他克莫斯FK506在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用

摘要

本发明涉及他克莫斯逆转非小细胞肺癌细胞对靶向性抗肿瘤药物耐受的新用途。本发明公开了他克莫斯FK506在制备非小细胞肺癌细胞对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体增敏剂中的应用。FK506联用TRAIL可以上调细胞膜表面的DR4mRNA与受体水平。这些结果表明FK506能联用TRAIL，增强TRAIL对耐受性肿瘤的治疗效果。

说明书

技术领域

本发明涉及他克莫斯逆转非小细胞肺癌细胞对靶向性抗肿瘤药物耐受的新用途。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病。江苏省近几年开展了以恶性肿瘤为主的全人口死 因回顾性调查,结果显示男女性第1位死因均为恶性肿瘤，其死亡率占全部死因的27.41%。 资料显示，2003年江苏省城市地区位于恶性肿瘤死亡前4位的分别是肺癌、胃癌、肝癌、食 管癌；而农村地区为肝癌、肺癌、食管癌、胃癌。肺癌和胃癌死亡率城市明显高于农村。尤 其是通过分析1973至2004年几种主要恶性肿瘤的死亡情况发现，肺癌死亡率大幅上 升,2004年肺癌死亡率是1973年的5.65倍。由此可见，肺癌已经成为我省恶性肿瘤数一数 二的“杀手”，严重威胁着我省人民的生存健康。

为什么在短短的几十年间，肺癌的发病率及死亡率有如此迅猛的发展趋势？1：大样品 调查研究表明肺癌的主要危险因素为吸烟和大气污染,而近年来吸烟人数有增加的趋势,汽车 尾气和工业废气的大量排放,又加重了大气环境污染的程度。因此,随着我省经济的发展，城 市化、工业化进程的加快，空气污染将会越来越严重，这将不可避免地导致肺癌死亡率进一 步增加。2：肺癌在早期时往往没有明显的症状，当有症状被诊断出来时，常常已经是局部晚 期或晚期无法手术切除的情形。一般而言，新诊断的肺癌仅约不到20%的病人属于早期可以 有机会接受手术切除的病患。而另外80%的晚期肺癌病人则失去了外科手术根治的最佳时机。 3：到目前为止，对肺癌的治疗，尤其是晚期肺癌病人缺乏非常有效的治疗干预手段。

临床上，肺癌通常分为小细胞与非小细胞肺癌两种类型，总的肺癌病例中，非小细胞肺 癌（包括肺鳞癌，肺腺癌）约占80%。因此针对非小细胞肺癌的治疗研究是攻克肺癌的一项 极其重要的课题，引起了全世界医学界的广泛关注。

如上所述，虽然手术治疗是治疗非小细胞肺癌的重要手段，但对绝大部分晚期肺癌病人 来说手术治疗并不能有效解决肿瘤转移的问题。因此对于这些晚期或已经有远端转移的肺癌 病人，全身性的化学治疗是非小细胞肺癌多学科综合治疗的主要策略之一。尤其是化疗与手 术、放射等疗法综合运用能明显防止癌肿转移、复发，提高长期生存率。现在，非小细胞肺 癌化疗已经初步形成共识，通常采用顺铂加泰索帝、紫杉醇、健择、诺维本等中的一种。根 据患者的具体情况，选择不同的组合，可以达到提高疗效，降低毒性反应的目的，特别是出 现了一些极具前景的新型靶向药物，其作用机制与传统化疗药物不同。传统化疗药物属于细 胞毒性药物，是通过毒性杀死肿瘤细胞，但同时不可避免会伤害正常细胞。而靶向药物进入 肿瘤细胞后，可以通过特异性作用于肿瘤生长的细胞信号途径，抑制肿瘤细胞的增殖、浸润、 转移，不良反应轻，患者可以很好耐受。

是目前已知的一种肿瘤细胞凋亡诱导分子，对正常细胞一般无明显作用，是一种极具前 景的抗癌药物。然而目前研究发现，许多恶性肿瘤细胞对TRAIL具有耐药性，使TRAIL在临 床应用中遭遇瓶颈。在这些靶向药物中，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis  factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)越来越受到人们的关注。TRAIL是由Wiley 于1995年检索EST时首次发现并克隆的，是一种II型糖蛋白，属于肿瘤坏死因子家族,与相应 受体结合后，可以快速诱导细胞发生凋亡。但与其它凋亡诱导分子显著不同的是，TRAIL主 要杀伤转化细胞和肿瘤细胞，而正常细胞可以逃逸它的杀伤作用。体内研究表明，TRAIL可 以明显抑制肿瘤生长，甚至彻底清除肿瘤。TRAIL的这种肿瘤细胞选择性杀伤作用使该蛋白 在抗肿瘤方面具有很强的开发价值与潜力。但是值得注意的是，并非所有的肿瘤细胞对TRAIL 都具有很强的敏感性。体外研究表明，有些肿瘤细胞对TRAIL诱导凋亡作用具有很强的耐受 性。这可能与肿瘤细胞表面缺乏TRAIL受体（DR4，DR5），或分布有假受体（DcR1,DcR2）, 或过度表达一些抗凋亡蛋白如bcl-2,FLIP,survivin有关。因此TRAIL的抗肿瘤作用因不同的肿 瘤类型而异。

研究表明，非小细胞肺癌细胞对TRAIL有明显的耐受性，但具体的机理目前并不清楚。 为了充分发挥TRAIL对肿瘤细胞的选择杀伤作用，有必要寻找新的策略以逆转非小细胞肺癌 细胞株对TRAIL的敏感性，从而达到运用TRAIL有效治疗非小细胞肺癌的目的。

他克莫斯FK506是从链霉菌属中分离出来的大环内酯类抗生素，广泛应用于自身免疫疾 病的治疗以及器官移植导致的免疫排斥反应，但是到目前为止，将FK506用于肿瘤增敏剂治 疗肺癌并没有相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供他克莫斯FK506的一种新用途。

本发明公开了他克莫斯FK506在制备他克莫斯FK506在制备治疗非小细胞肺癌药物中 的应用。

本发明公开了他克莫斯FK506在增强非小细胞肺癌细胞对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导 配体（TRAIL）敏感性中的应用。

基于上述应用，他克莫斯FK506用于制备非小细胞肺癌细胞对肿瘤坏死因子相关的凋亡 诱导配体（TRAIL）增敏剂。

本发明公开了他克莫斯FK506与TRAIL一起制成药物组合物，在制备治疗非小细胞肺 癌的药物中应用。

本发明中，我们首次发现FK506能显著增强TRAIL耐药肿瘤细胞株，肺癌细胞株A549 对TRAIL诱导凋亡的敏感性，且这种增强效应具有明显的剂量效应和时效性。而FK506对 TRAIL诱导凋亡的增敏性对PMBC以及非肿瘤细胞的正常肺支气管细胞株HBE以及 BEAS-2B无明显作用。另外，FK506对TRAIL诱导细胞凋亡的增敏性还具有广谱性，在对 TRAIL耐药的白血病细胞株中，FK506能明显增强HL-60、U937对TRAIL诱导凋亡的敏感 性。分子机制研究表明FK506联用TRAIL处理的A549细胞中，参与凋亡调控的相关蛋白发 生应答，其中TRAIL受体DR4的表达水平显著增加，FK506联用TRAIL可以上调细胞膜 表面的DR4mRNA与受体水平。这些结果表明FK506能联用TRAIL，增强TRAIL对耐受性 肿瘤的治疗效果。

附图说明

图1FK506剂量依赖性地增强A549细胞对TRAIL诱导的凋亡。

图2FK506时间依赖性地增强A549细胞对TRAIL诱导的凋亡。

图3BEAS-2B与A549细胞对FK506联用TRAIL诱导凋亡的敏感性比较。

图4PBMC与A549细胞对FK506联用TRAIL诱导凋亡的敏感性比较。

图5HBE与A549细胞对FK506联用TRAIL诱导凋亡的敏感性比较。

图6FK506联用TRAIL对白血病细胞U937的凋亡的影响。

图7FK506联用TRAIL对白血病细胞HL-60的凋亡的影响。

图8FK506联用TRAIL对白血病细胞K562的凋亡的影响。

图9FK506联用TRAIL对白血病细胞CCRF-CEM的凋亡的影响。

图10FK506联用TRAIL增强A549细胞促凋亡蛋白的应答。

图11FK506联用TRAIL增强A549细胞表面DR4的水平。

图12不同剂量的FK506联用TRAIL对DR4mRNA水平的影响。

图13FK506联用TRAIL时间依赖性地上调DR4mRNA水平。

图14FK506联用TRAIL DR4mRNA转录后调控水平的影响。

具体实施方式

1、实验材料、试剂

细胞：A549(ATCC,CCL-185，由中国科学技术大学生命科学学院吴清发课题组惠赠)用含 10%的FBS、1%的链霉素青霉素双抗的DMEM培养基培养，HBE、BEAS-B、U937、HL-60、 K562（该5株细胞系由南京大学生命科学学院徐强课题组惠赠）、CCRF-CEM（由南京大学 化学化工学院朱俊杰课题组惠赠）以及从新鲜抗凝血（来自江苏省南京市省肿瘤医院）分离 的PBMC细胞用含10%的FBS、1%的链霉素青霉素双抗RPMI1640培养基培养。

分子试剂：单核细胞分离液(TBD，LDS1075)、全血及组织稀释液(TBD,2010X1119)、MLV 反转录试剂盒(MBI,K1621)、Taq酶(sangon,SC0010))、Trizol(sangon,SK1312)、Annexin  V-eGFP、碘化丙碇(PI)、放线菌素(ActD，sigma,A14105mg)，PARP antibody(Oncogene, AM30-100ug)、caspase3antibody(CST,#8610)、caspase8antibody(CST,#1C12)、caspase9 antibody(CST,#5902)、FLIP L antibody(santa cruz,H-150)、FLIP s/L antibody（santa cruz, H-202)、BCL-2antibody(CST,#2876)、BCL-xL antibody(CST,#2762)、BAX antibody(BD, 556467)、DR4antibody（IMGENEX，IMG-141A）、DR5antibody（IMGENEX，IMG-120A）、 Alexa Fluor488Goat Anti-Mouse IgG(invitrogen，A11029)、Goat Anti-Mouse IgG(santa cruz, SC-2005)、Goat Anti-rabbit IgG(santa cruz,SC-2004)、normal IgG（santa cruz,SC-2025）

2、PCR引物

用于半定量检测DR4mRNA表达水平的引物为

RT DR4F:5’-CTGTGCTGATTGTCTGTTGTTGC-3’（SEQ ID NO.1）;

RT DR4R:5’-GCCTCCTCCTCTGAGACCCTT-3’（SEQ ID NO.2）

内参引物为RT GAPDH F:5’-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3’（SEQ ID NO.3）;

RT GAPDH R:5’-GCAGGAGGCATTGCTGAT-3’（SEQ ID NO.4）。

3实验方法：

3.1PBMC分离

取新鲜的抗凝血10mL,与全血及组织稀释液1:1混匀，将混合液小心叠加于分离液的液 面上(混合液：分离液=2:1)，可以分成3个15mL离心管，500g,RT离心15min，小心取出离 心管,此时离心管分为4层，最上层为血浆层，其次是乳白色的淋巴细胞层，第三层是透明分 离液层，最下面是红细胞层，吸掉第一层，小心将第二层取出，加入10mL的RPMI1640培 养基(含有10%的FBS和1%的链霉素青霉素双抗)重新悬浮细胞，2000rpm离心10min，再重 复一次。用少量RPMI1640培养基悬起，按照实验需求进行相应稀释，并转移入细胞培养板 中进行培养。

3.2.流式细胞仪检测细胞凋亡

3.2.1样品制备

（1）细胞培养和刺激诱导凋亡，对于贴壁细胞，则更换掉原培养基，换成加药培养基；对于 悬浮细胞则不用换液，直接将按比例稀释的加药培养基加到原细胞培养基中；

（2）贴壁细胞收集：先去培液，用预冷的PBS洗涤一遍，加胰酶消化2min，用含血清的培 液终止胰酶作用，收集细胞，每样本细胞数控制在（1～10）×10⁶/mL，2000rpm/min，4℃离 心5min，弃去培养液；

（3）用预冷的PBS洗涤细胞1次，4℃2000rpm/min离心5min，弃上清；

（4）用结合缓冲液洗涤细胞1次，4℃2000rpm/min离心5min，弃上清；

（5）配制标记溶液：用结合缓冲液稀释至终浓度为1μg/mL的Annexin V-eGFP，用400μl 的标记溶液重悬细胞，冰上避光孵育15min。

（6）每管再加入碘化丙碇（PI）终浓度为1μg/mL，将细胞转移到流式试管。细胞在1小时 内用流式细胞仪分析。

3.2.2流式细胞仪分析

（1）先打开电源开关启动仪器本体，再打开计算机。流式细胞仪激发光波长采用Ex.=488nm 的氩离子雷射，eGFP绿色荧光用FL1channel检测，FL1PMT荧光光谱峰值落在绿色范围（波 长515-545nm），PI红色荧光用FL3channel检测，FL3PMT荧光光谱峰值落在深红色范围（波 长>650nm）；

（2）建立对数FL1-FL3散点图，收集样品细胞，并对上一步中圈出的细胞进行分析，调节 参数，使绝大部分细胞处在左下象限中心区域；接着通过凋亡阳性细胞确定FL1凋亡象限 的划分。

（3）依次上样待检测样品并分析结果。

3.3.流式细胞仪分析检测细胞表面受体

3.3.1样品制备

（1）细胞培养和刺激诱导凋亡；

（2）贴壁细胞收集：先去培液，用预冷的PBS洗涤一遍，加胰酶消化2min，用含血清的培 液终止胰酶作用，收集细胞，每样本细胞数控制在（1～10）×10⁶/mL，2000rpm/min，4℃离 心5min，弃去培养液；

（3）用预冷的PBS洗涤细胞1次，4℃2000rpm/min离心5min，弃上清；

（4）用1%(W/V)的BSA（PBS配制）稀释抗体DR4(mouse)抗体（1:100稀释），终浓度为 5ug/mL,control为同种属(mouse)的IgG冰上标记细胞1h，PBS洗两遍，4℃2800rpm/min 离心5min，弃掉；

（5）用1%的BSA稀释Alexa Fluor488Goat Anti-Mouse IgG（1:200稀释），冰上标记细胞 0.5h，注意避光，标记后PBS洗两遍，4℃2800rpm/min离心5min，准备上机。

3.3.2上机进行流式细胞仪分析

（1）先打开电源开关启动仪器本体，再打开计算机。

（2）启动cell quest程序，建立直方图FL1-cell counter。

(3)通过阳性细胞样品和阴性细胞样品设定M1阴性值边界。

(4)依次上样待检测样品并分析结果。

3.4.Western blot

（1）电泳：根据《分子克隆》配制不同浓度的SDS-PAGE下层分离胶，5%的上层浓缩胶， 将制备好的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳；

（2）转膜（湿法）：在转膜塑料夹上从负极到正极依次铺转膜缓冲液浸湿的滤纸、SDS-PAGE 胶、PVDF膜（使用前在甲醇中泡约10sec）、滤纸，用玻璃棒轻轻排去气泡，在预冷的转膜 液中恒流300mA转膜，转膜时间按蛋白分子量而定。；

（3）封闭：用5%脱脂牛奶室温摇床包被约0.5h；

（4）包被一抗：用合适大小杂交袋封膜，加入用5%脱脂牛奶稀释的一抗，室温摇床包被约 2h或4℃过夜；

（5）洗一抗：用1×PBST洗PVDF膜5min×3次（根据不同抗体选择合适的洗膜时间和 次数）；

（6）包被二抗：用合适大小杂交袋封膜，加入5%脱脂牛奶稀释的二抗，室温摇床包被1h 左右；

（7）洗二抗：用1×PBST洗PVDF膜5min×3次；

（8）底物反应：PVDF膜控干后正面向上放在保鲜膜上，滴加合适体积的化学发光液铺匀， 反应约1min后用吸水纸吸去PVDF膜多余水分，放入化学反光检测仪检测，其中曝光时间 根据蛋白表达量而设定。

3.5.细胞mRNA的提取

实验用品都要提前用DEPC处理并灭菌，整个过程主要防止RNA酶的污染。铺细胞于六 孔板，培养并处理细胞后，收细胞。用PBS洗涤，然后加入1ml/孔的Trizol，用枪吹打至细 胞完全溶解并收集到EP管中。室温放置5min后每个样中加入0.2倍体积的氯仿，振荡15 秒后放置2-3min，离心12000rpm×15min，4℃。小心吸取上层转移到干净的EP管中，加 入上清体积0.8-1倍体积的异丙醇，混匀后放置10min，4℃离心12000rpm×10min，。可见 RNA沉淀，弃去上清，用1ml75%乙醇洗涤，8000rpm离心5min后，晾干RNA沉淀，加 入30μl预热的DEPC水溶解。待RNA溶解后对RNA进行定量，记录提取的RNA样品的浓 度以及A260/A280值。

3.6.半定量RT PCR

（1）采用MBI反转录试剂盒进行反转录。取一个干净的1.5mL EP管，依次加入下列各组 分,混匀，微离心，65℃,5min，4℃冷却5min。

RNA模版 1μg Oligo dT 1μl random primer⁺1μl Nuclease free water to12μl

（2）取出离心管，依次加入下列组分,混匀，25℃,5min，42℃60min，70℃5min，4℃保 温。

5x MLV buffer 4μl 10mM dNTP 2μl Rnase inhibitor 1μl MLV 1μl

（3）取6μl cDNA稀释5倍作为模板做PCR，采用20μl PCR反应体系：

10×Taq buffer 2μl dNTP 1.2μl Mg²⁺1.2μl 上游引物 1μl 下游引物 1μl cDNA稀释模板 1μl Taq polymerase 0.25μl DDW 12.35μl

（3）PCR反应条件：

94℃预热变性3min；然后94℃热变性30s，60℃退火45s，72℃延伸15s,扩增片段一 般在200-300bp左右,（扩增速率：1min扩增1kb），循环数为22-28个（内参一般25个循环 数）；最后72℃延伸10min。PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB显色，拍照、分析结 果。在半定量PCR中，先取1μl的cDNA稀释模版进行扩增，根据待比较样品之间条带亮度 的差异进行模板的调整，再对待研究的目的基因进行扩增。

4实验结果：

实施例一FK506剂量及时间依赖性地增强A549细胞对TRAIL诱导的凋亡

提前一天种A549细胞于24孔细胞培养板，24h后加药，分为两组，不加TRAIL的control 组合加TRAIL的小组，每个小组再根据FK506的浓度分为几个亚组，每组两个重复。加药 处理20h后，收细胞做流式细胞仪分析，发现A549在100ng/mL的TRAIL的浓度下对TRAIL 不敏感，而在FK506联用TRAIL的条件下其凋亡率明显增加，且随着FK506浓度的增加而 增加（图1）。其中，在FK506联用TRAIL处理A549细胞20h后，细胞凋亡率达到40%， 而单独处理TRAIL或者FK506的细胞凋亡率均小于5%。

在对FK506联用TRAIL增强A549细胞凋亡的时效性研究中，我们将细胞按时间梯度加 药,即每隔4h加药,主要分组为：不加药组、单加TRAIL（100ng/mL）组、单加FK506(25μg/mL) 组，以及FK506联用TRAIL组，20h后收细胞做流式细胞仪分析，发现FK506联用TRAIL 处理的A549细胞中，其凋亡率随处理时间的延长明显增加，在处理8h后A549细胞的凋亡 率就明显增加为15%，而TRAIL单独处理的A549细胞处理20h其凋亡率仍低于10%（图2）。 以上结果表明FK506联用TRAIL增强A549细胞凋亡具有一定的剂量与时间依赖性。

实施例二FK506联用TRAIL对PMBC以及正常肺支气管上皮细胞的凋亡无影响

在FK506联用TRAIL对PMBC及正常肺支气管上皮细胞的凋亡的影响的研究中，我们 对这些细胞进行相似的处理，并与A549细胞进行比较，发现采用较高浓度的FK506联用 TRAIL的条件下，A549细胞的凋亡率达到30%-40%左右，BEAS-2B在15%以下（图3）。而 PBMC以及HBE的细胞凋亡率均在10%以下（图4，5），表明FK506特异性增强肿瘤细胞对 TRAIL诱导凋亡的敏感性，而对正常细胞无明显增效作用。

实施例三FK506联用TRAIL增强白血病细胞的凋亡

除了非小细胞肺癌外，本发明我们还筛选了几株对TRAIL不敏感的白血病细胞株U937、 HL-60、K562、CCRF-CEM，并对其进行与A549细胞相似的处理，发现U937(图6)、HL-60(图 7)对FK506的TRAIL增敏作用很敏感。另外，FK506也能增强K562细胞对TRAIL诱导的 凋亡的敏感性(图8)，但效果不如U937和HL-60明显。然而FK506不能增强CCRF-CEM对 TRAIL诱导的凋亡的敏感性（图9），可能是因为K562与CCRF-CEM本身对FK506有一定 的凋亡敏感性。

实施例四FK506联用TRAIL对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响

为了初步探索FK506联用TRAIL导致的A549细胞发生凋亡的可能机制，本发明收集不 同FK506浓度处理下的细胞进行western blot，研究结果发现，与单独进行TRAIL或者FK506 处理的细胞相比，FK506联用TRAIL能明显促进caspase3及其底物PARP的剪切，而在上 游的caspase8和caspase9均也发生剪切，其中caspase8的剪切更为明显（图10）。TRAIL 的凋亡受体R1(DR4)在FK506联用TRAIL的条件下发生显著上调，表明FK506联用TRAIL 促进A549细胞凋亡很可能是通过活化DR4凋亡途径的。相比之下，DR5的水平变化不大。 在FK506联用TRAIL处理的细胞中，凋亡抑制蛋白FLIP家族成员FLIP-L也有轻微下调的 应答。此外，BCL家族凋亡抑制蛋白成员BCL-2以及BCL-xL也发生轻微下调，推测除了 DR4凋亡途径之外还可能有线粒体途径的参与。

实施例五FK506联用TRAIL增强A549细胞表面DR4的水平

在前面的研究中，我们发现FK506可以显著上调DR4的蛋白水平，由此推测FK506联 用TRAIL导致了DR4凋亡途径的活化。为了检测FK506联用TRAIL条件下细胞表面DR4 受体水平是否发生上调，我们对药物处理的细胞进行间接法流式细胞仪分析,结果发现FK506 联用TRAIL能明显上调细胞表面DR4的水平（图11）。与TRAIL或者FK506单独处理的细 胞相比，FK506联用TRAIL处理细胞可以使细胞表面的DR4上调20%左右。

实施例六FK506联用TRAIL转录水平上调A549细胞DR4mRNA水平

为了研究FK506联用TRAIL上调细胞表面的DR4水平是发生在转录或转录后水平，还是 发生在翻译或翻译后水平，我们首先对处理的细胞进行DR4mRNA水平的分析，我们对不同 FK506剂量梯度以及处理时间不同的细胞样品进行收集，提取RNA并进行逆转录，半定量 PCR检测DR4mRNA水平的表达变化，研究发现20ug/mL FK506联用TRAIL处理20h后细 胞DR4mRNA水平明显增加（图12）。采用25μg/mL FK506联用TRAIL处理细胞，DR4mRNA 水平在处理5h-10h有明显积累。而伴随着处理时间的延长，DR4mRNA水平稍微出现下调， 推测可能由于细胞凋亡增加致使的mRNA降解导致（图13）。在对DR4mRNA转录后水平 调控的研究中，对A549细胞在加药前提前进行ActD(5μg/mL)处理半小时后进行转录抑制， 然后加药，发现FK506联用TRAIL基本对DR4mRNA的积累水平无影响（图14），由此FK506 联用TRAIL上调DR4mRNA发生在转录水平。