一种蛞蝓的提取方法及其抗肺癌应用

摘要

本发明公开了一种蛞蝓的提取方法及其抗肺癌应用。包括（1）将蛞蝓真空冻干，加入纯化水然后进行水浴搅拌，向其中加入高浓度乙醇溶液，搅拌均匀至乙醇浓度为60-70%，静置，然后固液分离；（2）采用无机陶瓷膜系统对步骤（1）所得的液体进行澄清截留，得到蛞蝓总清液；（3）对步骤（2）所得的蛞蝓总清液再经反渗透膜浓缩；（4）对步骤（3）所得的超滤液进行浓缩干燥，得到的水溶性蛞蝓粉。本发明所得的蛞蝓粉的分子量集中在20000到3000之间，具有显著的抑癌作用，肿瘤抑制率高于华蟾素，接近于环磷酰胺。本发明的水溶性蛞蝓粉用于治疗肺癌，高效且低毒。

说明书

技术领域

本发明蛞蝓技术领域，具体地说，涉及一种蛞蝓的提取方法及其 抗肺癌应用。

背景技术

近半个世纪以来，肺癌的发病率及死亡率均在逐年增加，到20 世纪末肺癌已占恶性肿瘤死亡的首位。根据世界卫生组织（WHO） 定期公布的资料显示，肺癌的发病率和死亡率在世界各国均呈明显上 升的趋势，尤其在工业发达的国家。各种污染，如车辆尾气、抽烟也 是引发肺癌的诱因。在许多发达国家里肺癌已是最常见的恶性肿瘤 了，在男性常见恶性肿瘤里，肺癌位列第一，在女性常见恶性肿瘤里， 肺癌位列第二。28个发达国家公布的调查统计资料显示肺癌已成为 恶性肿瘤中最常见的死亡原因。在肺癌中非小细胞肺癌（Non-Small  Cell Lung Cancer，NSCLC）约占85%-90%，而非小细胞肺癌中以肺 腺癌为主（约占40%）。内科治疗、外科治疗，以及放射治疗是目前 在临床上应用较多、疗效较确切的肺癌治疗方法。此外还有免疫治疗、 介入治疗等。药物方面，不管是化学药——广谱抗癌药，如环磷酰胺 （CTX）、顺铂等，还是中药，如长春碱类，它们的选择性低、毒性 大。就确诊肺癌患者的实际情况而言，患者或需同时接受多种药物、 治疗方法，又或不能接受任何一种毒性大的药物、损伤性治疗方法， 这都会影响患者的生存成本和生活质量。

故采用高效的制药方法，制备高效、毒性低的抗癌药物成为医药 研究者热衷的课题。

蛞蝓，一种对肺癌的抑制有特异性、毒性低的中药，对小细胞肺 癌和肺腺癌，及中晚期不能放疗和化疗的肺癌患者均有针对性。但因 目前对蛞蝓物质基础研究仍缺乏，故采用切割分子量段的手段来分离 富集当中的有效物质。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种蛞蝓的提取 方法及其抗肺癌应用。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

本发明据蛞蝓特点，利用无机陶瓷膜和反渗透膜的特点，利用 组合膜分离系统，选择性富集目标分子量段的蛞蝓成分，具体提取方 法如下：

一种蛞蝓的提取方法，包括如下步骤：

（1）、将蛞蝓真空冻干，加入纯化水然后进行水浴搅拌，向其 中加入高浓度乙醇溶液，搅拌均匀至乙醇浓度为60-70%，静置，然 后固液分离；

（2）、采用无机陶瓷膜系统对步骤（1）所得的液体进行澄清截 留，得到蛞蝓总清液，所述的无机陶瓷膜的孔径为50nm-800nm，所 述的无机陶瓷膜系统分离的频率33.35-38.05Hz，进膜压力1.5-1.9bar， 出膜压力1-1.25bar；

（3）、对步骤（2）所得的蛞蝓总清液再经反渗透膜浓缩，所述 的反渗透膜滤过的频率50Hz，进膜压力22-28bar，出膜压力 22-26bar；

（4）、对步骤（3）所得的超滤液进行浓缩干燥，得到的水溶性 蛞蝓粉。

在上述提取方法中，所述的蛞蝓是高突足襞蛞蝓全虫（Vaginulus  alte Ferussac，1821），隶属软体动物门、腹足纲、肺螺亚纲、柄眼目、 足襞蛞蝓科、足襞蛞蝓属。

在上述提取方法中，所述的蛞蝓是新鲜采集的或真空冻干的或 冷冻的或超微粉碎的。

在上述提取方法中，所述的纯化水重量不低于蛞蝓重量的20 倍。

在上述提取方法中，步骤（1）所述高浓度乙醇溶液的乙醇浓 度为体积百分数75%以上。

在上述提取方法中，步骤（1）所述固液分离方式为抽滤、离 心分离或其它物理分离方式。

在上述提取方法中，步骤（1）所述水浴搅拌的温度是50℃， 静置温度是30℃。

在上述提取方法中，步骤（4）所述浓缩的方式为真空旋转浓缩 或其它可控温度的浓缩方式；所述干燥方式为真空冷冻干燥、喷雾干 燥或其它物理干燥方式。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明根据膜分离原理和技术，得到水溶性蛞蝓粉。所得的 水溶性蛞蝓粉的分子量集中在20000到3000之间。经采用理化鉴别、 薄层鉴别、紫外-可见分光光度法、分子量检测等方法研究，认为当 中存在物质可能是蛋白质、多肽、多糖、氨基酸、生物碱成分。凸显 该分子量段蛞蝓粉混合物的作用效果，拓宽了蛞蝓药材的应用范围；

2、本发明采用人源肺腺癌细胞株A549裸小鼠移植瘤模型，对 蛞蝓进行了抗肺癌试验。结果发现，分子量集中在20000到3000之 间的蛞蝓粉混合物具有显著的抑癌作用，肿瘤抑制率高于华蟾素，接 近于环磷酰胺。本发明的水溶性蛞蝓粉用于治疗肺癌，高效且低毒。

3、本发明所采用的膜分离技术适用范围广，无相变过程，节能， 无污染，不引入杂质，操作简单，集浓缩、分离、除杂于一体，所得 产品纯度高，稳定性好，尤其适合热敏性物质。所得的水溶性蛞蝓粉 混合物与适当的辅料混合，可制成喷雾剂、胶囊剂，片剂，丸剂，冻 干粉针剂和水针剂等，扩大临床候选抗肺癌药物种类和蛞蝓粉的应用 范围。

附图说明

图1为蛞蝓粉样品HKY对人源肺腺癌A549裸小鼠移植瘤的抑 制作用。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐述本发明。需说明，本发明要求保 护的包括但不限于以下实施例。

实施例1：

蛞蝓真空冻干，加入纯化水于50℃水浴搅拌4小时，向其中加 入85%乙醇，搅拌均匀至乙醇浓度为60-70%。于30℃下静置24小 时后，离心分离固体物。离心液经50nm无机陶瓷膜分离截留得到 蛞蝓总清液（无机陶瓷膜系统分离的频率33.35Hz，进膜压力1.5bar， 出膜压力1bar）。蛞蝓总清液再经反渗透膜浓缩（反渗透膜滤过的频 率50Hz，进膜压力28bar，出膜压力26bar），收集超滤浓缩液，真 空旋转浓缩后，真空冷冻干燥，即得到水溶性蛞蝓粉混合物，以鲜 蛞蝓重量计算，得率0.3%。

把已干燥的蛞蝓粉末按0.3g量直接装进胶囊壳里即得成品蛞蝓 粉样品HKY。

实施例2：

蛞蝓真空冻干，加入纯化水于50℃水浴搅拌4小时，向其中加 入95%乙醇，搅拌均匀至乙醇浓度为60-70%。于30℃下静置24小 时后，离心分离固体物。离心液经500nm无机陶瓷膜分离截留得到 蛞蝓总清液（无机陶瓷膜系统分离的频率38.05Hz，进膜压力1.9bar， 出膜压力1.25bar）。蛞蝓总清液再经反渗透膜浓缩（反渗透膜滤过 的频率50Hz，进膜压力22bar，出膜压力22bar），收集超滤浓缩液， 真空旋转浓缩后，真空冷冻干燥，即得到水溶性蛞蝓粉混合物，以 鲜蛞蝓重量计算，得率0.1%。

把已干燥的蛞蝓粉末按0.3g量直接装进胶囊壳里即得成品。

实施例3实施例1的活性实验

下面通过药效学试验阐述蛞蝓粉样品HKY（实施例1）在治 疗肺癌方面的效果。

（一）、实验材料及分组

实验动物：来源、种系、品系：SPF级BALB/c裸小鼠。

日龄：28-35日。

性别：雌雄各半。

人癌细胞株：肺腺癌A549，由中山大学实验动物中心细胞库提 供。

移植瘤：人源肺腺癌A549细胞株接种于腋皮下而建立。细胞 接种量6管，每管数量约为1×10⁷。接种形成移植瘤后再在裸小鼠体 内传3代后使用。

实验药物：HKY，每天灌胃一次，广州白云山汉方现代药业有 限公司提供；阳性对照药为环磷酰胺，每两天灌胃一次，华蟾素，每 天灌胃一次；阴性对照为生理盐水，每天灌胃一次。

实验分组：阴性对照组（生理盐水）；HKY低剂量组（528mg/kg）； HKY高剂量组（1056mg/kg），HKY低剂量+华蟾素组（（528mg +624mg）/kg）；阳性对照组环磷酰胺（CTX）30mg/kg，华蟾素 624mg/kg。

(二)实验方法

取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm³左右，在无菌条件下，接 种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直 径，待肿瘤生长至100-300mm³后将动物随机分组。根据预试验结果， HKY低剂量组（528mg/kg）；HKY高剂量组（1056mg/kg），HKY低 剂量+华蟾素组（（528mg+624mg）/kg）,每天灌胃一次，连续21天； CTX30mg/kg，每两天灌胃一次，连续10天；华蟾素624mg/kg，每 天灌胃一次，连续21天。阴性对照组同时给等量生理盐水，每天灌 胃一次。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤 直径的测量次数为每周2次，每次测量同时还需称鼠重。计算相对肿 瘤增殖率。第21天称重，颈椎脱臼处死裸小鼠，连同包膜完整剥出 肿瘤组积，称瘤重，计算各组平均瘤重，计算肿瘤抑制率。

抗肿瘤活性评价方法：

（1）相对肿瘤增殖率T/C（%），计算公式如下：

$T/C(\%)=\frac{T_{\mathrm{RTV}}}{C_{\mathrm{RTV}}}\times 100\%$

T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性对照组RTV。

肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为：TV=1/2×a×b²

其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积 （relative tumor volume，RTV），计算公式为：RTV=V_t/V₀。其中 V₀为分笼给药时(即d₀)测量所得肿瘤体积，V_t为每一次测量时的肿瘤 体积。

（2）肿瘤抑制率（%），计算公式如下：

数据处理：实验数据均以表示，由SSPS13.0数据处理软件 进行方差分析和组间t检验。

(三)实验结果

阳性对照组环磷酰胺（CTX）与阴性对照组比较，体重明显降 低（P<0.05或P<0.01）；蛞蝓粉样品HKY组体重与阴性对照组比较 则无明显改变（P＞0.05），提示HKY对裸小鼠体重无明显影响。

蛞蝓粉样品HKY对人源肺腺癌A549裸小鼠移植瘤的抑制作 用，见表1和图1。

表1.HKY对人源肺腺癌A549裸小鼠移植瘤的抑制作用

与阴性对照组相比，^**P<0.01，^*P<0.05。

综上所述，HKY对人源肺腺癌A549裸小鼠移植瘤有显著的抑 制生长作用，其作用强于阳性对照中药华蟾素，接近于环磷酰胺； HKY与华蟾素联合应用时有协同增效作用。HKY对动物体重无明显 影响。

实施例4实施例2的活性实验

将实施例2所得水溶性蛞蝓粉参照实施例3进行活性实验，结果 显示其对人源肺腺癌A549裸小鼠移植瘤也有显著的抑制生长作用， 其作用强于阳性对照中药华蟾素，接近于环磷酰胺；与华蟾素联合应 用时有协同增效作用，对动物体重无明显影响。