常上限升高至少10倍。

本发明的方法可以包括例如以下步骤：a)提供来自正在进行他汀治疗、待进行他 汀治疗或已经进行过他汀治疗的受试对象的生物样品；b)确定所述样品中的根据本发 明在此鉴定为有用的脂质组学标志物的一种或多种脂质的浓度和/或一种或多种脂质 比率；和c)将所确定的所述脂质浓度和/或脂质比率与对照中的相应脂质浓度和/或脂 质比率进行比较。

本发明的脂质组学标志物使得能够灵敏检测他汀引发的肌肉毒性。应当意识到的 是，所述脂质组学标志物同样适用于他汀引发的肌肉毒性的并发症。这有助于改善患 者护理、减轻疾病症状发展和痛苦、并实现与他汀副作用相关的发病率/死亡率的降 低。因此，本文所述并要求保护的脂质组学标志物使得能够对以他汀治疗或待以他汀 治疗的患者实现个体定制的药物干预。另外，本发明可用于测试他汀和他汀样化合物 的动物实验。本发明特别会对所要进行的新型脂质降低药物治疗做出更好的安全性评 估。

因此，此处特别提供了用于确定受试对象是否罹患或有风险发展他汀引发的肌肉 毒性和/或一种或多种其并发症的方法，所述方法包括：确定来自所述受试对象的样 品中的一种或多种脂质的浓度，其中，与对照相比时所述样品中的浓度升高或降低表 明所述受试对象罹患所述他汀引发的肌肉毒性和/或所述并发症，其中与对照相比其 浓度升高的一种或多种脂质选自表2：12-HETE、15-HETE、13-HODE、PE  P-18:0/20:4、PE O-18:1/20:4、LacCer(d18:1/22:0)、LacCer(d18:1/20:0)、PE18:0/20:4、 Cer(d18:1/18:0)、LacCer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/20:0)、PC16:0/20:3,、AA、 Cer(d18:1/24:1)、Cer(d18:1/26:1)、Glc/GalCer(d18:1/24:1)、Cer(d18:1/22:0)、 Glc/GalCer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/16:0)、LacCer(d18:1/24:1)、SM(d18:1/14:0) (d18:1/13:1-OH)、LacCer(d18:1/16:0)、CE18:3和PC16:0/20:4；并且，其中与对照相 比其浓度降低的一种或多种脂质选自表2中的脂质：11_12-DHET、14_15-DHET、 5-HETrE、5-HETE和8_9-DHET。

在优选的实施方式中，与对照相比其浓度升高的一种或多种脂质选自表5中的 脂质：12-HETE、15-HETE、PE P-18:0/20:4、PE O-18:1/20:4、LacCer(d18:1/22:0)和 Cer(d18:1/18:0)。

在另一优选的实施方式中，与对照相比其浓度降低的一种或多种脂质选自表5 中的脂质：5-HETE和8_9-DHET。

在替代性实施方式中，本发明涉及用于确定受试对象是否罹患或有风险发展他 汀引发的肌肉毒性和/或一种或多种其并发症的方法，所述方法包括：确定来自所述 受试对象的样品中的一种或多种脂质比率，其中，与对照相比时所述样品中的脂质比 率升高或降低表明所述受试对象罹患所述他汀引发的肌肉毒性和/或所述并发症，其 中与对照相比升高的一种或多种脂质比率选自表4中的脂质比率： 12-HETE/5-HETrE、12-HETE/8_9-DHET、12-HETE/5-HETE、12-HETE/14_15-DHET、 12-HETE/CE20:4、12-HETE/15-HETrE、12-HETE/LPC16:0、15-HETE/8_9-DHET、 12-HETE/5-HEPE、12-HETE/PC18:0/18:2、12-HETE/CK、15-HETE/5-HETE、 12-HETE/CE18:3、13-HODE/8_9-DHET和15-HETE/15-HETrE；其中与对照相比降 低的一种或多种脂质比率选自表4中的脂质比率：11_12-DHET/CE18:2、 14_15-DHET/CE18:2、11_12-DHET/LacCer(d18:1/24:0)、11_12-DHET/Cer(d18:1/16:0)、 5-HETE/CE20:4、14_15-DHET/LacCer(d18:1/22:0)、 14_15-DHET/Glc/GalCer(d18:1/18:0)、15-HETrE/LacCer(d18:1/22:0)、 11_12-DHET/Cer(d18:1/20:0)、5-HETE/CE18:2、5-HETE/CE18:1、8_9-DHET/CE18:2、 8_9-DHET/CE18:1、8_9-DHET/CE22:6、14_15-DHET/Cer(d18:1/18:0)、 5-HETE/LacCer(d18:1/24:1)、8_9-DHET/CE16:0、5-HETE/Glc/GalCer(d18:1/18:0)、 8_9-DHET/Cer(d18:1/26:0)、8_9-DHET/LacCer(d18:1/16:0)、5-HETE/9-HODE、 8_9-DHET/Cer(d18:1/16:0)、8_9-DHET/Cer(d18:1/26:1)、 8_9-DHET/Glc/GalCer(d18:1/18:0)、11_12-DHET/12-HETE、8_9-DHET/9-HODE、 5-HETE/Cer(d18:1/18:0)、8_9-DHET/AA、5-HETE/PC16:0/20:3、 8_9-DHET/Cer(d18:1/24:1)、8_9-DHET/CE16:1、11-HETE/12-HETE、 8_9-DHET/Cer(d18:1/20:0)、8_9-DHET/PC16:0/20:3和8_9-DHET/Cer(d18:1/18:0)。

在优选的实施方式中，与对照相比升高的一种或多种脂质比率选自表6中的脂 质比率：12-HETE/5-HETrE、12-HETE/5-HETE、12-HETE/CE20:4、 12-HETE/15-HETrE、12-HETE/LPC16:0、15-HETE/8_9-DHET、12-HETE/CK、 13-HODE/8_9-DHET and15-HETE/15-HETrE。

在另一优选的实施方式中，与对照相比降低的一种或多种脂质比率选自表6中 的脂质比率：11_12-DHET/Cer(d18:1/16:0)、5-HETE/CE18:2、8_9-DHET/CE18:1、 8_9-DHET/LacCer(d18:1/16:0)、5-HETE/9-HODE、8_9-DHET/Glc/GalCer(d18:1/18:0)、 5-HETE/Cer(d18:1/18:0)、8_9-DHET/Cer(d18:1/24:1)、11-HETE/12-HETE和 8_9-DHET/Cer(d18:1/18:0)。

在又一替代性实施方式中，本发明涉及用于确定受试对象是否罹患或有风险发展 他汀引发的肌肉毒性和/或一种或多种其并发症的方法，所述方法包括确定来自所述 受试对象的样品中的脂质标志物组合中的一种或多种脂质浓度和一种或多种脂质比 率，其中所述脂质标志物组合包括表2、5或7的至少一种脂质和表4或6的至少一 种脂质比率，其中与对照相比时所述样品中所述脂质的浓度升高或降低和/或所述脂 质比率的升高或降低表明所述受试对象罹患所述他汀引发的肌肉毒性和/或所述并发 症。改变方向(降低或升高)如表2、4、5、6和7所示。

在优选的实施方式中，根据本发明的任何方法确定的脂质浓度是表7中鉴定的任 何脂质组合中的脂质浓度。

在另一方面，本发明涉及用于确定受试对象的他汀治疗和/或降脂药治疗是否需 要调整的方法，所述方法包括确定来自所述受试对象的样品中的一种或多种脂质的浓 度，其中，与对照相比时所述样品中的浓度升高或降低表明所述治疗需要调整，其中 与对照相比其浓度升高的一种或多种脂质选自表2中的脂质：12-HETE、15-HETE、 13-HODE、PE P-18:0/20:4、PE O-18:1/20:4、LacCer(d18:1/22:0)、LacCer(d18:1/20:0)、 PE18:0/20:4、Cer(d18:1/18:0)、LacCer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/20:0)、PC16:0/20:3、 AA、Cer(d18:1/24:1)、Cer(d18:1/26:1)、Glc/GalCer(d18:1/24:1)、Cer(d18:1/22:0)、 Glc/GalCer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/16:0)、LacCer(d18:1/24:1)、SM(d18:1/14:0) (d18:1/13:1-OH)、LacCer(d18:1/16:0)、CE18:3和PC16:0/20:4；并且其中与对照相比 其浓度降低的一种或多种脂质选自表2中的脂质：11_12-DHET、14_15-DHET、 5-HETrE、5-HETE和8_9-DHET。

在优选的实施方式中，与对照相比其浓度升高的一种或多种脂质选自表5中的 脂质：12-HETE、15-HETE、PE P-18:0/20:4、PE O-18:1/20:4、LacCer(d18:1/22:0)和 Cer(d18:1/18:0)。

在另一优选的实施方式中，与对照相比其浓度降低的一种或多种脂质选自表5 中的脂质：5-HETE和8_9-DHET。

在替代性实施方式中，本发明涉及用于确定受试对象的他汀治疗或降脂药治疗 是否需要调整的方法，所述方法包括确定来自所述受试对象的样品中的一种或多种脂 质比率，其中，与对照相比时所述样品中的脂质比率升高或降低表明所述治疗需要调 整，其中与对照相比升高的一种或多种脂质比率选自表4中的脂质比率： 12-HETE/5-HETrE、12-HETE/8_9-DHET、12-HETE/5-HETE、12-HETE/14_15-DHET、 12-HETE/CE20:4、12-HETE/15-HETrE、12-HETE/LPC16:0、15-HETE/8_9-DHET、 12-HETE/5-HEPE、12-HETE/PC18:0/18:2、12-HETE/CK、15-HETE/5-HETE、 12-HETE/CE18:3、13-HODE/8_9-DHET和15-HETE/15-HETrE；并且其中与对照相 比降低的一种或多种脂质比率选自表4中的脂质比率：11_12-DHET/CE18:2、 14_15-DHET/CE18:2、11_12-DHET/LacCer(d18:1/24:0)、11_12-DHET/Cer(d18:1/16:0)、 5-HETE/CE20:4、14_15-DHET/LacCer(d18:1/22:0)、 14_15-DHET/Glc/GalCer(d18:1/18:0)、15-HETrE/LacCer(d18:1/22:0)、 11_12-DHET/Cer(d18:1/20:0)、5-HETE/CE18:2、5-HETE/CE18:1、8_9-DHET/CE18:2、 8_9-DHET/CE18:1、8_9-DHET/CE22:6、14_15-DHET/Cer(d18:1/18:0)、 5-HETE/LacCer(d18:1/24:1)、8_9-DHET/CE16:0、5-HETE/Glc/GalCer(d18:1/18:0)、 8_9-DHET/Cer(d18:1/26:0)、8_9-DHET/LacCer(d18:1/16:0)、5-HETE/9-HODE、 8_9-DHET/Cer(d18:1/16:0)、8_9-DHET/Cer(d18:1/26:1)、 8_9-DHET/Glc/GalCer(d18:1/18:0)、11_12-DHET/12-HETE、8_9-DHET/9-HODE、 5-HETE/Cer(d18:1/18:0)、8_9-DHET/AA、5-HETE/PC16:0/20:3、 8_9-DHET/Cer(d18:1/24:1)、8_9-DHET/CE16:1、11-HETE/12-HETE、 8_9-DHET/Cer(d18:1/20:0)、8_9-DHET/PC16:0/20:3和8_9-DHET/Cer(d18:1/18:0)。

在优选的实施方式中，与对照相比升高的一种或多种脂质比率选自表6中的脂 质比率：12-HETE/5-HETrE、12-HETE/5-HETE、12-HETE/CE20:4、 12-HETE/15-HETrE、12-HETE/LPC16:0、15-HETE/8_9-DHET、12-HETE/CK、 13-HODE/8_9-DHET和15-HETE/15-HETrE。

在另一优选的实施方式中，与对照相比其浓度降低的一种或多种脂质选自表6 中的脂质比率：11_12-DHET/Cer(d18:1/16:0)、5-HETE/CE18:2、8_9-DHET/CE18:1、 8_9-DHET/LacCer(d18:1/16:0)、5-HETE/9-HODE、8_9-DHET/Glc/GalCer(d18:1/18:0)、 5-HETE/Cer(d18:1/18:0)、8_9-DHET/Cer(d18:1/24:1)、11-HETE/12-HETE和 8_9-DHET/Cer(d18:1/18:0)。

同样，在优选的实施方式中，根据本发明的任何方法确定的脂质浓度是表7中鉴 定的任何脂质组合的脂质浓度。

在又一替代性实施方式中，本发明涉及用于确定受试对象的他汀治疗或降脂药治 疗是否需要调整的方法，所述方法包括确定来自所述受试对象的样品中的脂质标志物 组合中的一种或多种脂质浓度和一种或多种脂质比率，其中所述脂质标志物组合包括 表2、5或7中的至少一种脂质和表4或6中的至少一种脂质比率，其中与对照相比 时所述样品中所述脂质的浓度升高或降低和/或所述脂质比率的升高或降低表明所述 治疗需要调整。改变方向(降低或升高)如表2、4、5、6和7所示。

出于确定受试对象的他汀治疗或降脂药治疗是否需要调整的方法的目的，所述他 汀治疗的调整可包括(a)他汀剂量的减少；(b)他汀治疗的停止；(c)他汀治疗的重新 开始；(d)更换为不同的他汀药；(e)更换为不同的降脂药或(f)因与一种或多种他汀 相互作用而导致肌肉毒性的另一种药治疗的停止。

在另一实施方式中，本发明的方法可用于评估正接受新型他汀或脂质降低药物治 疗的受试对象中由所述他汀或脂质降低药物引起的肌肉毒性的程度。

本发明的方法可用于确定所述所述受试对象中肌肉毒性的早期警示征兆。

另外，或作为另一种选择，所述方法可用于确定受试对象中发现的肌肉毒性的症 状是否由他汀引发的肌肉毒性引起。

对于本发明的方法，可以确定表2、4、5、6或7中的至少一种脂质浓度或脂质比 率或其组合，从而评估受试对象是否罹患或有风险发展他汀引发的肌肉毒性和/或一种 或多种其并发症；或从而确定受试对象的他汀治疗或降脂药治疗是否需要调整。不过， 还可以(并且可能有利的是)确定表2、4、5、6或7中的至少2、至少3、至少4、至少 5、至少6、至少7或至少8种所述脂质浓度或脂质比率或其组合。同样，如上所述， 可能有利的是确定表7中鉴定的脂质组合中的脂质的浓度。还可能有用的是进行上述 确定的组合，例如，来确定表2、5或7中至少一种脂质的浓度，和进一步确定表4或 6中至少一种比率。当确定多于一种脂质组学标志物并用于评估时，可能有利的是在 上述评估中特定的脂质浓度或脂质比率或特定的其组合以高于其它的权重给出。

本发明的方法包括确定正用一种或多种他汀治疗的受试对象的样品中的脂质浓 度或脂质比率。

作为选择，本发明的方法包括确定曾用他汀治疗但例如由于肌肉疼痛的发作而中 断所述治疗的受试对象的样品中的脂质浓度或脂质比率。

在另一替代性方案中，本发明的方法包括确定未曾接受过他汀治疗的受试对象的 样品中的脂质浓度或脂质比率。

本发明的方法还可以包括确定来自有高风险发展他汀引发的肌肉毒性和/或一种 或多种其并发症的受试对象的样品中的脂质浓度或脂质比率。

为了本发明的方法的目的，进行受试对象的样品相对于对照的比较。

在优选的实施方式中，所述对照例如是对照样品，优选与受试对象的样品对应的 对照样品。

在优选的实施方式中，对照样品来自进行他汀治疗但在肌肉毒性发作之前的同 一受试对象。不过，对照也可以是来自进行他汀治疗之前或在他汀治疗中断过程中的 同一受试对象的样品。在另一优选的实施方式中，对照还可以来自没有他汀引发的肌 肉毒性的征兆或历史的另一受试对象。

在另一优选的实施方式中，所述对照是来自没有他汀引发的肌肉毒性的征兆或历 史的受试对象群体的对照样品。

不过，在又一优选实施方式中，所述对照不是样品，而仅是由未处于他汀治疗并 且没有肌肉毒性的征兆或历史的一个或多个受试对象建立的对照值。作为选择，对照 可以有利的是由进行他汀治疗并且没有肌肉毒性的征兆或历史的一个或多个受试对 象建立的对照值。

根据本发明，将来自受试对象的所述样品中各脂质浓度或脂质比率优选与对照中 的相应脂质的浓度或相应脂质比率相比较，只要其为用于确定受试对象是否罹患或有 风险发展他汀引发的肌肉毒性(和/或一种或多种其并发症)，或确定受试对象的他汀治 疗或降脂药治疗是否需要调整的对照样品或对照值。可以在受试对象的样品和对照之 间进行的比较的一些说明性实例如下表所示：

另一方面，还可以在来自所述受试对象的样品中的个体脂质的浓度或脂质比率与 对照中的其他个体分子的浓度或比率或分子比率之间进行本发明的比较，同样所述对 照为用于确定受试对象是否罹患或有风险发展他汀引发的肌肉毒性(和/或一种或多种 其并发症)，或确定受试对象的他汀治疗或降脂药治疗是否需要调整的对照样品或对 照值。对照中的所述其他个体分子或分子比率优选是其浓度或比率在所有或至少大部 分受试对象中相似或基本相似的分子或比率，这样所述浓度或比率适合作为确定所述 样品中关于本发明的脂质组学标志物是否存在升高或降低的参照点。关于这点优选的 是例如其他脂质或其他脂质比率。关于这点还优选的是例如蛋白或蛋白比率。关于这 点特别优选的是对照中在临床环境中常规测定的分子或分子比率。例如，优选的是与 对照(同样为对照样品或对照值)中的apoA、apoB、白蛋白或总PC或其组合的浓度进 行比较的实施方式。

在又一实施方式中，本发明的方法还可以包括确定或评估受试对象或来自受试对 象的样品中的肌酸激酶(CK)水平。在本发明的一个实施方式中，受试对象具有升高的 肌酸激酶水平。在本发明的另一实施方式中，受试对象不具有升高的肌酸激酶水平。

根据本发明的方法，所述样品可以是血浆、血清或肌肉活检组织。所述样品还可 以是血液、血浆或血清的组分(fraction)，例如脂蛋白组分。可以制备血液样品，并且 可通过本领域技术人员公知的技术分离血浆或血清或其组分。作为选择，来自受试对 象的所述样品和对照样品还可以是组织样品，例如，肌肉活检组织。

可以通过各种化学和高分辨率分析技术从受试对象样品以及对照样品中根据本 发明的方法收集关于脂质组学标志物(即，此处所述并要求保护的脂质、脂质浓度、 脂质比率或脂质组学标志物组合)的信息。特别适合的分析技术包括但不限于质谱法 和核磁共振谱法。实际上，可以使用任何能够分辨各脂质或脂质类别并提供其结构信 息的高分辨率技术，来从受试对象的样品以及对照样品中确定本发明的脂质组学标 志。因此，对于本发明的方法优选利用质谱法确定脂质浓度或脂质比率。然而，对此 也可以使用核磁共振谱法、荧光光谱法或双偏振极化干涉法、高效分离法诸如HPLC 或UPLC、诸如ELISA等免疫测定法和/或利用能够特异性结合分析物的结合部分。

如上所述，根据本发明方法的替代性或其他实施方式，可以通过将分析物与能够 特异性结合分析物的结合部分组合来检测和/或定量样品中的脂质分析物。结合部分 可以包括例如配体-受体对(即，能够具有特异性结合相互作用的分子对)的一员。结合 部分还可以包括例如特异性结合对的一员，诸如抗体-抗原、酶-底物、核酸类配体、 其它蛋白配体或本领域已知的其他特异性结合对中的一员。

在特别优选的实施方式中，本发明的脂质组学标志物通过质谱法(MS)确定，其中 所述MS装置可选连接有直接注入法和高效分离法，如HPLC或UPLC。在将所收集 的脂质曲线与对照相比时使用所收集的脂质组学标志物中的一定量的各脂质或脂质 类别。

在本发明的另一方面，使用针对表2、3、5或7中任一脂质或针对表4或6中脂 质比率中任一脂质的抗体来预测、诊断、预防或治疗受试对象中他汀引发的肌肉毒性 和/或一种或多种其并发症。同样地，本发明涉及利用针对表2、3、5或7中任一脂 质或针对表4或6中脂质比率中任一脂质的抗体或施用治疗有效量的该抗体来预测、 诊断、预防或治疗受试对象中的他汀引发的肌肉毒性和/或一种或多种其并发症的方 法。

也涵盖在本发明中的是用于预测他汀引发的肌肉毒性和/或一种或多种其并发症 或用于执行本文所述和/或要求保护的方法或应用的试剂盒，其中所述试剂盒包括：(a) 选自表2、3、5或7中的脂质或者表4或6中脂质比率中的脂质的脂质标准物；(b)一 种或多种对照标志物(例如，脂质，优选与本文所述和/或要求保护的任何脂质组学标 志物对应的脂质，或其他脂质，例如，总PC或其他分子，例如蛋白质，诸如apoA、 apoB或白蛋白)；和可选的(c)能够结合表2、3、5或7中的任一种脂质或表4或6中 脂质比率中的任一种脂质的抗体或其他结合部分；和/或(d)用于进行所述方法或应用 的试剂。在优选的实施方式中，试剂盒用于预测他汀引发的肌肉毒性和/或一种或多 种其并发症，或用于进行本发明涵盖的任何方法，其中来自受试对象的样品中的脂质 浓度或脂质比率利用质谱法确定。本发明试剂盒的一种或多种对照标志物可以是例如 脂质或蛋白。一个优选实施方式是其中所要求保护的试剂盒的一种或多种对照标志物 是临床环境中常规测定的分子。例如，优选的是其中一种或多种所述对照标志物是 apoA、apoB、白蛋白或总PC或其组合的实施方式。

在另一方面，本发明涉及用于治疗罹患或有风险发展动脉粥样硬化或心血管疾病 (CVD)和/或一种或多种其并发症的受试对象的他汀或降脂药，其中在应用本文所述和 /或要求保护的任何方法、抗体、试剂盒或应用时所述受试对象将被鉴定为罹患或有 风险发展他汀引发的肌肉毒性。类似地，本发明涉及以他汀或降脂药治疗罹患或有风 险发展动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)和/或一种或多种其并发症的受试对象的方 法，其中在应用本文所述和/或要求保护的任何方法、抗体、试剂盒或应用时所述受 试对象将被鉴定为有风险罹患或发展他汀引发的肌肉毒性。

在另一实施方式中，本发明涉及用于治疗罹患或有风险发展动脉粥样硬化或心血 管疾病(CVD)和/或一种或多种其并发症的受试对象的他汀或降脂药，其中所述受试对 象实际上通过本文所述和/或要求保护的任何方法、抗体、试剂盒或应用已被鉴定为 罹患或有风险发展他汀引发的肌肉毒性。类似地，本发明涉及以他汀或降脂药治疗罹 患或有风险发展动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)和/或一种或多种其并发症的受试 对象的方法，其中所述受试对象实际上通过本文所述和/或要求保护的任何方法、抗 体、试剂盒或应用已被鉴定为有风险发展或罹患他汀引发的肌肉毒性。

在又一方面，本发明涉及用于治疗罹患或有风险发展动脉粥样硬化或心血管疾病 (CVD)和/或一种或多种其并发症的受试对象的他汀或降脂药，其中在应用本文所述和 /或要求保护的任何方法、抗体、试剂盒或应用时所述受试对象将被鉴定为不会罹患 或没有风险发展他汀引发的肌肉毒性。类似地，本发明涉及以他汀或降脂药治疗罹患 或有风险发展动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)和/或一种或多种其并发症的受试对 象的方法，其中在应用本文所述和/或要求保护的任何方法、抗体、试剂盒或应用时 所述受试对象将被鉴定为不会罹患或没有风险发展他汀引发的肌肉毒性。

在另一实施方式中，本发明涉及用于罹患或治疗有风险发展动脉粥样硬化或心血 管疾病(CVD)和/或一种或多种其并发症的受试对象的他汀或降脂药，其中所述受试对 象实际上通过本文所述和/或要求保护的任何方法、抗体、试剂盒或应用已被鉴定为 不会罹患或没有风险发展他汀引发的肌肉毒性。同样地，本发明涉及以他汀或降脂药 治疗罹患或有风险发展动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)和/或一种或多种其并发症 的受试对象的方法，其中所述受试对象实际上通过本文所述和/或要求保护的任何方 法、抗体、试剂盒或应用已被鉴定为不会罹患或没有风险发展他汀引发的肌肉毒性。

在又一方面，本发明涉及用于治疗罹患或有风险发展动脉粥样硬化或心血管疾病 (CVD)和/或一种或多种其并发症的受试对象的他汀或降脂药，其中所述治疗利用本文 所述和/或要求保护的用于确定需要治疗调整的任何方法评估或已经评估，并且其中 所述治疗相应调整或已经相应调整。类似地，本发明本发明涉及以他汀或降脂药治疗 罹患或有风险发展动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)和/或一种或多种其并发症的受 试对象的方法，其中所述治疗利用本文所述和/或要求保护的用于确定需要治疗调整 的任何方法评估或已经评估，并且其中可选的是所述治疗相应调整或已经相应调整。 关于本发明的这一方面，所述调整可适当包括但不限于：(a)他汀剂量的减少；(b)他 汀治疗的停止；(c)他汀治疗的重新开始；(d)更换为不同的他汀药；(e)更换为不同 的降脂药；或(f)因与一种或多种他汀相互作用而导致肌肉毒性的另一种药治疗的停 止。

在本文所述和要求保护的本发明的所有方面和实施方式的情况中，他汀可以是选 自但不限于由阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、氟伐他汀XL、洛伐他汀、匹伐 他汀、普伐他汀、罗舒伐他汀和/或辛伐他汀组成的组中的一种。

在本文所述和要求保护的本发明的所有方面和实施方式的情况中，通常利用测试 来进行脂质浓度或脂质比率的确定。

在本文所述和要求保护的本发明的所有方面和实施方式的情况中，肌肉毒性可以 与肌肉疾病，例如肌营养不良相关。

在本文所述和要求保护的本发明的所有方面和实施方式的情况中，他汀引发的肌 肉毒性并发症特别包括选自肌痛、肌炎、肌病和横纹肌溶解的并发症。他汀肌病或肌 炎通常特征在于肌肉疼痛(肌痛)、肌肉衰弱、关节痛或横纹肌溶解。

附图说明

图1.将病例与对照区分开的两种重要脂质8_9-DHET和15-HETE的ROC曲线。

图2.将病例与对照区分开的三种重要脂质8_9-DHET和15-HETE和15-HETrE 的Roc曲线。

图3.15-HETE、15-HETrE、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/22:0)、9-HODE和5-HETE 的组合的ROC曲线。

具体实施方式

本发明是将脂质组学应用于鉴定指示他汀引发的肌肉毒性的生物标志物而获得 的。其有助于确保恰当的个体以恰当的时间和剂量接受恰当的他汀或降胆固醇药，从 而开启了将迄今更通常采用的药物和/或治疗方案进行个体订制的治疗领域。

由于脂质组学的高灵敏度和特异性，甚至对最小量的样品也能进行分析。

根据本发明，可通过各种技术分析脂质和脂质比率。在本发明的情况中，基于 电喷射离子化质谱法的脂质组学是优选技术。鸟枪法和靶向分析方法的优异品质和特 异性可满足严格的控制标准，诸如当在适当环境中建立时的良好实验室实践指南 (GLP)。

本文所用的肌肉毒性是由药引起的肌肉细胞和/或肌肉组织的不利改变。

本文所用的肌病是指代肌肉的任何疾病的通用术语；肌病可以是获得性的或遗传 性的，并且可以在出生时发生或在以后的生活中发生(来源：NINDS肌病页面 -http://accessible.ninds.nih.gov/health_and_medical/disorders/myopathy.htm)。

本文所用的肌痛是描述不伴随肌酸激酶(CK)升高的肌肉疼痛或衰弱的术语。

本文所用的肌炎是描述伴随CK水平升高的肌肉症状的术语。

本文所用的横纹肌溶解的特征在于具有显著的CK升高(通常比正常[ULN]的上 限大基本10倍)和肌酸酐升高(通常具有棕色尿和尿肌红蛋白)的肌肉症状。

本文所用的肌肉疾病是指任何影响肌肉系统的疾病或紊乱。

本文所用的肌营养不良是使肌肉衰弱的遗传性肌肉疾病。肌营养不良特征在于进 行性骨骼肌衰弱、肌肉蛋白缺陷以及肌肉细胞和组织死亡。肌营养不良可包括杜兴肌 营养不良(duchenne)、贝克尔型肌营养不良、肢带型停止性肌肉萎缩症、先天性肌病、 面肩胛肱型肌营养不良、强直性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良 和/或埃-德型肌营养不良。

本文所用的动脉粥样硬化或CVD并发症特别包括选自心肌梗塞(MI)、AMI、心 绞痛、短暂性脑缺血发作(TIA)、中风和死亡的并发症。

本文所用的一些缩写含义如下：CK是肌酸激酶，ADR是不良药物反应，MS是 质谱法，HPLC是高效液相色谱，UPLC是超高效液相色谱，Roc是接受操作特征， AUC是曲线下面积。

中度至重度的肌酸激酶升高是那些被认为大于10倍ULN或大于10,000IU/L的 升高。温和的CK升高被认为大于ULN但小于10倍ULN(Jacobson TA等:Toward “Pain-Free”Statin Prescribing:Clinical Algorithm for Diagnosis and Management of  Myalgia.Mayo Clin Proc.June2008;83(6):687-700;Joy TR和Hegele RA,Narrative  review:statin-related myopathy.Ann Intern Med.2009Jun16;150(12):858-68)。

本发明中他汀和他汀治疗分别优选为以下他汀和其治疗：西立伐他汀(0.4mg/d, Phillips PS等：Statin-Associated Myopathy with Normal Creatine Kinase Levels.Ann  Intern Med.2002;137:581-585;Evans M和Rees A:The myotoxicity of statins.Current  Opinion in Lipidology.2002,13:415-420)；氟伐他汀(80mg/d,Jacobson TA,等：Toward  “Pain-Free”Statin Prescribing:Clinical Algorithm for Diagnosis and Management of  Myalgia.Mayo Clin Proc.June2008;83(6):687-700)；氟伐他汀XL(80mg/d,Jacobson  TA,等：Toward“Pain-Free”Statin Prescribing:Clinical Algorithm for Diagnosis and  Management of Myalgia.Mayo Clin Proc.June2008;83(6):687-700)；洛伐他汀(40mg/d, Phillips PS等：Statin-Associated Myopathy with Normal Creatine Kinase Levels.Ann  Intern Med.2002;137:581-585)；普伐他汀(40mg/d,Phillips PS等：Statin-Associated  Myopathy with Normal Creatine Kinase Levels.Ann Intern Med.2002;137:581-585; Jacobson TA,等：Toward“Pain-Free”Statin Prescribing:Clinical Algorithm for Diagnosis  and Management of Myalgia.Mayo Clin Proc.June2008;83(6):687-700)；罗舒伐他汀 (2.5mg至20mg，每周1至7次，优选实施方式为5mg或10mg/天，Joy TR和Hegele  RA,Narrative review:statin-related myopathy.Ann Intern Med.2009Jun 16;150(12):858-68)；Jacobson TA等：Toward“Pain-Free”Statin Prescribing:Clinical  Algorithm for Diagnosis and Management of Myalgia.Mayo Clin Proc.June2008; 83(6):687-700);阿托伐他汀(10或20mg/d,Phillips PS等：Statin-Associated Myopathy  with Normal Creatine Kinase Levels.Ann Intern Med.2002;137:581-585);40mg/d (Laaksonen R,等：A Systems Biology Strategy Reveals Biological Pathways and Plasma  Biomarker Candidates for Potentially Toxic Statin-Induced Changes in Muscle.PLoS ONE. 2006年12月,第1期,e97:1-9);40mg/d或80mg/d(Jacobson TA,等：Toward “Pain-Free”Statin Prescribing:Clinical Algorithm for Diagnosis and Management of  Myalgia.Mayo Clin Proc.June2008;83(6):687-700);和/或辛伐他汀(40mg/d或80mg/d, Phillips PS等：Statin-Associated Myopathy with Normal Creatine Kinase Levels.Ann  Intern Med.2002;137:581-585);80mg/d(Laaksonen R,等：A Systems Biology Strategy  Reveals Biological Pathways and Plasma Biomarker Candidates for Potentially Toxic  Statin-Induced Changes in Muscle.PLoS ONE.2006年12月,第1期,e97:1-9;Jacobson  TA,等：Toward“Pain-Free”Statin Prescribing:Clinical Algorithm for Diagnosis and  Management of Myalgia.Mayo Clin Proc.June2008;83(6):687-700)。作为选择，氟伐他 汀、洛伐他汀、普伐他汀、罗舒伐他汀、阿托伐他汀和/或辛伐他汀可以以40mg/d 施用(Jacobson TA,等：Toward“Pain-Free”Statin Prescribing:Clinical Algorithm for  Diagnosis and Management of Myalgia.Mayo Clin Proc.June2008;83(6):687-700)。这 种治疗可以还包括、也可以不包括施用贝特类药物或依泽替米贝(10mg/d,Jacobson  TA,等：Toward“Pain-Free”Statin Prescribing:Clinical Algorithm for Diagnosis and  Management of Myalgia.Mayo Clin Proc.June2008;83(6):687-700)。考来维仑可另外与 依泽替米贝以3.75g/d的剂量一同施用(Joy TR和Hegele RA,Narrative review: statin-related myopathy.Ann Intern Med.2009年6月16日;150(12):858-68)。

对于本发明，降脂药或药物优选为HMG-CoA还原酶抑制剂、尼克酸(烟酸)、胆 固醇吸收抑制剂、胆固醇酯转运蛋白(CETP)抑制剂、胆汁酸螯合剂；贝特类药物或植 物甾醇。

对于本发明，胆固醇吸收抑制剂优选为依泽替米贝或SCH-48461；胆固醇酯转运 蛋白(CETP)抑制剂优选为托彻普、安塞曲匹或达塞曲匹；胆汁酸螯合剂优选为考来维 仑、消胆胺或考来替泊；贝特类药物优选为非诺贝特、吉非贝齐、氯贝特或苯扎贝特。

本文所用的受试对象包括所有哺乳动物，包括但不限于人类，以及非人的灵长类、 狗、猫、马、绵羊、山羊、牛、兔、猪和啮齿类。本发明特别优选的受试对象是人。

本文所用的高风险受试对象通常是采用高他汀剂量和/或采用多种药物治疗(引起 药物相互作用的风险)、具有已知的肌肉疾病或具有可增加不良事件风险的疾病(例 如，甲状腺机能减退、肾功能不全或肝病)的受试对象、特别是人。

本文所用的对照可以是对照样品或仅是对照值。在其为对照值的情况下，应当理 解的是其可以是在开始本发明的方法之前就已经确定、计算或外推的值。作为选择， 可以在根据本发明的方法确定所述一种或多种脂质的浓度或所述一种或多种脂质比 率之后确定、计算或外推对照值。因此，应当理解的是根据本发明合适的对照值可以 恰好是获自文献的值。

将本文所用的样品定义为获自受试对象或受试对象的组或群体的任何生物样品。 对于本发明，生物样品可以是全血、血清或血浆，优选血清和血浆。获得患者的血液 样品是正常临床实践的一部分。血液样品可以联合例如测定患者的胆固醇水平来获 得。可以准备所收集的血液样品，并通过本领域技术人员公知的技术来分离血清或血 浆。可以利用针和塑料管或Plus塑料管(含有喷涂的silia 和用于血清分离的聚合物凝胶的SST^TM管)从患者体内收集静脉血液 样品。可以通过在室温以1300RCF离心10分钟来分离血清，并以小塑料管储存在 -80℃。所述样品也可以是全血、血浆或血清的组分，例如，脂蛋白组分。在另一优 选的实施方式中，所述样品也可以是如肌肉活检组织等组织样品。

根据本发明进行比较的对照中的脂质或其它分子在此处也称为对照标志物。

对于来自同一受试对象或来自(另)一受试对象的本文所用的对照样品可以表示 该对照样品已直接从所述受试对象中获取。不过，作为选择,，其也可以作为对直接 获自或取自所述受试对象的样品进行物理或化学处理(诸如离心、分级、酶促消化和 沉淀等)的结果而获得。这同样适用于在本文中关于来自受试对象组或来自受试对象 群体的对照样品的情况。

本文使用的术语来自受试对象组的对照样品或来自受试对象群体的对照样品进 而优选要求该对照样品代表所述组或群体。在此情况下，代表应当表示在本发明中进 行比较的所述对照样品中一种或多种脂质的浓度对应于来自所述组或群体的受试对 象的相应各样品的所述脂质的平均浓度。优选的是，所述对照样品中所有脂质的浓度 对应于来自所述组或群体的受试对象的相应各样品中的所述脂质的平均浓度。类似的 是，当本发明中分别与一种或多种其他分子(例如，其他脂质或蛋白质诸如总PC或 poA、apoB或白蛋白)进行比较时，代表性对照样品是其中所述分子的浓度对应于来 自所述组或群体的受试对象的相应各样品中的所述分子的平均浓度的样品。在优选的 实施方式中，在本发明的意义中来自受试对象组的对照样品或来自受试对象群体的对 照样品通过将直接获自或取自所述组或群体的受试对象的等量样品混合获得，或通过 将其等量的组分、成分或其反应产物(例如，酶促反应产物或沉淀物)混合而获得。

如本文所用的对照样品对应于受试对象的样品，只要其已经以相同或基本相同的 方式获得自同类生物组织或来源即可。例如，如果受试对象的样品是全血、血浆或血 清样品或其组分，则相应的对照样品也应该分别是全血、血浆或血清样品或其组分。 应当意识到的是，这种相应的对照样品可包括通过混合获得自受试对象组或群体的全 血、血浆或血清样品或其某一组分而获得的全血、血浆或血清样品或其组分(还见此 处的进一步解说和关于本发明的合适的对照样品的权利要求)。这在加以必要改变时 同样适用于例如组织样品。

将本文使用的脂质定义为疏水性或两亲性小分子。

对于本发明，根据以下命名法来指代脂质：CE为胆固醇酯，Cer为神经酰胺， DAG为二酰甘油，PC O为醚连接的PC，GD为二唾液酸神经节苷脂，GlcCer为半 乳糖基-和葡萄糖基神经酰胺，GM为单唾液酸神经节苷脂，LacCer为乳糖基酰基神 经酰胺(lactosylceramide)，LPC为溶血磷脂酰胆碱，PC为磷脂酰胆碱，PE为磷脂酰 乙醇胺，PI为磷脂酰肌醇，SM为鞘磷脂，S1P为鞘氨醇-1-磷酸酯，HETE为羟基二 十碳四烯酸，DHET为二羟基二十碳三烯酸，HODE为羟基十八碳二烯酸，HETrE 为羟基二十碳三烯酸，AA为花生四烯酸，HEPE为羟基/过氧羟基二十碳五烯酸，EPA 为二十碳五烯酸，DHA为二十二碳六烯酸。

命名X:Y表示：分子的脂肪酸部分中总碳原子数为X，并且分子的脂肪酸部分 中双键的总数为Y。

命名A/B表示：对于DAG和PC分子，与分子的甘油主干连接的脂肪酸部分有 A类和B类。

命名(dC/A)表示：对于Cer、GlcCer、LacCer和SM分子，C类的长链基带有酰 胺连接的A脂肪酸部分，C为连接有酰胺的长链碱(long-chain base)的类型，A为脂肪 酸部分。

本文所用的术语抗体包括可展示与所述脂质特异性结合的单克隆抗体和多克隆 抗体、完整抗体、抗体片段和抗体亚片段。因此，适合的抗体可以是任何类别的完整 免疫球蛋白，例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，嵌合抗体或具有双或多抗原或表位特 异性的杂交抗体，或片段，例如，F(ab')₂、Fab'和Fab等，包括杂交片段，还包括通 过与特异性抗原结合形成复合物而具有类似抗体的行为的任何免疫球蛋白或任何天 然、合成或基因工程化蛋白。术语抗体涵盖了抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、 Fab片段、F(ab’)₂、Fd片段、Fv片段和dAb片段)以及完整的抗体。例如，Fab分子 可以在基因工程转化的宿主如大肠杆菌中表达并组装。因此λ载体系统可用于表达潜 在多样性等于或超出产生前驱抗体的受试对象的Fab's群。参见Huse WD,等.,Science 1989,246:1275-81。这种Fab’s也被包含在抗体的定义中。可以通过本领域已知的结 合测试，例如利用作为结合伴侣(binding partner)的感兴趣的抗原的结合测试，来确定 给定分子(包括抗体片段或亚片段)有类似抗体的行为和特异性结合特异抗原的能力。

可以通过本领域技术人员已知的方法来制备本发明的针对脂质的抗体。例如，可 以以脂质加佐剂来免疫小鼠。以2周的间隔施用3次将小鼠免疫化，在隔周进行取血 来测试血清抗体滴度，从所述小鼠体内收集脾细胞作为储库。将脾细胞制备为3等份， 每份用于立即进行融合实验，或在液氮中储存用于以后的融合。

根据Stewart&Fuller,J.Immunol.Method1989,123:45-53的程序进行融合实验。 在包被有所述脂质的96孔ELISA板上通过酶联免疫吸附测定(ELISA)对来自具有生 长中的杂交物的孔中的上清液筛选单克隆抗体(MAb)分泌者。ELISA阳性培养物通过 有限稀释来克隆，通常在2次连续克隆实验后从单集落中建立杂交瘤。

实施例

实施例1

材料和方法

对于该研究，受试对象选自表现出根据严格标准确定的明显的肌肉不可耐受表 型的患者群。

受试对象入选标准如下：

-参与本研究的书面知情同意书；

-年龄18岁以上的男性或女性；

-通过以下任一项表明的与他汀相关的肌肉毒性的记载文件：

o在他汀治疗期间出现并在取消或减少剂量后停止的肌肉疼痛；或

o在启动他汀治疗之后开始并在被认为不可停止他汀施用的患者中仍进 行治疗时持续的肌肉疼痛；或

o在患者进行他汀治疗时出现并明显被其医师认为与他汀相关的肌肉疼 痛；或

o由于因肌肉疼痛或衰弱、肌病或横纹肌溶解对他汀不耐受而将降脂方案 由他汀改为依泽替米贝的患者；或

o在用他汀治疗时血浆CK水平升高超过正常上限的1.5倍，没有解释这种 异常的其他原因；或

o在用他汀治疗时存在肌红蛋白尿症或肌红蛋白血症，没有解释这种异常 的其他原因；

o用他汀治疗时临床诊断为横纹肌溶解，没有其他合理原因。

受试对象排除标准如下：

-据医生判断肌肉疼痛不明显与他汀使用相关的患者；

-至少最近3个月不能通过稳定剂量的补充剂控制并且在肌肉毒性期间发生 的甲状腺机能减退；

-最近一年有已知的甲状腺机能亢进并且在肌肉毒性期间发生；

-最近一年的酒精或药物滥用历史并且在肌肉毒性期间发生；

-已知有肾功能不全(并非继发于横纹肌溶解)，在肌肉毒性的时候血清肌酸 酐水平为200μmol/L以上；

-已知有严重的肝病，在肌肉毒性的时候有硬化、胆道梗阻、急性或慢性传 染性肝炎；

-已知有遗传性或获得性肌肉疾病；

-根据医生的意见可能使患者不适合作为本研究的候选对象的任何内科或 精神科病况。

-在招募30天内参与过任何其他研究性药物研究。

对照入选标准如下：

-参与本研究的书面知情同意书；

-年龄18岁以上的男性或女性；

-已知有血脂异常，以稳定剂量的他汀治疗至少3个月；

-目前或过去没有他汀相关的副作用。

对照排除标准如下：

-至少最近3个月不能通过稳定剂量的补充剂控制的甲状腺机能减退，除非 在病况之前就已经确认没有因他汀引起的肌肉毒性；

-最近一年有已知的甲状腺机能亢进，除非在病况之前就已经确认没有因他 汀引起的肌肉毒性；

-最近一年有酒精或药物滥用历史，除非在病况之前就已经确认没有因他汀 引起的肌肉毒性；

-已知有肾功能不全，在招募时血清肌酸酐水平为200μmol/L以上，除非在 病况之前就已经确认没有因他汀引起的肌肉毒性；

-已知有严重的肝病，在募集时有硬化、胆道梗阻、急性或慢性传染性肝炎， 除非在病况之前就已经确认没有因他汀引起的肌肉毒性；

-已知有遗传性或获得性肌肉疾病；

-根据医生的意见可能使患者不适合作为本研究的候选对象的任何内科或 精神科病况。

-在招募30天内参与过任何其他研究性药物研究。

表1.利用脂质组学分析出的他汀肌病患者的背景特征

  阿托伐他汀当量剂量 年龄 CK 对照(n=40) 40.5 63 94 病例(n=40) 40.5 63 95

分析方法

质谱法驱动的脂质组学

使用了直接注入联用串联质谱法(即，鸟枪脂质组学)和两个液相色谱串联质谱 (LC-MS/MS)方法(即，神经酰胺和脑苷脂脂质组学与类花生酸脂质组学)通过分析人血 浆中的分子脂质物质来鉴定他汀引发的肌肉毒性。将所采用的方法特别针对以下物质 的定量进行了优化：分子胆固醇酯(CE)、磷脂酰胆碱(PC)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)和 其他溶血磷脂(LPL)、醚连接的磷脂酰胆碱(PC O)和其他醚连接的磷脂(PL O)、磷脂酰 丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、二 酰甘油(DAG)、神经酰胺(Cer)、葡萄糖基神经酰胺(GlcCer)、乳糖基酰基神经酰胺 (LacCer)、游离氨基酸(FFA)和类花生酸进行了优化。

根据所述方法使用以下材料。HPLC或LC-MS级的氯仿、甲醇、水、乙腈、甲 酸、甲醇、异丙醇、乙酸铵、乙酸、氯化钾和丁基化羟基甲苯(BHT)购自Sigma-Aldrich (St.Louis,MO,USA)。

HPLC柱(Acquity BEH C18,2.1×50mm id.1.7μm)购自Waters(Milford,MA, USA)。HPLC预柱(Widepore C184x2.0mm)购自Phenomenex(Torrance,CA,USA)。 所有用于萃取的实验器皿均耐氯仿。抗气溶胶的过滤吸头(Molecular BioProducts)和 Eppendorf2ml安全锁管、96孔twin.tec PCR板和Pierce-it-lite热密封箔购自VWR  International(West Chester,PA,USA)。CO-RE过滤吸头和96孔2ml Whatman Uniplates 购自Hamilton Robotics(Bonaduz,Switzerland)。合成脂质标准物购自Avanti Polar  Lipids(Alabaster,AL,USA)、Matreya(Pleasant Gap,PA,USA)和Cayman Chemical(Ann  Arbor,MI,USA)。

根据以下策略将脂质在氯仿：甲醇中提取。样品掺有已知量的非内源性合成内标 物，以用于数据标准化和内源脂质定量。提取后掺杂的非内源性合成外标物用于质量 控制。将适当称量的量的各标准物溶于氯仿：甲醇(2:1,v/v)中得到500μM的终浓度， 从而制备标准物的原液。含有各标准物原液的内标准物混合物在脂质提取中产生和使 用。

将5μl的血浆用于鸟枪脂质组学，10μl的血浆用于神经酰胺和脑苷脂脂质组学。 利用Hamilton MICROLAB STAR系统(Hamilton Robotics,Switzerland)以自动方式进 行脂质提取。将充分混合的样品等分到含有冰冷甲醇和0.1%BHT的96孔2ml  Whatman Uniplate中。在提取策略的各步骤之后充分混合样品。通过添加适当体积的 内标准物混合物以及氯仿和甲醇，在室温下进行提取。在鸟枪以及神经酰胺和脑苷脂 脂质组学中，通过添加20mM乙酸并在500×g将平板离心5分钟来促进有机相分离。 将有机相转移到新的96孔2ml Whatman Uniplate中。剩余的含水相通过添加适当体 积的氯仿随后离心来洗涤。将两个有机相收集并在N₂下蒸发至干燥。脂质提取物随 后再溶解在包含添加的合成外标准物的氯仿：甲醇(1:2,v/v)中。在MS分析之前将提 取物于-20℃存储在2ml安全锁Eppendorf管中。将所需量的脂质提取物等分到 Eppendorf96孔twin.tec PCR板中，将板以铝箔热封闭以避免蒸发。

在鸟枪脂质组学中，在配备有机器人纳米流离子源(NanoMate HD,Advion  Biosciences)的混合三重四级杆/线性离子阱质谱仪(QTRAP5500,AB Sciex)上分析脂 质提取物。仪器在正、负离子模式下运行。在正离子模式下喷射电压设定为1.0kV 至1.4kV，在负离子模式下喷射电压设定为-1.0kV至-1.4kV。使用0.3psi至0.8psi 的气压，界面加热器设定为60℃。利用合成标准对各脂质种类优化碰撞能量(CE)和 去簇电压(DP)。质谱仪利用200Da/s的扫描速率在单位分辨模式下运行。如Stahlman 和colleagues所述(Stahlman M,等：High-throughput shotgun lipidomics by quadrupole  time-of-flight mass spectrometry.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci2009)， 利用多前体离子扫描(MPIS)和中性丢失扫描(NLS)以正、负离子模式分析分子脂质。

在神经酰胺和脑苷脂脂质组学中，以下述方式进行高效液相色谱(HPLC)分析。 色谱装置由CTC HTC PAL自动进样器(CTC Analytics AG,Switzerland)、Rheos Allegro  UHPLC泵(Flux Instruments AG,Switzerland)、外部柱加热器(设为60℃用于神经酰胺 与脑苷脂脂质组学)和带有串联的预柱的Acquity BEH C18柱组成。提取的样品(每种 10μl)注射到预柱中，随后进入分析柱中，并以500μl/分钟的流速传送至质谱仪。在 神经酰胺和脑苷脂脂质组学中，利用以下溶剂使用了梯度来进行脂质分析物的分离： 溶剂A包含在含有0.1%甲酸的HPLC级水中的10mM乙酸铵，溶剂B为在含有0.1% 甲酸的乙腈:异丙醇(4:3，v:v)中的10mM乙酸铵。以下述方式来构建该梯度：0分钟 –65%B；2分钟–65%B；2.5分钟–75%B；17.5分钟–100%B；22.5分钟–100%B； 22.6分钟–65%B；25分钟–65%B。

通过HPLC-MS/MS分析脂质提取物。在配备有Turbo V^TM离子源(4000QTRAP, AB Sciex)的混合三重四级杆/线性离子阱质谱仪上进行MS分析。仪器在正离子模式 下运行。离子源电压对于神经酰胺和脑苷脂脂质组学设定为5500V，对于神经节苷脂 脂质组学设定为-4500V，源温度为400℃。利用合成标准对各脂质种类优化碰撞能量 (CE)和去簇电压(DP)。对各扫描应用20秒的停留时间。采用多反应监测(MRM)扫描 模式，该模式基于Sullards及其合作者的描述(Sullards MC,等：Structure-specific, quantitative method for analysis of sphingolipid by liquid chromatography-tandem mass  spectrometry："inside-out"sphingolipidomics.Methods Enzymol2007)。

利用固相提取(SPE)技术来提取类花生酸。将150μl血浆以含有0.1%丁基化羟基 甲苯(BHT)的10%甲醇提取。样品掺有已知量的非内源性合成内标准物以便数据标准 化和内源脂质定量。在脂质提取中产生和使用含有各标准物原液的内标准物混合物。 Strata-X33um SPE盒以HPLC级甲醇调湿，然后是以超纯水(UPW)进行的调湿步骤。 将样品加载到SPE上，然后利用35%甲醇进行洗涤步骤。将类花生酸以乙腈洗脱， 所述样品洗脱物在氮气下干燥。最终的样品提取物在甲醇中重构，并通过质谱法直接 分析。

类花生酸的分析中，按下述方式进行高效液相色谱(HPLC)分析：色谱装置由CTC  HTC PAL自动进样器(CTC Analytics AG,Switzerland)、Rheos Allegro UHPLC泵(Flux  Instruments AG,Switzerland)、设定至45℃的外部柱加热器和切换阀(Valco Instruments  Co.Inc.and VICI AG,Huston,USA)组成。利用Phenomenex Jupiter,250×2.0mm id.5 μm HPLC柱(Phenomenex,Inc,Torrance,CA)进行分离。将所提取的样品(每种10μl) 注射到分析柱中并以300μl/分钟的流速输送至质谱仪。对于脂质分析物分离采用以 溶剂A(由含0.1%甲酸的乙腈:水(63:37(v/v)组成))和溶剂B(乙腈：异丙醇(50:50(v/v))) 形成的梯度。该梯度以下述方式产生：0分钟–0%B；6分钟–20%B；6.50分钟–55% B；10.0分钟–55%B；12.0分钟–100%B；14.0分钟–100%B；14.50分钟–0%B； 18.0分钟–0%B。

通过HPLC-MS/MS分析脂质提取物。在配备有Turbo V^TM离子源(4000QTRAP, AB Sciex)的混合三重四级杆/线性离子阱质谱仪上进行MS分析。仪器在负离子模式 下运行，并且离子源电压设定为-4500V。利用合成标准(在适用时)对各脂质种类优化 碰撞能量(CE)和去簇电压(DP)。采用多反应检测(MRM)扫描模式，其基于Deems及 其合作者的描述(Deems,R.,等：Detection and quantitation of eicosanoids via high  performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry.Methods  Enzymol2007)。

以下述方式完成数据处理：利用内源性标准物并在适用时通过信息依赖获取(IDA) 实验完成最初保留时间(在LC模式中)和各峰的鉴定。根据所检测到的峰和保留时间 (在LC模式下)，以自动方式处理原始数据。施加严格的截断值，从而将背景噪音与 实际的脂质峰分开。控制每个样品，且仅在满足严格接受标准时接受样品。将所检测 到的峰的峰面积计数(cps)转化为对应的脂质名称列表。将脂质归一化至其相应的内标 准物和样品体积，以获得其浓度。

合成内标准物(IS)与相应提取后掺杂的外标准物(ES)的比例，和用于分析的质量 控制(QC)的提取基质和溶剂的MS分析。另外，对所提取的参比血浆样品进行分析来 监测仪器的性能，即，测试内和测试间偏差。

在样品分析之前获得利用合成或分离标准物的校准曲线。合成标准物基于应用选 择并具有与感兴趣的内源脂质或分析物相似的性质。校准曲线由覆盖预期的定量范围 的最少5个标准物点构成。校准曲线用于确定所监测的各脂质种类的动态定量范围， 例如，线性定量限制。由于所用的内标准物具有与内源脂质相同的行为，将其用于对 内源脂质物质定量。校准曲线基于与内源脂质定量所用相同的内标准物。

对于各平台，用严格的截断值，以将背景噪声与实际的脂质峰分开。控制每个样 品，且仅在满足严格接受标准时接受样品。将所检测到的峰的质量和计数转化为对应 的脂质名称列表。将脂质归一化至其相应的内部标准物和样品体积，以获得其浓度。

统计分析

对照和病例组之间的脂质浓度的百分比变化计算如下：

100×(病例组的平均[C]–对照组的平均[C])/对照组的平均[C]。

通过两种独立的样品t检验和Mann-Whitney U-检验的p-值来得到统计学显著性。

另外，使用了ROC曲线来找到将最佳病例与对照分开的脂质分子和浓度截断值。 选择性按照正确鉴定的病例数除以病例总数来计算。特异性按照正确鉴定的对照数除 以对照总数来计算。针对每个脂质浓度、脂质：脂质比率和脂质：临床浓度比率都计 算了选择性和特异性。将显著的生物标志物定义为基于t检验的p-值为0.05或灵敏度 >=60%并且特异性=>40%的那些分子或比率。

另外，为了证明有改善的诊断能力，表7示出了利用脂质组合的数理回归模型的 实施例。对数理模型进行拟合以便找到可以将病例与对照相互分开的不同脂质组合。 首先，将所有脂质设定为可能的解说性变量，并利用逐步法通过0.1的进入显著性水 平和0.05的保留显著性水平来选择模型。发现了两种显著的脂质：8_9-DHET和 15-HETE。通过模型中的这两种脂质，AUC值是0.8056(图1)。通过更高的进入和保 留值，模型中包含了又一种脂质15-HETrE，得到了0.8106的AUC-值(图2)。对相同 的模型进行拟合，不过进入和保留显著性值更高。这意味着对于该模型选择脂质所用 的标准不像之前模型中那样严格。通过这个更松的标准，对于该模型选择了6种脂质： 15-HETE、15-HETrE、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/22:0)、9-HODE和5-HETE。通过 这些脂质，AUC值为0.8788(图3)。

结果

在该研究样品组中，在对照和病例中肌酸激酶水平实际上相同，因此这一通常使 用的酶标志物不能预测或诊断他汀引起的肌病。

另一方面，脂质组学生物标志物表现出可作为他汀引起的肌病的显著性生物标志 物。如上所述总共290种分子脂质在本研究中进行了定量。其中，基于设定的统计学 标准，27种分子脂质是显著性生物标志物。基于分子脂质浓度的显著性生物标志物 候选物在表2中给出。作为脂质组学生物标志物的诊断值在其水平表现为明显的脂质 -脂质比率时升高。表3和表4中列出了基于比率的生物标志物候选物。

表5和表6中列出了在所鉴定的生物标志物候选物中选择的优选实施方式。

表2.基于个体脂质或脂肪酸测定的显著性生物标志物。给出了物质名称、p-值、 百分比变化、auc-值；以及特异性和灵敏度。

表3.在计算区分研究组的比率时所用的测定。在比率中使用了这些测定中的至 少两种的任意组合。

表4.基于比率的显著性生物标志物。基于p-值、百分比变化、AUC-值、灵敏度 和特异性选择显著性生物标志物。

表5.基于一种脂质或脂肪酸测定的生物标志物的优选实施方式

表6.基于测定比率的生物标志物的优选实施方式

表7.利用数理建模产生的脂质组合的实施例。脂质组合与单一测定相比产生更 高的AUC值，因此改进了诊断能力。该表中示出了与对照相比的病例中各脂质标志 物的变化方向。

图1至3中的数据表明脂质的三种不同组合是指示他汀引起的肌病的预测性生物 标志物：(i)15-HETE、15-HETrE、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/22:0)、9-HODE和5-HETE； (ii)8_9-DHET、15-HETE和15-HETrE；和(iii)8_9-DHET和15-HETE(参见表7)。

总之，本研究提供了他汀引发的肌肉毒性的新脂质标志物。由于研究样品组中的 肌酸激酶水平在对照和病例之间实际相同(表1)，因此所述脂质组学生物标志物是他 汀引发的肌肉毒性的更具有特异性和灵敏度的标志物。