大戟科植物(Euphorbiaceae)活性物质及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种大戟科植物(Euphorbiaceae)活性物质及其制备方法与应用，是将大戟科植物用乙醇萃取而得；所述活性物质可进一步用正己烷及/或乙酸乙酯及/或正丁醇萃取；该大戟科植物活性物质并可为羽扇醇(Lupeol)及/或豆甾醇(Stigmasterol)。本发明进一步公开了该大戟科植物活性物质在制备动物抗病毒药物上的用途。

说明书

技术领域

本发明关于大戟科植物(Euphorbiaceae)活性物质及其活性成分的制备方法以及 其在动物保健领域中的应用，特别是关于大戟科植物活性物质及其活性成分的制备方 法以及其在预防及治疗动物病毒感染中的应用。

背景技术

近年来中草药在医学上的应用逐渐受到重视；与化学合成的药物相比，这些天然 植物的萃取物副作用较少而且相对安全。有文献指出海桐科植物(Pittosporaceae)与 大戟科植物(Euphorbiaceae)的萃取物具有抑制人类巨大细胞病毒(Human  Cytomegalovirus，HCMV)的能力(Semple，S.J.，Reynolds，G.D.，O’Leary，M.C.and  Flower，R.L.Screening of Australian medicinal plants for antiviral activity. J Ethnopharmacol 60，163-172，1998)；另外也有文献指出，大戟科同科不同属的 植物萃取物能够抑制B型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)(Unander，D.W.， Webster，G.L.and Blumberg，B.S.Usage and bioassays in Phyllanthus  (Euphorbiaceae).IV.Clustering of antiviral uses and other effects.J  Ethnopharmacol 45，1-18，1995)或是具有抑制第二型疱疹病毒(Herpes simplex  virus type 2，HSV-2)的能力(Lin，C.C.，Cheng，H.Y.，Yang，C.M.and Lin，T.C. Antioxidant and antiviral activities of Euphorbia thymifolia L.J Biom Sci 9，656-664，2002)；另有文献指出大戟科之植物萃取物能够抑制HEp-2细胞及HeLa 细胞等癌细胞的生长(Betancur-Galvis，L.A.，Morales，G.E.，Forero，J.E.and  Roldan，J.Cytotoxic and antiviral activities of Colombian medicinal plant  extracts of the Euphorbia genus.Mem I Oswaldo Cruz 97，541-546，2002))； 此外，也有文献提到大戟科植物萃取物具有良好的抗氧化能力，并且对于环境中的常 在菌，如芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌与白色念珠菌具有抵抗能力(Shi，Q.W.，Su，X.H. and Kiyota，H.Chemical and pharmacological research of the plants in genus  Euphorbia.Chem Rev 108，(10)4295-4327，2008)。

大戟科植物金刚纂(Euphorbia neriifolia)在分类上属于植物界、木兰植物门、 木兰纲、大戟目、大戟科、大戟属(Euphorbia)，其主要分布于热带与亚热带地区， 原产地为印度与斯里兰卡，其特征为多年生灌木多肉植物，茎直立且内含白色乳汁， 树皮粉绿白色，上部多分歧，植株高可达3-8公尺。大戟科植物金刚纂(Euphorbia  neriifolia)为民间常用的草药，全株皆有药理功效，如茎部具有治疗肿毒、皮肤病 与水肿的药效；叶部可治疗腹泻、子宫癌、胃癌及大肠直肠癌等病状；而花蕊则具有 解毒消肿的疗效。金刚纂(Euphorbia neriifolia)经成分分析，发现其富含三萜类、 固醇类、黄酮类、醣类等组成物(Sharma，P.V.，Paliwal，R.and Sharma S.In vitro  free radical scavenging and antioxidant potential of ethanolic extract of  Euphorbia neriifolia Linn.IJPPS 3，238-242，2011；Ahmed，S.A.，Nazim，S.， Siraj，S.，Siddik，P.M.and Wahid，C.A.Euphorbia neriifolia Linn：A  phytopharmacological review.IRJP 2，41-48，2011)。

目前，市面上的抗病毒药剂几乎都是以治疗人类疾病为目的而研发的，若将这些 昂贵的抗病毒药剂应用于经济动物上，除了有成本上的考量之外，也可能有食物安全 的隐忧；然而，若无有效的疫苗来预防某一动物病毒，当畜群受该病毒感染时，只能 使用支持性疗法处理，但效果往往不理想，造成畜牧业重大损失；因此，具有低副作 用且安全、特效的动物抗病毒药物的开发，对动物保健产业而言，可以说是刻不容缓 而且极为重要的事。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种大戟科植物(Euphorbiaceae)活性物质，该活性 物质具有抗动物病毒活性。

在其中一个实施例中，所述大戟科植物为金刚纂(Euphorbia neriifolia)。

在其中一个实施例中，所述大戟科植物活性物质是用下述方法获得的：用50-99 ％(体积百分比浓度)的乙醇萃取大戟科植物，然后去除乙醇，从而获得用乙醇萃取 的大戟科活性物质。

在另一个实施例中，所述大戟科植物活性物质是用包括以下步骤的方法获得的：

(1)用50-99％(体积百分比浓度)的乙醇萃取大戟科植物，然后去除乙醇，得到固相 活性物质；(2)将固相活性物质以乙醇溶解至0.1-1％(w/v)浓度，即，取一重量(例： 10g)的固相活性物质加入该重量数值1-10倍体积(例：10-100ml)的乙醇溶解，再以 3-30倍体积的水与该溶解的固相活性物质混合，形成悬浮液；(3)添加与水相同体积 的正己烷(Hexane)至悬浮液中，将悬浮液分为两个相；(4)从两个相中分离出含正己 烷的分离层；以及(5)去除含正己烷的分离层中的正己烷，从而获得用正己烷萃取的 大戟科活性物质。

在另一个实施例中，所述大戟科植物活性物质是用包括以下步骤的方法获得的： (1)用50-99％(体积百分比浓度)的乙醇萃取该大戟科植物，然后去除该乙醇，得 到固相活性物质；(2)将固相活性物质以乙醇溶解至0.1-1％(w/v)浓度，即，取一重 量(例：10g)的固相活性物质加入该重量数值1-10倍体积(例：10-100ml)的乙醇溶解， 再以3-30倍体积的水与该溶解的固相活性物质混合，形成悬浮液；(3)添加与水相同 体积的正己烷(Hexane)至悬浮液中，将悬浮液分为两个相；(4)从两个相中分离出含 水的分离层；(5)添加与水相同体积的乙酸乙酯(Ethyl Acetate)至该含水的分离层中， 将分离层再次分为两个相；(6)从两个相中分离出含乙酸乙酯的分离层；以及(7)去除 含乙酸乙酯的分离层中的乙酸乙酯，从而获得用乙酸乙酯萃取的大戟科活性物质。

在另一个实施例中，所述大戟科植物活性物质是用包括以下步骤的方法获得的： (1)用50-99％(体积百分比浓度)的乙醇萃取大戟科植物，然后去除乙醇，得到固 相活性物质；(2)将固相活性物质以乙醇溶解至0.1-1％(w/v)浓度，即，取一重量(例： 10g)的固相活性物质加入该重量数值1-10倍体积(例：10-100ml)的乙醇溶解，再以 3-30倍体积的水与该溶解的固相活性物质混合，形成悬浮液；(3)添加与水相同体积 的正己烷(Hexane)至悬浮液中，将悬浮液分为两个相；(4)从两个相中分离出含水的 分离层；(5)添加与水相同体积的乙酸乙酯(Ethyl Acetate)至含水的分离层中，将分 离层再次分为两个相；(6)从两个相中再次分离出含水的分离层；(7)添加与水相同体 积的正丁醇(n-Butanol)至含水的分离层中，将分离层再次分为两个相；(8)从两个相 中分离出含正丁醇的分离层；以及(9)去除含正丁醇的分离层中的正丁醇，从而获得 用正丁醇萃取的大戟科活性物质。

本发明的第二个目的是提供一种大戟科植物(Euphorbiaceae)活性物质的制备方 法，是用乙醇萃取大戟科植物的茎、叶，得到萃取物-大戟科植物活性物质。

在其中一个实施例中，所述大戟科植物为金刚纂(Euphorbia neriifolia)。

在其中一个实施例中，所述大戟科植物活性物质的制备方法包含下列步骤：用 50-99％(体积百分比浓度)的乙醇萃取大戟科植物的茎、叶，然后去除乙醇，从而 获得用乙醇萃取的大戟科活性物质。

在另一个实施例中，所述大戟科植物活性物质的制备方法包含下列步骤：(1)用 50-99％(体积百分比浓度)的乙醇萃取大戟科植物的茎、叶，然后去除乙醇，形成 固相活性物质；(2)将固相活性物质以乙醇溶解至0.1-1％(w/v)浓度，即，取一重量(例： 10g)的固相活性物质加入该重量数值1-10倍体积(例：10-100ml)的乙醇溶解，再以 3-30倍体积的水与该溶解的固相活性物质混合，形成悬浮液；(3)添加与水相同体积 的正己烷(Hexane)至悬浮液中，将悬浮液分为两个相；(4)从两个相中分离出含正己 烷的分离层；以及(5)去除含正己烷的分离层中的正己烷，从而获得用正己烷萃取的 大戟科活性物质。

在另一个实施例中，所述大戟科植物活性物质的制备方法包含下列步骤：(1)用 50-99％(体积百分比浓度)的乙醇萃取大戟科植物的茎、叶，然后去除乙醇，形成 固相活性物质；(2)将固相活性物质以乙醇溶解至0.1-1％(w/v)浓度，即，取一重量(例： 10g)的固相活性物质加入该重量数值1-10倍体积(例：10-100ml)的乙醇溶解，再以 3-30倍体积的水与该溶解的固相活性物质混合，形成悬浮液；(3)添加与水相同体积 的正己烷(Hexane)至悬浮液中，将悬浮液分为两个相；(4)从两个相中分离出含水的 分离层；(5)添加与水相同体积的乙酸乙酯(Ethyl Acetate)至含水的分离层中，将分 离层再次分为两个相；(6)从两个相中分离出含乙酸乙酯的分离层；以及(7)去除含乙 酸乙酯的分离层中的乙酸乙酯，从而获得用乙酸乙酯萃取的大戟科活性物质。

在另一个实施例中，所述大戟科植物活性物质的制备方法包含下列步骤：(1)用 50-99％(体积百分比浓度)的乙醇萃取大戟科植物的茎、叶，然后去除乙醇，形成 固相活性物质；(2)将固相活性物质以乙醇溶解至0.1-1％(w/v)浓度，即，取一重量(例： 10g)的固相活性物质加入该重量数值1-10倍体积(例：10-100ml)的乙醇溶解，再以 3-30倍体积的水与该溶解的固相活性物质混合，形成悬浮液；(3)添加与水相同体积 的正己烷(Hexane)至悬浮液中，将悬浮液分为两个相；(4)从两个相中分离出含水的 分离层；(5)添加与水相同体积的乙酸乙酯(Ethyl Acetate)至含水的分离层中，将分 离层再次分为两个相；(6)从两个相中再次分离出含水的分离层；(7)添加与水相同体 积的正丁醇(n-Butanol)至含水的分离层中，将分离层再次分为两个相；(8)从两个相 中分离出含正丁醇的分离层；以及(9)去除含正丁醇的分离层中的正丁醇，从而获得 用正丁醇萃取的大戟科活性物质。

本发明的第三个目的是提供一种大戟科植物活性物质在制备动物抗病毒药物中 的用途。

在其中一个实施例中，所述大戟科植物活性物质为用乙醇萃取的大戟科植物活性 物质。在另一个实施例中，所述大戟科植物活性物质为用正己烷萃取的大戟科植物活 性物质。在另一个实施例中，所述大戟科植物活性物质为用乙酸乙酯萃取的大戟科植 物活性物质。在另一个实施例中，所述大戟科植物活性物质为用正丁醇萃取的大戟科 植物活性物质。在另一个实施例中，所述大戟科植物活性物质为羽扇醇(Lupeol)。在 另一个实施例中，所述大戟科植物活性物质为豆甾醇(Stigmasterol)。

由本发明的实施例可知，本发明所提供的大戟科植物活性物质具有抗病毒效果， 可以有效抑制病毒在宿主细胞内的增殖，其中，用正己烷萃取的大戟科植物活性物质 的抗病毒效果优于商品化抗病毒药剂病毒唑(ribavirin)的抗病毒效果。因此，本发 明所提供的大戟科植物活性物质可用来抑制动物病毒在动物体内增殖。

在其中一个实施例中，本发明所提供的大戟科植物活性物质可预防猪繁殖与呼吸 道综合症病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)的 感染；与未经药物处理的细胞相比较，预先用本发明所提供的大戟科植物活性物质处 理的细胞对于PRRSV病毒的感染具有较佳的抵抗力，处理组的细胞具有较高的细胞存 活率，且细胞悬浮液及细胞内的PRRSV病毒数量较低。

在另一个实施例中，本发明所提供的大戟科植物活性物质可治疗PRRSV病毒的感 染；与未经药物处理的已感染PRRSV病毒细胞相比较，用本发明所提供的大戟科植物 活性物质对已感染PRRSV病毒的细胞处理后，处理组的细胞具有较高的细胞存活率， 且细胞悬浮液及细胞内的PRRSV病毒数量较低。

在另一个实施例中，本发明所提供的大戟科植物活性物质可预防犬瘟热病毒 (canine distemper virus，CDV)的感染；与未经药物处理的细胞相比较，预先用本 发明所提供的大戟科植物活性物质处理的细胞对于CDV病毒的感染具有较佳的抵抗 力，处理组的细胞具有较高的细胞存活率，且细胞悬浮液及细胞内的CDV病毒数量较 低。

在另一个实施例中，本发明所提供的大戟科植物活性物质可治疗CDV病毒的感染； 与未经药物处理的已感染CDV病毒细胞相比较，用本发明所提供的大戟科植物活性物 质对已感染CDV病毒的细胞处理后，处理组的细胞具有较高的细胞存活率，且细胞悬 浮液及细胞内的CDV病毒数量较低。

本发明的第四个目的是提供一种抗动物病毒组成物，包含由本发明的大戟科植物 乙醇萃取活性物质、正己烷萃取活性物质、乙酸乙酯萃取活性物质、正丁醇萃取活性 物质、大戟科植物活性物质羽扇醇(Lupeol)以及大戟科植物活性物质豆甾醇 (Stigmasterol)组成的物质群中的至少一种物质，以及药学上可接受的稀释剂、赋形 剂和/或载剂。

所述药学上可接受的赋形剂可为适合于肠外、肠内或滴鼻施用的药学上可接受的 有机或无机载体物质，且该赋形剂不会与活性组合物产生有害的反应。适合的赋形剂 包含但不限于水、盐类溶液、蔬菜油、聚乙二醇、明胶、直链淀粉、乳糖、硬脂酸镁、 滑石、硅酸、黏性石蜡、脂肪酸单甘酯和甘油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡 咯烷酮等。

所述药学上可接受的载剂包含一种或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、 乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、粘结剂 (binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂 (chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂 (preservative)、润滑剂(lubricant)、界面活性剂(surfactant)、佐剂(adjuvant)， 及其他类似或适用本发明的载剂。

术语“预防、保护、对抗”的含义是，相较于未使用本发明大戟科植物活性物质 处理的动物或细胞样本，使用本发明大戟科植物活性物质处理的动物或细胞样本具有 较高的存活率，且该样本内的病毒数量较低。

术语“治疗”的含义是，预防或部份预防疾病、症状、病况，及/或部份或完全 治愈或缓解疾病、症状、病况或因疾病所造成的不利影响。

术语“抑制”的含义是，与基线相比，在质量或数量上的减少。例如，在本发明 的背景下，抑制病毒的复制，是指与基线相比，病毒复制减少。同理，抑制病毒感染， 是指与基线相比，减少病毒感染。

本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为所属领域具 有通常技艺者可共同了解的意义。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明的保护范围不限于下 述的实施例。

附图说明

图1为金刚纂茎部活性物质与Marc-145细胞共培养不同时间后抗PRRSV病毒活 性分析的结果。

图2为利用GC-MASS分析用正己烷(Hexane)萃取金刚纂茎部活性物质的图谱。

图3为用正己烷(Hexane)萃取的金刚纂茎部活性物质、羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇 (Stigmasterol)对PRRSV病毒之预防试验结果。

图4A为用乙醇及正己烷(Hexane)萃取的金刚纂茎部活性物质对PRRSV病毒的病 毒斑减少试验的结果：图4B为羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)对PRRSV病 毒的病毒斑减少试验的结果。

图5为攻毒72小时后，羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)对PRRSV病毒 感染的治疗试验的结果：图5A为未经活性物质处理及病毒感染的Marc-145细胞；图 5B为PRRSV病毒感染细胞组；图5C为经羽扇醇(Lupeol)处理的PRRSV病毒感染细胞 组；图5D为经豆甾醇(Stigmasterol)处理的PRRSV病毒感染细胞组；以及图5E为经 商品化抗病毒药剂病毒唑(病毒唑(ribavirin))处理的PRRSV病毒感染细胞组。

图6为羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)对PRRSV病毒感染的治疗试验的 结果。

图7为金刚纂茎部活性物质与VERO细胞共培养不同时间后抗CDV病毒活性分析 的结果。

图8为为用正己烷(Hexane)萃取的金刚纂茎部活性物质对CDV病毒的预防试验结 果。

图9为羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)对CDV病毒感染的治疗试验的结 果。

图10为羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)对CDV病毒感染之治疗试验的 结果：图10A为VERO细胞上清液的病毒力价；图10B为VERO细胞内的病毒力价。

具体实施方式

实施例一大戟科植物活性物质的制备

1、乙醇(Ethanol)萃取的活性物质

大戟科植物金刚纂(Euphorbia neriifolia)采集自台湾宜兰。先将采集的金刚纂 用水洗净并将叶与茎部分开，静置晾干后秤重并切成片状，再将茎部与叶部分别置于 可避光的棕色玻璃瓶内，加入95％(体积百分比浓度，50-99％均可)乙醇使金刚纂 茎、叶完全浸泡于乙醇中，于室温静置萃取，待乙醇由透明无色转变为深绿色或深咖 啡色时(约3-10日)，收集乙醇萃取液，接着进行减压浓缩去除乙醇，得到用乙醇萃 取的金刚纂茎部及叶部活性物质。

2、正己烷(Hexane)萃取的活性物质

取1中用乙醇萃取的金刚纂茎部及叶部活性物质10g溶于100mL(10-100mL均可) 乙醇与300mL水(此液相称为水层)，并将该水层混合物倒入分液漏斗中，再加入300mL (30-300mL均可)正己烷(Hexane)，将该水层混合物与正己烷充分混合后，将该分液 漏斗避光静置，待水层与正己烷完全分离后，分别收集下层液体(水层)以及上层液体 (正己烷萃取液层)，接着将正己烷萃取液进行减压浓缩，得到用正己烷萃取的金刚纂 活性物质。

3、乙酸乙酯(Ethyl acetate，EtOAc)萃取的活性物质

将2中经过正己烷萃取后的下层液体(水层)倒入另一分液漏斗内，并加入300mL (30-300mL均可)乙酸乙酯(EtOAc)，将该水层混合物与乙酸乙酯充分混合后，将该 分液漏斗避光静置，待水层与乙酸乙酯完全分离后，分别收集下层液体(水层)以及上 层液体(乙酸乙酯萃取液层)，接着将乙酸乙酯萃取液进行减压浓缩，得到用乙酸乙酯 萃取的金刚纂活性物质。

4、正丁醇(n-Butanol)萃取的活性物质

将3中经过乙酸乙酯萃取后的下层液体(水层)倒入另一分液漏斗内，并加入300 mL(30-300mL均可)正丁醇(n-Butanol)，将该水层混合物与正丁醇充分混合后，将 该分液漏斗避光静置，待水层与正丁醇完全分离后，分别收集下层液体(水层)以及上 层液体(正丁醇萃取液层)，接着将正丁醇萃取液进行减压浓缩，得到用正丁醇萃取的 金刚纂活性物质。

实施例二用乙醇萃取的大戟科植物活性物质抗PRRSV病毒感染的初步活性分析

将实施例一得到的用乙醇萃取的金刚纂茎部及叶部活性物质先分别进行连续两 倍稀释(500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.625μg/mL、 7.8125μg/mL、3.90625μg/mL、1.953125μg/mL、0.9765625μg/mL)，接着处理Marc-145 细胞(上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞(MA 104细胞)克隆而得到后再感染 PRRSV病毒，以评估用乙醇萃取的金刚纂活性物质是否具有抑制PRRSV病毒感染的能 力。

首先，将Marc-145细胞悬浮于含有5％FBS的MEM培养液中，然后接种于96孔 细胞培养盘中(1.5×10⁴颗细胞/孔)，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养细胞16-24 小时后，移除上层培养液并用含有1％FBS的MEM培养液清洗细胞两次后，将连续稀 释的用乙醇萃取的金刚纂茎部及叶部活性物质分别加入细胞培养物中，于37℃、5％ CO₂恒温培养箱内培养24小时(每个稀释浓度四重复)；接着，每个测试样本中加入100 TCID₅₀(半数组织培养感染量)PRRSV病毒液，并用含有1％FBS的MEM培养液做为 负对照组，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养细胞4天后，用Alamar blue reduction  assay kit(购自AbD Serotec，英国)分析细胞存活率，并计算半数细胞毒性浓度 (concentration of 50％ cellular cytotoxicity，CC₅₀)及半数抑制浓度(50％ antiviral inhibitory concentration，IC₅₀)，以评估用乙醇萃取的金刚纂活性物质 是否具有抑制PRRSV病毒感染的能力。

结果如表一所示，用乙醇萃取的金刚纂茎部活性物质对Marc-145细胞的半数细 胞毒性浓度(CC₅₀)为83.15±0.4μg/mL，而用乙醇萃取的金刚纂叶部活性物质对 Marc-145细胞的半数细胞毒性浓度(CC₅₀)则大于500μg/mL；另一方面，用乙醇萃取的 金刚纂茎部及叶部活性物质皆具有抗PRRSV病毒能力，虽然用乙醇萃取的金刚纂茎部 活性物质对Marc-145细胞的半数细胞毒性浓度(CC₅₀)较高，但其抑制半数PRRSV病毒 活性的浓度(IC₅₀)为10.51±0.5μg/mL，较用乙醇萃取的金刚纂叶部活性物质抑制半数 PRRSV病毒活性的浓度(IC₅₀＝255.65±25.3μg/mL)低了将近25倍。若以选择性指标 (selective index，SI)来看，用乙醇萃取的金刚纂茎部活性物质较用乙醇萃取的金 刚纂叶部活性物质具有较佳的抗PRRSV病毒能力。

表一金刚纂茎部及叶部乙醇萃取之活性物质抗PRRSV病毒感染能力分析

实施例三不同作用时间下用乙醇萃取的大戟科植物茎部活性物质抗PRRSV病毒 感染的活性分析

将实施例一得到的用乙醇萃取的金刚纂茎部活性物质(2μg/mL)处理Marc-145细 胞不同时间后再感染PRRSV病毒，以评估用乙醇萃取的金刚纂茎部活性物质与 Marc-145细胞共培养多少时间会有最佳的抑制PRRSV病毒能力。

首先，将Marc-145细胞悬浮于含有5％FBS的MEM培养液，并接种于96孔细胞 培养盘中(1.5×10⁴颗细胞/孔)，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养细胞16-24小时 后，移除上层培养液并用含有1％FBS的MEM培养液清洗细胞两次后，将2μg/mL用 乙醇萃取的金刚纂茎部活性物质(试验组)或80μM商品化抗病毒药剂病毒唑 (ribavirin)(正对照组)加入细胞培养物中，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内分别培养 4、8、16、24小时(每个时间点四重复)；接着，每个测试样本中加入100TCID₅₀ PRRSV 病毒液，并用含有1％FBS的MEM培养液做为负对照组，于37℃、5％CO₂恒温培养 箱内培养细胞4天后，用Alamar blue reduction assay kit分析细胞存活率，以评 估用乙醇萃取的金刚纂茎部活性物质与Marc-145细胞共培养多少时间会有最佳的抑 制PRRSV病毒能力。

结果如表二及图1所示，Marc-145细胞与用乙醇萃取的金刚纂茎部活性物质共培 养4小时与8小时再感染PRRSV病毒4天后的细胞存活率约为70-75％；共培养16小 时与24小时后再感染PRRSV病毒4天后的细胞存活率可达100％；而Marc-145细胞 与商品化抗病毒药剂病毒唑(ribavirin)共培养24小时再感染PRRSV病毒4天后的细 胞存活率为91％；相比较，用乙醇萃取金刚纂茎部活性物质具有显着的抗病毒能力。

表二不同作用时间下用乙醇萃取的金刚纂茎部活性物质、商品化抗病毒药剂病 毒唑(ribavirin)处理的Marc-145细胞及未经药剂处理的Marc-145细胞感染PRRSV 病毒后的细胞存活率

实施例四大戟科植物茎部各活性物质抗PRRSV病毒感染的初步活性分析

将实施例一得到的用乙醇萃取的金刚纂茎部活性物质、用正己烷(Hexane)萃取的 金刚纂茎部活性物质、用乙酸乙酯(EtOAc)萃取的金刚纂茎部活性物质、用正丁醇 (n-Butanol)萃取的金刚纂茎部活性物质以及商品化抗病毒药剂病毒唑(ribavirin) 先分别进行连续两倍稀释(500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、 15.625μg/mL、7.8125μg/mL、3.90625μg/mL、1.953125μg/mL、0.9765625μg/mL)，接 着处理Marc-145细胞后再感染PRRSV病毒，以评估用不同有机溶剂萃取的金刚纂活 性物质是否具有抑制PRRSV病毒感染的能力。

首先，将Marc-145细胞悬浮于含有5％FBS的MEM培养液，并接种于96孔细胞 培养盘中(1.5×10⁴颗细胞/孔)，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养细胞16-24小时 后，移除上层培养液并用含有1％FBS的MEM培养液清洗细胞两次后，将连续稀释的 用乙醇萃取的金刚纂茎部活性物质、用正己烷(Hexane)萃取的金刚纂茎部活性物质、 用乙酸乙酯(EtOAc)萃取的金刚纂茎部活性物质、用正丁醇(n-Butanol)萃取的金刚纂 茎部活性物质以及商品化抗病毒药剂病毒唑(ribavirin)分别加入细胞培养物中，于 37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养24小时(每个稀释浓度二重复)；接着，每个测试样 本中加入100 TCID₅₀ PRRSV病毒液，并用含有1％FBS的MEM培养液做为负对照组， 于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养细胞4天后，用Alamar blue reduction assay kit 分析细胞存活率，并计算半数细胞毒性浓度(CC₅₀)、半数抑制浓度(IC₅₀)以及选择性指 标(SI)，以评估金刚纂茎部各活性物质是否具有抑制PRRSV病毒感染的能力。

结果如表三所示，首先是细胞毒性试验的部分：对细胞毒害效果最轻微的是用正 丁醇(n-Butanol)萃取的金刚纂茎部活性物质(CC₅₀＞500μg/mL)，其次是商品化抗病毒 药剂病毒唑(ribavirin)(CC₅₀＝400±100μg/mL)，接着是用乙醇萃取的金刚纂茎部活性 物质(CC₅₀＝80±36μg/mL)与用正己烷(Hexane)萃取的金刚纂茎部活性物质 (CC₅₀＝28±6.3μg/mL)，而对于细胞最具有毒性的则是用乙酸乙酯(EtOAc)萃取的金刚 纂茎部活性物质(CC₅₀＝26±4.1μg/mL)。至于在抗病毒活性方面，用上述不同有机溶剂 萃取的金刚纂茎部活性物质皆具有抗病毒能力：其中，用正丁醇(n-Butanol)萃取金 刚纂茎部活性物质抑制半数病毒所需的剂量最高(IC₅₀＞500μg/mL)，其选择性指标(SI) 为1；而用正己烷(Hexane)萃取的金刚纂茎部活性物质抑制半数病毒所需的剂量最低 (IC₅₀＝2.6±0.9μg/mL)，其选择性指标(SI)为最高(SI＝9.8)，因此是最具有作为抗病 毒药物潜力的活性物质。

表三金刚纂茎部各活性物质抗PRRSV病毒感染能力分析

实施例五用正己烷(Hexane)萃取的大戟科植物茎部活性物质其组成化合物对 抗PRRSV病毒感染的活性分析

由实施例四结果得知，用正己烷(Hexane)萃取的金刚纂茎部活性物质是所有活性 物质中最具有作为抗病毒药物潜力的活性物质，为了解该活性物质中具有抗病毒能力 的组成成分为何，进一步将实施例一得到的用正己烷(Hexane)萃取的金刚纂茎部活性 物质用气相层析质谱仪(Gas Chromatography-Mass Spectrophotometer，GC-MASS)比 对出用正己烷(Hexane)萃取的活性物质的组成成分。

用正己烷(Hexane)萃取的金刚纂茎部活性物质的气相层析质谱仪(GC-MASS)图谱 如图2所示，选出其中9个含量高的化合物(化合物1-9)进行细胞毒性测试及抗病毒 活性测试。待测化合物1-9在Marc-145细胞接种16-24小时后，皆以40μM浓度与细 胞作用，并以不含待测化合物1-9的1％FBS MEM培养液作为对照组，在待测化合物 1-9与细胞共同培养24小时后，每个细胞样本中加入100 TCID₅₀的PRRSV病毒液，并 置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养4天，之后观察细胞病变情形并测定存活率。

结果如表四所示，9个待测化合物中最具有抗PRRSV病毒效果的为化合物8(羽 扇醇，Lupeol)及化合物9(豆甾醇，Stigmasterol)；处理羽扇醇(Lupeol)的细胞存 活率为80.96±3.74％；而处理豆甾醇(Stigmasterol)的细胞存活率为96.51±3.89 ％。

表四处理不同待测化合物后用PRRSV病毒攻毒的Marc-145细胞存活率

实施例六不同浓度的羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)对抗PRRSV病毒 感染的活性分析

将羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)先分别进行连续两倍稀释(1mM、500 μM、250μM、125μM、62.5μM、31.25μM、15.625μM、7.8125μM、3.90625μM、1.953125μM、 0.9765625μM)，接着处理Marc-145细胞后再感染PRRSV病毒，以评估不同浓度的羽 扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)抑制PRRSV病毒感染的能力。

首先，将Marc-145细胞悬浮于含有5％FBS的MEM培养液，并接种于96孔细胞 培养盘中(1.5×10⁴颗细胞/孔)，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养细胞16-24小时 后，移除上层培养液并以含有1％FBS的MEM培养液清洗细胞两次后，将连续稀释的 羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)分别加入细胞培养物中，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养24小时(每个稀释浓度二重复)；接着，每个测试样本中加入100 TCID₅₀ PRRSV病毒液，并用含有1％FBS的MEM培养液做为负对照组，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养细胞4天后，以Alamar blue reduction assay kit分析细胞存活 率，并计算半数细胞毒性浓度(CC₅₀)、半数抑制浓度(IC₅₀)以及选择性指标(SI)。

结果如表五所示，首先是细胞毒性试验的部分：羽扇醇(Lupeol)的半数细胞毒性 浓度(CC₅₀)为38.3±20.7μM；而豆甾醇(Stigmasterol)的半数细胞毒性浓度(CC₅₀)为 488±5.44μM。至于在抗病毒活性方面，羽扇醇(Lupeol)抑制半数病毒所需的剂量为 (IC₅₀)3.17±0.14μM，其选择性指标(SI)为12.1；而豆甾醇(Stigmasterol)抑制半 数病毒所需的剂量为(IC₅₀)36.63±2.5μM，其选择性指标(SI)为13.3。且羽扇醇 (Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)的选择性指标(SI)皆大于金刚纂茎部正己烷 (Hexane)萃取之活性物质的选择性指标(SI)，显示此二化合物皆具有作为抗病毒药物 的潜力。

表五羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)抗PRRSV病毒感染能力分析

  试验物   CC₅₀(μM)   IC₅₀(μM)   SI＝CC₅₀/IC₅₀  羽扇醇(Lupeol)   38.3±20.7   3.17±0.14   12.1   豆甾醇(Stigmasterol)   488±5.44   36.63±2.5   13.3

实施例七大戟科植物活性物质对于PRRSV病毒的预防试验

首先，将Marc-145细胞悬浮于含有5％FBS的MEM培养液，并接种于25cm²细胞 培养瓶(2×10⁶颗细胞/瓶)，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养细胞16-24小时后， 移除上层培养液并用含有1％FBS的MEM培养液清洗细胞两次后，将用正己烷(Hexane) 萃取的金刚纂茎部活性物质(2.5μg/mL)、羽扇醇(Lupeol)(25μM)、豆甾醇 (Stigmasterol)(25μM)以及商品化抗病毒药剂病毒唑(ribavirin)(80μM)分别加入 细胞培养物中，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养24小时；接着，每个测试样本中 加入0.01M.O.I.(为Multiplicity Of Infection的缩写，中文为感染复数)PRRSV 病毒液，并用含有1％FBS的MEM培养液做为负对照组，于37℃、5％CO₂恒温培养 箱内继续培养，并于攻毒后6、12、24、48、72、96小时取各测试样本上清液测病毒 力价，以得知各测试药物在不同时间点抑制病毒的能力。

结果如图3所示，未处理药剂的PRRSV攻毒组的病毒量在攻毒后缓缓上升到48 小时达高峰(10^6.75 TCID₅₀/mL)，此时约有50％的细胞已经出现破碎圆化的病变情形； 经过药物处理过的组别在每个时间点病毒量都有减少的趋势；特别是用正己烷 (Hexane)萃取的金刚纂茎部活性物质处理的组别，在PRRSV攻毒后6小时到48小时 之间的病毒量皆比其他组别低，其中攻毒后24小时的病毒量比起未处理药剂的PRRSV 攻毒组少了将近50倍；此外，处理羽扇醇(Lupeol)的组别在PRRSV攻毒后72小时与 96小时后，其PRRSV病毒量也显着的低于其他组，其在PRRSV攻毒后96小时的病毒 量比起未经药物处理的PRRSV攻毒组少了10倍。

实施例八大戟科植物活性物质对于PRRSV病毒的病毒斑减少试验

首先，将Marc-145细胞悬浮于含有5％FBS的MEM培养液，并接种于6孔细胞 培养盘中(5×10⁵颗细胞/孔)，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养细胞16-24小时后， 移除上层培养液并用含有1％FBS的MEM培养液清洗细胞两次后，将用乙醇萃取的金 刚纂茎部活性物质(5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL)、用正己烷(Hexane)萃取的金刚 纂茎部活性物质(5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL)、羽扇醇(Lupeol)(50μM、25μM、 12.5μM)、豆甾醇(Stigmasterol)(50μM、25μM、12.5μM)以及商品化抗病毒药剂病毒 唑(ribavirin)(160μM、80μM、40μM)分别加入细胞培养物中，于37℃、5％CO₂恒温 培养箱内培养24小时(每种处理二重复)；接着，每个测试样本中加入100 TCID₅₀ PRRSV 病毒液，并以含有1％FBS的MEM培养液做为负对照组，等待作用时间(1小时)终了 再以含有1％FBS的MEM甲基纤维素培养基覆盖细胞，于37℃、5％CO₂恒温培养箱 内培养细胞4天后，并以结晶紫染色计数病毒斑块。

结果如图4所示，用乙醇萃取的金刚纂茎部活性物质及用正己烷(Hexane)萃取的 金刚纂茎部活性物质抑制半数病毒斑的浓度分别为2.1μg/mL及1.16μg/mL(图4A)； 而豆甾醇(Stigmasterol)、羽扇醇(Lupeol)以及商品化抗病毒药剂病毒唑(ribavirin) 抑制半数病毒斑的浓度分别为28.8μM、40μM与240μM(图4B)。结果显示，与商品化 抗病毒药剂病毒唑(ribavirin)相比较，羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)只 需使用较低的浓度，就可达到与商品化抗病毒药剂病毒唑(ribavirin)相同的抑制病 毒斑效果。

实施例九大戟科植物活性物质对于PRRSV病毒之治疗试验

首先，将Marc-145细胞悬浮于含有5％FBS的MEM培养液，并接种于12孔细胞 培养盘中(3.5×10⁵颗细胞/孔)，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养细胞16-24小时 后，移除上层培养液并用含有1％FBS的MEM培养液清洗细胞两次后，每个测试样本 中加入2500 TCID₅₀ PRRSV病毒液，作用2小时；作用完毕后将用正己烷(Hexane)萃 取的金刚纂茎部活性物质(2.5μg/mL)、羽扇醇(Lupeol)(50μM)、豆甾醇 (Stigmasterol)(50μM)以及商品化抗病毒药剂病毒唑(ribavirin)(80μM)分别加入细 胞培养物中，于攻毒后6、12、24、48、72、96小时，各别收取上清液与细胞内病毒 液测病毒力价。

结果如图5所示(图5A为未经活性物质处理及病毒感染的Marc-145细胞；图5B 为PRRSV病毒处理组；图5C为经羽扇醇(Lupeol)处理的PRRSV病毒感染细胞组；图 5D为经豆甾醇(Stigmasterol)处理的PRRSV病毒感染细胞组；以及图5E为经商品化 抗病毒药剂病毒唑(病毒唑(ribavirin))处理的PRRSV病毒感染细胞组)，未经药剂 处理的PRRSV攻毒组于病毒感染72小时后，约有70％的细胞出现严重的病变情形(图 5B)；而经羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)处理的组别在病毒感染72小时 后，只有少于20％的细胞出现圆化病变的情形(图5C、图5D)。在病毒力价方面，结 果如图6所示，未经药剂处理的PRRSV攻毒组于病毒感染48小时后，细胞内病毒力 价为10^6.5 TCID₅₀/mL，上清液病毒力价也高达10^6.75 TCID₅₀/mL，而经羽扇醇(Lupeol) 处理的组别不论是上清液病毒量或是细胞内病毒量，在病毒感染后的每个时间点力价 均显着低于未经药剂处理的PRRSV攻毒组、经豆甾醇(Stigmasterol)处理的组别、经 用正己烷(Hexane)萃取的金刚纂茎部活性物质处理的组别以及处理商品化抗病毒药 剂病毒唑(ribavirin)的组别，特别是经羽扇醇(Lupeol)处理的组别的细胞内部在攻 毒后72小时与96小时均测不到PRRSV病毒。

实施例十大戟科植物活性物质抗犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV) 的初步活性分析

将实施例一得到的用乙醇萃取的金刚纂茎部活性物质、用正己烷(Hexane)萃取的 金刚纂茎部活性物质、用乙酸乙酯(EtOAc)萃取的金刚纂茎部活性物质、用正丁醇 (n-Butanol)萃取的金刚纂茎部活性物质以及商品化抗病毒药剂病毒唑(ribavirin) 先分别进行连续两倍稀释(500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、 15.625μg/mL、7.8125μg/mL、3.90625μg/mL、1.953125μg/mL、976ng/mL、488ng/mL、 244ng/mL、122ng/mL、61ng/mL)，接着处理VERO细胞(非洲绿猴肾细胞)后再感染 CDV病毒，以评估金刚纂活性物质是否具有抑制CDV病毒感染的能力。

首先，将VERO细胞悬浮于含有5％FBS的MEM培养液，并接种于96孔细胞培养 盘中(8×10³颗细胞/孔)，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养细胞16-24小时后，移 除上层培养液并用含有1％FBS的MEM培养液清洗细胞两次后，将上述连续稀释的活 性物质分别加入细胞培养物中，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养24小时(每个稀 释浓度四重复)；接着，每个测试样本中加入1×10³ TCID₅₀ CDV病毒液，并用含有1 ％FBS的MEM培养液做为负对照组，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养细胞6天后， 用硫酰罗明丹(Sulforhodamine Bassay，SRB)分析细胞存活率(OD₅₁₅)，并计算半数细 胞毒性浓度(CC₅₀)及半数抑制浓度(IC₅₀)，以评估金刚纂活性物质是否具有抑制CDV病 毒感染的能力。

结果如表六所示，由细胞毒性试验结果显示，除了用乙醇萃取的金刚纂茎部活性 物质(CC₅₀＝80±36μg/mL)与用正己烷(Hexane)萃取的金刚纂茎部活性物质 (CC₅₀＝28±6.3μg/mL)对细胞毒性较高些以外，其他活性物质对VERO细胞具有低细胞 毒性；而抗CDV病毒活性试验结果显示，金刚纂茎部各活性物质皆具有抗病毒能力， 其中，用正己烷(Hexane)萃取的金刚纂茎部活性物质抑制半数病毒所需的剂量最低 (IC₅₀＝0.9μg/mL)，是最具有作为抗CDV病毒药物潜力的活性物质。

表六金刚纂茎部各活性物质抗CDV病毒感染能力分析

实施例十一不同作用时间下大戟科植物茎部活性物质抗犬瘟热病毒(CDV)感染 的活性分析

将VERO细胞悬浮于含有5％FBS的MEM培养液，并接种于96孔细胞培养盘中(8 ×10³颗细胞/孔)，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养细胞16-24小时后，移除上层 培养液并用含有1％FBS的MEM培养液清洗细胞两次后，将0.625μg/mL用乙醇萃取 的金刚纂茎部活性物质、用正己烷(Hexane)萃取的金刚纂茎部活性物质、用乙酸乙酯 (EtOAc)萃取的金刚纂茎部活性物质、用正丁醇(n-Butanol)萃取的金刚纂茎部活性物 质或20μg/mL商品化抗病毒药剂病毒唑(ribavirin)加入细胞培养物中，于37℃、5 ％CO₂恒温培养箱内分别培养0.5、2、4、8、16、24小时(每个时间点四重复)；接着， 每个测试样本中加入1×10³ TCID₅₀ CDV病毒液，并用含有1％FBS的MEM培养液做为 负对照组，再于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养细胞6天后，用SRB分析细胞存活 率(OD₅₁₅)，以评估金刚纂茎部活性物质与VERO细胞共培养多少时间会有最佳的抑制 CDV病毒能力。

结果如图7所示，VERO细胞与用乙醇萃取的金刚纂茎部活性物质或用正己烷 (Hexane)萃取的金刚纂茎部活性物质共培养16小时与24小时再感染CDV病毒6天后， VERO细胞存活率普遍上升，因此金刚纂活性物质对CDV病毒具有显着的抑制效果。

实施例十二不同作用时间下大戟科植物茎部活性物质抗犬瘟热病毒(CDV)感染 的活性分析

将VERO细胞悬浮于含有5％FBS的MEM培养液，并接种于25cm²细胞培养瓶(1.2 ×10⁶颗细胞/瓶)，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养细胞16-24小时后，移除上层 培养液并用含有1％FBS的MEM培养液清洗细胞两次后，将用正己烷(Hexane)萃取的 金刚纂茎部活性物质(1.25μg/mL)以及商品化抗病毒药剂病毒唑(ribavirin)(80μM) 分别加入细胞培养物中，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养24小时；接着，每个测 试样本中加入0.03M.O.I CDV病毒液，并用含有1％FBS的MEM培养液做为负对照 组，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内继续培养，并于攻毒后48、60、72、84、96、108、 120、132小时取各测试样本上清液测病毒力价，以得知各测试药物在不同时间点抑制 病毒的能力。

结果如图8所示，相较于未处理药剂的CDV攻毒组以及处理商品化抗病毒药剂病 毒唑(ribavirin)组，处理金刚纂茎部正己烷(Hexane)萃取之活性物质的VERO细胞培 养物，在感染CDV病毒后的各时间点，其病毒量皆比前述两组低，显示金刚纂茎部正 己烷(Hexane)萃取之活性物质具有比商品化抗病毒药剂病毒唑(ribavirin)更好的抑 制病毒能力。

实施例十三羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)对于犬瘟热病毒(CDV)的 预防试验

将VERO细胞悬浮于含有5％FBS的MEM培养液，并接种于96孔细胞培养盘(8× 10³颗细胞/孔)，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养细胞16-24小时后，移除上层培 养液并以含有1％FBS的MEM培养液清洗细胞两次后，将金刚纂活性成分羽扇醇 (Lupeol)(40μM)及豆甾醇(Stigmasterol)(40μM)分别加入细胞培养物中，于37℃、5 ％CO₂恒温培养箱内分别培养8、16、24小时。接着，每个测试样本中加入200 TCID₅₀CDV病毒液，并用含有1％FBS的MEM培养液做为负对照组，于37℃、5％CO₂恒温培 养箱内继续培养，并于攻毒后5天用SRB测细胞存活率(OD₅₁₅)。

结果如图9所示，用羽扇醇(Lupeol)处理8小时的组别在CDV攻毒后的细胞存活 率高，而用羽扇醇(Lupeol)处理16小时的组别在CDV攻毒后的细胞存活率更高；相 比较之下，用豆甾醇(Stigmasterol)处理8小时的组别在CDV攻毒后的细胞存活率并 不高，但用豆甾醇(Stigmasterol)处理16小时及24小时的组别在CDV攻毒后的细胞 存活率大幅提高；结果显示，羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)皆具有抗CDV 病毒的活性。

实施例十四大戟科植物茎部活性物质羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇对于犬瘟热病 毒(CDV)的治疗试验

将VERO细胞悬浮于含有5％FBS的MEM培养液，并接种于12孔细胞培养盘中 (2x10⁵颗细胞/孔)，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养细胞16-24小时后，移除上 层培养液并用含有1％FBS的MEM培养液清洗细胞两次后，每个测试样本中加入5000 TCID₅₀ CDV病毒液，作用4小时；作用完毕后将金刚纂活性物质羽扇醇(Lupeol)(50μM) 及豆甾醇(Stigmasterol)(50μM)分别加入细胞培养物中，于攻毒后24、48、72、96 小时收取上清液及细胞测试病毒力价。

结果如图10A、图10B所示，金刚纂活性物质羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇 (Stigmasterol)在CDV病毒感染后48小时的病毒力价，比经商品化抗病毒药剂病毒 唑(ribavirin)处理组别的病毒力价，以及未经药剂处理组别的病毒力价，减少了将 近100倍，不论是上清液或是细胞内的病毒力价皆有相同的情形，显示本发明金刚纂 活性物质具有治疗CDV病毒感染的效果。

综上所述，本发明所提供的大戟科植物活性物质具有抗病毒的活性，除了在病毒 感染前施用可预防病毒感染之外，在病毒感染后施用亦可抑制病毒数量增加，甚至是 减少在细胞中的病毒数量，达到治疗病毒感染的效果，可用于制备抗病毒药物。

上列详细说明是针对本发明之一可行实施例的具体说明，但是该实施例并非用以 限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含 于本案的专利范围中。

综上所述，本案所揭露的技术特征已充分符合新颖性及进步性的法定发明专利要 件，爰依法提出申请，恳请贵局核准本件发明专利申请案，以励发明，至感德便。