一种鉴定小粒种咖啡与中粒种咖啡的方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，公开了一种鉴定小粒种咖啡和中粒种咖啡的方法。本发明所述方法对待测咖啡进行DNA提取，然后采用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物进行PCR扩增，所得扩增产物进行凝胶电泳检测，若检测到条带为90bp和110bp双条带，则为小粒种咖啡，若检测到条带为90bp或100bp的单条带，则为中粒种咖啡。本发明基于SSR分子标记技术从遗传本质上对小粒种咖啡和中粒种咖啡进行了准确鉴定，解决了小粒种咖啡和中粒种咖啡鉴定困难的问题，且简单、准确、易操作。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种鉴定小粒种咖啡与中粒 种咖啡的方法。

背景技术

咖啡与可可、茶同列世界三大饮料作物，其产量、消费量、经济价值均 占首位，是继石油之后，世界排名第二的原料型产品。种植咖啡的国家和地 区已达76个，直接从业人员约2500万人，消费者达15亿人，年贸易额100～120 亿美元，咖啡在世界热带农业经济、国际贸易以及人类生活中具有极其重要 的作用。

咖啡为茜草科（Rubiaceae）咖啡属（Coffea）植物，该属植物共4组66种， 通常所指的咖啡为真咖啡组（Eucoffea）小粒种（Coffea arabica）、中粒种（Coffea  canphora）、大粒种（Coffea liberica）和埃塞尔萨种（Coffea excelsa）的植物， 其中生产性栽培的主要为小粒种和中粒种，小粒种约占栽培面积的70%，中粒 种约占30%，其它几个种主要作为种质资源保存和育种材料。

小粒种咖啡因其品质优于中粒种咖啡，其国际市场交易价格也经常是中 粒种咖啡的2-3倍，在咖啡贸易过程中常常出现将中粒种咖啡冒充小粒种咖啡 进行销售的不法行为，损害消费者利益。同时，两种咖啡适合种植的生长环 境不一样，小粒种适合种植于高海拔温热地带，而中粒种适合种植于低海拔 的高温湿热地区，如果两种咖啡的种子或苗木发生混淆，则会造成咖啡减产 并影响咖啡品质，给咖啡种植者带来很大影响。

传统的小粒种咖啡鉴别方法主要通过将咖啡培炒后进行杯品品尝，这种 方法容易受主观人为因素及培炒条件等影响，鉴别结果不准确，且需要专业 杯品师参与，可操作性差。现有中、小粒种咖啡鉴别技术主要包括化学分析 法及DNA检测法。化学分析法主要基于两种咖啡内含特定化学物质含量存在 差异，通过测定这些化学物质含量，如固醇类（F.Carrera,M.Leon-Camacho,F. Pablos,et al.Authentication of green coffee varieties according to their sterolic  profile,Anal.Chim.Acta,1998,370:131-139）、脂肪酸（M.J.Martin,F.Pablos, A.G.Gonzalez,M.S.Valdenebro,et al.Fatty acid profiles as discriminant  parameters for coffee varieties differentiation,2001,54:291-297）、绿原酸及咖啡 因（M.J.Martin,F.Pablos,A.G.Gonzalez,Discrimination between arabica and  robusta green coffee varieties according to their chemical composition,Aalanta, 1998,46:1259-1264）等，再与标准样品进行比较鉴别，由于这类化学物质含 量差异在两种咖啡中不是十分明显，且某些化学物质含量容易受栽培环境、 施肥等生产环节因素的影响，检测结果很不精确，而且方法相对复杂，需要 检测多种物质含量进行比对。因此，生产和销售上急需一种简便、准确的鉴 别中、小粒种咖啡的检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种简便、准确鉴定小粒种咖啡与中 粒种咖啡的方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种鉴定小粒种咖啡与中粒种咖啡的方法，对待测咖啡进行DNA提取， 然后采用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物进行PCR扩增，所得 扩增产物进行凝胶电泳检测，若检测到条带为90bp和110bp双条带，则为小 粒种咖啡，若检测到条带为90bp或100bp的单条带，则为中粒种咖啡。

本发明针对目前尚未有利用SSR分子标记鉴别咖啡种类的技术空白，基 于SSR分子标记技术选择两条适宜的SSR引物用于待测咖啡DNA的扩增， 直接反映小粒种咖啡和中粒种咖啡在DNA水平上的遗传多态性，进而表现为 两者在核苷酸序列上的差异，达到简便、准确的鉴定目的。

其中，本发明所述DNA提取方法可参照本领域常规的提取方法，也可通 过购买市售的DNA提取试剂盒提取。

作为优选，所述PCR扩增体系为：

作为优选，所述PCR可以为普通的PCR，也可以降落PCR（Toutchdown  PCR）。

当PCR为普通PCR时，作为优选，其扩增程序为：

95℃预变性3min；

95℃变性30s、57℃复性45s、72℃延伸1min，循环35次；

72℃延伸5min，4℃保存。

当PCR为降落PCR时，作为优选，其扩增程序为：

95℃预变性3min；

95℃变性30s、68℃复性45s（此后每个循环复性温度降低1℃）、72℃ 延伸1min，循环15次；

95℃变性30s、53℃复性45s、72℃延伸1min，循环25次；

72℃延伸5min，4℃保存。

上述两种PCR扩增技术只是本发明优选方案，本发明也可以采用其他适 宜的PCR技术进行扩增。

对于凝胶电泳检测，本发明优选采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

其中，作为优选，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳检测采用胶浓度为8%的变性 聚丙烯酰胺凝胶进行检测。更优选地，所述8%变性聚丙烯酰胺凝胶由210g 尿素、1g甲叉、39g丙烯酰胺和50mL10×TBE定容至500mL制备获得。

作为优选，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳检测以1×TBE为电泳缓冲液进行 1h的200v恒压电泳。

作为优选，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳检测采用银染法显影。所述银染法 参照本领域常规方法即可，而作为进一步优选方案，本发明采用以下银染步 骤显影：

固定：将电泳完的凝胶放入固定液中（100mL无水乙醇、5mL乙酸，ddH2O 定容至1000mL），固定5min后取出，蒸馏水清洗1次；

银染：将固定后的凝胶放入银染液中（0.8g硝酸银，ddH2O定容至 1000mL），银染10min后取出，蒸馏水清洗2次；

显影：将银染后的凝胶放入显影液中（15g氢氧化钠、10mL甲醛，ddH2O 定容至1000mL），直至条带清晰显出。

上述聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的各种优选方案均可以单独或组合地对聚 丙烯酰胺凝胶电泳检测进行限定描述。

为验证本发明所述方法的准确性，本发明以中粒种、小粒种咖啡各20个 样本进行种类鉴定。结果显示，在中粒种咖啡样本上都扩增出90bp或100bp 的单条带，在小粒种咖啡样本上都扩增出90bp和110bp的双条带，鉴定结果 准确率为100%。

由以上技术方案可知，本发明基于SSR分子标记技术从遗传本质上对小 粒种咖啡和中粒种咖啡进行了准确鉴定，解决了小粒种咖啡和中粒种咖啡鉴 定困难的问题，且简单、准确、易操作。

附图说明

图1所示为小粒种咖啡和中粒种咖啡样本的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

其中，M表示Marker，1-20泳道条带均为中粒种咖啡样本扩增条带，依 次为24号、24-2、24-10、24-11、26号、27号、兴28、兴29、兴31、兴32 兴33、大丰1号、大丰3号、大丰4号、越南1、马来西亚-1、巴布亚新几内 亚、泰国4-1、热经所中粒种；

21-40泳道条带均为小粒种咖啡样本扩增条带，依次为肯尼亚-1、巴西-2、 台湾、墨西哥、NY002、CB52、蓬莱大杨、得热48-1、得热132、得热161、 得热199-1、CCC24、云南贡山、SL28、SL34、S795、蓝山、蓝山2号、哥 伦比亚、RUME SUDAN。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种鉴定小粒种咖啡与中粒种咖啡的方法。本领域 技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为 包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明 显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动 或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种鉴定小粒 种咖啡与中粒种咖啡的方法进行详细说明。

实施例1：本发明所述方法

咖啡总DNA的提取：

咖啡总DNA提取采用市售植物基因组DNA提取试剂盒提取，操作方法 详见试剂盒说明。

PCR扩增：

PCR扩增体系为20ul体系，包括：咖啡总DNA1μL、10×Buffer2μL、 2.5mM dNTPs1.6μL、25mM MgCl₂1.2μL、SEQ ID NO:1所示序列的引物 0.4μL、SEQ ID NO:2所示序列的引物0.4μL、5U Taq酶0.1μL、ddH₂O13.3μL。

降落PCR反应程序：

95℃预变性3min；

95℃变性30s、68℃复性45s（此后每个循环复性温度降低1℃）、72℃ 延伸1min，循环15次；

95℃变性30s、53℃复性45s、72℃延伸1min，循环25次；

72℃延伸5min，4℃保存。

PCR扩增产物电泳：

PCR扩增产物采用8%变性聚丙烯酰胺凝胶（210g尿素、1g甲叉、39g 丙烯酰胺、50mL10×TBE，定容至500mL）进行电泳检测；采用1×TBE作 为电泳缓冲液；在20μL PCR扩增产物体系中加入6μL溴酚蓝上样缓冲液 （0.125g溴酚蓝、20g蔗糖，ddH2O定容至50mL），上样1.5μL至点样孔中， 200v恒压电泳1h。

染色显影：

采用银染法显影。固定：将电泳完的凝胶放入固定液中（100mL无水乙 醇、5mL乙酸，ddH2O定容至1000mL），固定5min后取出，蒸馏水清洗1 次；银染：将固定后的凝胶放入银染液中（0.8g硝酸银，ddH2O定容至 1000mL），银染10min后取出，蒸馏水清洗2次；显影：将银染后的凝胶放 入显影液中（15g氢氧化钠、10mL甲醛，ddH2O定容至1000mL），直至条 带清晰显出，取出凝胶于胶片灯箱上观察拍照。

咖啡种类鉴定：

观察产物条带，根据产物条带鉴别咖啡种类，即产物为90bp和110bp双 带的为小粒种咖啡，产物为90bp或100bp单带的为中粒种咖啡。

实施例2：本发明所述方法

咖啡总DNA的提取：

咖啡总DNA提取采用市售植物基因组DNA提取试剂盒提取，操作方法 详见试剂盒说明。

PCR扩增：

PCR扩增体系为20ul体系，包括：咖啡总DNA1μL、10×Buffer2μL、 2.5mM dNTPs1.6μL、25mM MgCl₂1.2μL、SEQ ID NO:1所示序列的引物 0.4μL、SEQ ID NO:2所示序列的引物0.4μL、5U Taq酶0.1μL、ddH₂O13.3μL。

普通PCR反应程序：

95℃预变性3min；

95℃变性30s、57℃复性45s、72℃延伸1min，循环35次；

72℃延伸5min，4℃保存。

PCR扩增产物电泳：

PCR扩增产物采用8%变性聚丙烯酰胺凝胶（210g尿素、1g甲叉、39g 丙烯酰胺、50mL10×TBE，定容至500mL）进行电泳检测；采用1×TBE作 为电泳缓冲液；在20μL PCR扩增产物体系中加入6μL溴酚蓝上样缓冲液 （0.125g溴酚蓝、20g蔗糖，ddH2O定容至50mL），上样1.5μL至点样孔中， 200v恒压电泳1h。

染色显影：

采用银染法显影。固定：将电泳完的凝胶放入固定液中（100mL无水乙 醇、5mL乙酸，ddH2O定容至1000mL），固定5min后取出，蒸馏水清洗1 次；银染：将固定后的凝胶放入银染液中（0.8g硝酸银，ddH2O定容至 1000mL），银染10min后取出，蒸馏水清洗2次；显影：将银染后的凝胶放 入显影液中（15g氢氧化钠、10mL甲醛，ddH2O定容至1000mL），直至条 带清晰显出，取出凝胶于胶片灯箱上观察拍照。

咖啡种类鉴定：

观察产物条带，根据产物条带鉴别咖啡种类，即产物为90bp和110bp双 带的为小粒种咖啡，产物为90bp或100bp单带的为中粒种咖啡。

实施例3：本发明所述方法准确性验证

利用实施例1和实施例2的方法对中粒种、小粒种咖啡各20个样本进行 种类鉴定。所用中、小粒种咖啡样本具体情况见表1，对应电泳检测结果见图 1。

表1中、小粒种咖啡样本检测结果

由检测结果可以看出，在中粒种咖啡样本上都扩增出90bp或100bp的单 带产物，在小粒种咖啡样本上都扩增出90bp和110bp的双带产物，鉴定结果 准确率为100%。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当 指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下， 还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要 求的保护范围内。