与糖尿病前期、糖尿病以及糖尿病相关病症相关的生物标记

摘要

本发明提供了用于糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关病症的生物标记，以及它们的使用方法，这些生物标记包括在表1和表2中的生物标记，如过氧化物还原酶2、补体C1q子成分亚基B、巯基氧化酶1和载脂蛋白A-IV。

说明书

发明领域

本发明涉及与糖尿病前期、糖尿病以及糖尿病相关病症（如糖尿病肾病） 相关的生物标记，使用生物标记来确定个体将产生糖尿病前期、糖尿病以及糖 尿病相关病症的风险的方法，筛选一个群体来鉴定产生糖尿病前期、糖尿病以 及糖尿病相关病症风险的人的方法，以及用于糖尿病前期、糖尿病以及糖尿病 的药物靶标。

发明背景

糖尿病是一种慢性疾病并且是我们这个时代的重大公共健康问题之一。在 全世界范围内，患有糖尿病的患者群体不断增加，这对卫生系统施加了很大的 财政负担。估计2000年全世界范围内所有年龄组的糖尿病患病率为2.8%，到 2030年为4.4%。预测患有糖尿病的总人数从2000年的1.71亿上升到2030年的 3.66亿。2002年，糖尿病的发病率在25岁和25岁以上的澳大利亚人群中为7.4%， 并且自从1981年以来患有糖尿病的澳大利亚人的数量增至三倍。

到目前为止，2型糖尿病是最普遍的，例如，影响了美国糖尿病群体的90% 至95%。糖尿病发病率随着年龄而增加，并且患有糖尿病的老人的数量预期随 着老年人口数量的增加而增长。随着糖尿病比率的上升，糖代谢受损的患病率 也升高，这与患心脏病和糖尿病的风险增加相关。肥糖病是一个涵盖糖尿病、 肥胖症、糖代谢受损和高血压相关风险因素以及异常血浆脂质谱（血脂异常） 的患病率的术语。即使肥胖程度保持不变，“糖尿病流行”将继续。鉴于增长的肥 胖患病率，很有可能的是这些数据低估了未来的糖尿病患病率。

糖尿病是一种机体不能维持正常血糖水平的病症。大多数糖尿病案例分成 三大类：1型、2型和妊娠糖尿病。1型糖尿病是由机体不能产生胰岛素引起的， 并且目前需要患者注射胰岛素。2型糖尿病是由胰岛素抵抗引起的，在这种情况 下细胞不能适当利用胰岛素，有时合并有绝对胰岛素缺乏。

2型糖尿病通常可以通过规律的运动和饮食在初期控制。随着疾病的进展可 能需要药片以及最终的胰岛素注射。随着时间的推移，高血糖水平可能会损害 血管和神经。这些糖尿病的并发症可能引起对眼、神经和肾脏的损伤，并且增 加心脏病发作、中风、阳痿以及足部问题的风险。如果长时间没有发现患有糖 尿病，这种损伤可能在个体知道其患有糖尿病之前发生。因此，在非常早的阶 段诊断和控制糖尿病以及它的并发症是重要的。

糖尿病还是发达国家中的肾脏疾病（肾病）的最大病因，并且是造成巨额 透析费用的原因。10%到20%患有糖尿病的人将死于肾衰竭。糖尿病中的肾病并 发症背后的原因是复杂的，并且包括高血糖水平的毒性作用；血压升高；异常 血脂水平以及小血管畸形。积累的结果是肾脏中肾小球的增厚，这允许蛋白质 （白蛋白）被排泄到尿中。

糖尿病已经成为40%到50%的ESRD病例中的终末期肾功能衰竭（ESRF） 的最常见的单一原因，并且与所有其他原发性ESRD诊断相比，由糖尿病引起 的患有ESRF的患者所占的年度澳大利亚医疗保险开支最大。高达三分之一的 新诊断患有2型糖尿病的成年人已经患有慢性肾脏疾病，并且数据表明，这些 患者中的很多可能已经发展到糖尿病前期状态的的过程中。这种疾病是进行性 的并且对男性的影响多于女性。

最初通过测量排泄到尿中的白蛋白（蛋白尿）含量来检测糖尿病肾病。通 常使用白蛋白肌酸比（ACR）来量度尿蛋白。这是在尿中的白蛋白与肌酸之间 的比率。该比率考虑了相对于肾小球滤过率的白蛋白浓度，该浓度通过尿中的 肌酸的量确定。白蛋白尿被定义为：ACR>2.5mg/mmol（男性）或>3.5mg/mmol （女性）。

尽管已经使用了很多研究和算法来评定糖尿病和相关病症的风险，对于可 以容易地被最可能在初期遇到糖尿病前期或未诊断的早期糖尿病的初级保健医 生采用的评定这样的风险或病症的准确方法仍然存在着需要。

因此，对于用于筛选产生糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关病症的风险 的人以及用于监测患有糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关病症的患者的相对 低廉并且方便的方法仍然存在着需要。这样的方法可以用于筛选大的群体以便 鉴定处于糖尿病风险的人、用于测试单个的人以便确定这个个体产生糖尿病的 风险、用于监测糖尿病患者的健康并且评定被设计为用来治疗糖尿病、糖尿病 前期和/或相关病症的干预措施的功效。对于鉴定用于糖尿病前期、糖尿病和/或 糖尿病相关病症的新药物靶标（包括蛋白质药物靶标）同样存在着需要。新药 物靶标的鉴定将使用于糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关病症的新的干预措 施的开发成为可能。

针对这种背景和与之相关的问题和困难而开发了本发明。

发明概述

在一个方面，本发明提供了一种针对糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关 病症评定受试者的方法，该方法包括测量来自受试者的样品中的至少一种生物 标记，其中所述至少一种生物标记选自表1或表2中的生物标记列表。

表1

表2

在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含用于测量来自受试 者的样品中的至少一种生物标记，其中所述至少一种生物标记选自表1或表2 中的生物标记列表。

在另一方面，本发明提供了用于针对糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关 病症评定受试者的具有计算机可执行指令的计算机可读介质，该计算机可读介 质包括：一个例行程序，存储在该计算机可读介质上并且被适配成由一个处理 器执行，以便存储代表选自表1或表2中的生物标记列表的至少一种生物标 记的生物标记测量数据。

在另一方面，本发明提供了一种评定用于受试者中的糖尿病前期、糖尿病 和/或糖尿病相关病症的治疗的方法，该方法包括测量来自经历治疗的受试者 的样品中的至少一种生物标记，该至少一种生物标记选自表1或表2中的生 物标记列表，在治疗过程中至少测量两次。

在另一方面，本发明提供了一种评定受试者产生糖尿病前期、糖尿病和/或 糖尿病相关病症的方法，该方法包括测量来自受试者的样品中的至少一种生物 标记，该至少一种生物标记选自表1或表2中的生物标记列表。

在另一方面，本发明提供了一种监测受试者中的糖尿病前期、糖尿病和/或 糖尿病相关病症的方法，该方法包括测量来自受试者的样品中的至少一种生物 标记，该至少一种生物标记选自表1或表2中的生物标记列表，并且将获得的 测量与至少一种生物标记的另一次测量进行比较。

在另一方面，本发明提供了一种诊断或鉴定受试者中的糖尿病前期、糖尿 病和/或糖尿病相关病症的方法，该方法包括测量来自受试者的样品中的至少一 种生物标记，该至少一种生物标记选自表1或表2中的生物标记列表。

在另一方面，本发明提供了一种从同样引起受试者中的蛋白尿的其他病症 鉴别诊断肾脏疾病的方法，该方法包括测量来自受试者的样品中的至少一种 生物标记，该至少一种生物标记选自表1或表2中的生物标记列表。

在另一方面，本发明提供了一种鉴别诊断受试者的糖尿病前期、糖尿病和/ 或糖尿病相关病症的亚类或阶段的方法，该方法包括测量来自受试者的样品中 的至少一种生物标记，该至少一种生物标记选自表1或表2中的生物标记列表。

在另一方面，本发明提供了一种测试系统，该测试系统包括：

(i)用于获得来自受试者的样品中的测试结果数据的装置，这些测试结果 数据代表选自表1或表2中的生物标记列表的至少一种生物标记的水平；

(ii)用于收集和跟踪在步骤(i)中产生的测试结果数据的装置；

(iii)用于根据测试结果数据计算糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关病症 风险指标值的装置，其中所述风险指标值代表个体产生或患有糖尿病前期、糖 尿病和/或糖尿病相关病症的风险；以及

(iv)用于报告所述风险指标值的装置。

在另一方面，本发明提供了一种将一群个体进行分级或分组的方法，该 方法包括：获得在所述群体中的个体的糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关病 症的风险指数数据；并且基于包括所述获得的风险指数数据的因素，将在该群 体中的个体相对于该群体中的剩余个体进行分级或将该群体划分为至少两个 组。

在另一方面，本发明提供了一种用于评估受试者中的糖尿病前期、糖尿 病和/或糖尿病相关病症替代终点的方法，该方法包括：测量来自表1或表2中 的生物标记列表中的至少一种生物标记；以及基于所述测量评估受试者中的 糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关病症的替代终点。

在另一方面，本发明提供了一种评估受试者产生糖尿病前期、糖尿病和/或 糖尿病相关病症的方法，该方法包括测量来自受试者的样品中的至少一种生物 标记，其中所述至少一种生物标记选自表1或表2中的生物标记列表。

在另一方面，本发明提供了一种监测受试者产生糖尿病前期、糖尿病和/或 糖尿病相关病症的方法，该方法包括测量来自受试者的样品中的至少一种生物 标记，其中所述至少一种生物标记选自表1或表2中的生物标记列表。

在另一方面，本发明提供了一种诊断或鉴定受试者患有糖尿病前期、糖尿 病和/或糖尿病相关病症的方法，该方法包括测量来自受试者的样品中的至少一 种生物标记，其中所述至少一种生物标记选自表1或表2中的生物标记列表。

在另一方面，本发明提供了一种监测糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关 病症的治疗或干预的方法，该方法包括测量来自受试者的样品中的至少一种生 物标记，其中所述至少一种生物标记选自表1或表2中的生物标记列表。

在另一方面，本发明提供了一种鉴别诊断糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病 相关病症的疾病状态或亚类的方法，该方法包括测量来自受试者的样品中的至 少一种生物标记，其中所述至少一种生物标记选自表1或表2中的生物标记列 表。

在另一方面，本发明提供了一种治疗受试者中的糖尿病前期、糖尿病和/ 或糖尿病相关病症的方法，该方法包括：使用来自表1或表2的至少一种生物 标记评估受试者产生糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关病症的风险以及当 受试者被鉴定为具有糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关病症的升高的风险 时用一种治疗方案治疗受试者，从而延迟或防止糖尿病前期、糖尿病和/或糖 尿病相关病症的发作。

在另一方面，本发明提供了一种将一群受试者进行分级或分组的方法， 该方法包括：获得代表包含在所述群体中的受试者的糖尿病前期、糖尿病和 /或糖尿病相关病症的风险评分的数据，其中所述风险评分是使用来自表1 或表2的至少一种生物标记计算的，以及基于包括所述获得的风险评分数据 的因素将该群体中的受试者相对于在该群体中的剩余个体进行分级或者将 该将该群体划分为至少两个组。

在另一方面，本发明提供了一种鉴定或评定一种药剂用于治疗糖尿病前 期、糖尿病和/或糖尿病相关病症或降低其产生风险的方法，该方法包括：

(i)使表达来自表1或表2的至少一种生物标记的细胞与一种假定药剂 接触；并且

(ii)将来自表1或表2的至少一种生物标记在与该假定药剂接触之前的 细胞中的表达和/或水平与来自表1或表2的至少一种生物标记在与该假定药 剂接触之后的细胞中的表达和/或水平进行比较；

其中在水平或表达方面的变化将该药剂鉴定为用于治疗糖尿病前期、糖尿 病和/或糖尿病相关病症的药剂。

因此，在本发明的另一方面提供了表1或表2中的至少一种生物标记作为 针对糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关病症的药物靶标的用途。

在另一方面，本发明提供了一种治疗受试者中的糖尿病前期、糖尿病和/ 或糖尿病相关病症或降低其产生风险的方法，该方法包括向受试者给予有效 量的被适配成改变表1或表2中的至少一种生物标记的表达或水平的药剂。

在另一方面，本发明提供了被适配成改变表1或表2中的至少一种生物 标记的表达或水平的一种药剂的用途，用于制备用于治疗糖尿病前期、糖尿病 和/或糖尿病相关病症或降低其产生风险的一种药物。

附图简要说明

结合附图可以理解下面的发明详细说明（通过举例给出，但不旨在将本发 明限制于描述的特定实施例），其中：

图1为列出从三个研究获得的通过多反应监测（MRM）测量的关于糖尿病 患者中的糖尿病肾病的存在的生物标记蛋白数据的表格；

图2为一系列来自FDS1研究的列于图1中的每个生物标记的盒须图（左盒 形图：糖尿病组；右盒形图：患有严重肾病的糖尿病组；x轴：蛋白质/肽；y轴： 相对丰度比；肽序列：ATA=ATAVVDGAFK；TVA=TVAACNLPIVR；EYC= EYCGVPGDGDEELLR；LEP=LEPYADQLR；以及ISA=ISASAEELR）

图3为一系列来自FDS2研究的列于图1中的每个生物标记的盒须图（左盒 形图：糖尿病组；右盒形图：患有严重肾病的糖尿病组；x轴：蛋白质/肽；y轴： 相对丰度比；肽序列：IAF=IAFSATR；LEP=LEPYADQLR；ISA=ISASAEELR； ALA=ALAQCAPPPAVCAELVR；以及FLN=FLNVLSPR；DAL= DALSSVQESQVAQQAR；TVA=TVAACNLPIVR；EYC= EYCGVPGDGDEELLR；GDI=GDIGETGVPGAEGPR；TGD=TGDIVEFVCK； LVY=LVYPSCEEK）；

图4为一系列来自BDS研究的列于图1中的每个生物标记的盒须图（左盒 形图：糖尿病组；右盒形图：患有严重肾病的糖尿病组；x轴：蛋白质/肽；y轴： 相对丰度比；肽序列：LVG=LVGGDNLCSGR；IWL=IWLDNVR；SVS= SVSLPSLDPASAK；以及TEV=TEVIPPLIENR）；以及

图5为一个列出通过MRM测量的从BDS研究获得的关于患有糖尿病肾病 的患者以及健康患者的生物标记蛋白数据的表格。

发明详细说明

本发明涉及与糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关病症（如糖尿病肾病） 相关的生物标记的鉴定。因此，本发明以通过检测在此披露的生物标记来鉴定 具有产生糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关病症风险的受试者（包括没有糖 尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关病症的症状或仅仅显示出其非特异性指标的 那些受试者）的方法为特征。这些生物标记对于监测正在经历用于糖尿病前期、 糖尿病和/或糖尿病相关病症的治疗和疗法的患者，以及用于选择或修改在患有 糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关病症的受试者中将有效的疗法和治疗是同 样有用的，其中这样的治疗和疗法的选择和使用减缓了糖尿病前期、糖尿病和/ 或糖尿病相关病症的进展，或者防止了它们的发作。本发明还以用于糖尿病前 期、糖尿病和/或糖尿病相关病症的新的药物靶标为特征，包括图1或图2中的 至少一种生物标记。

定义

“用于治疗糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关病症或降低其产生风险的药 剂”包括：胰岛素（如成熟胰岛素、胰岛素原和可溶性C-肽（SCP）、速效胰岛 素形式、普通胰岛素、中效胰岛素以及长效胰岛素形式）；降血糖药；抗炎剂； 降血脂剂；以及抗高血压药（如钙通道阻滞剂、β-肾上腺素能受体阻滞剂、包括 COX-2抑制剂的药物前体的环氧合酶2抑制剂、包括血管紧张素II受体阻滞剂 （ARBs）、ACE抑制剂及肾素抑制剂的血管紧张素系统抑制剂，包括氨基酸及 其衍生物、肽及其衍生物以及肾素抗体）。

“血管紧张素II拮抗剂”是通过结合到血管紧张素II受体上并且干扰它的活 性来干扰血管紧张素II的活性的化合物，并且包括肽化合物和非肽化合物。大 多数血管紧张素II拮抗剂是被轻微修饰的同源物，其中通过用某种其他的氨基 酸替代在8位的苯丙氨酸来减弱激动活性。血管紧张素II拮抗剂的例子包括： 肽类化合物（例如，肌丙抗增压素、血管紧张素八肽（1-8）和相关类似物）； N-取代的咪唑-2-酮；咪唑乙酸酯衍生物（包括2-N-丁基-4-氯-1-(2-氯苯)咪唑-5- 乙酸）；4,5,6,7-四氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸及类似物衍生物；N2-四唑β- 葡糖苷酸类似物；取代的吡咯、吡唑、和三唑类；苯酚和杂环衍生物，如1,3- 咪唑；咪唑并稠合的7元环杂环；血管紧张素II的抗体；以及芳烷基咪唑化合 物如联苯-甲基取代的咪唑；ES8891（N-吗啉代乙酰基-(-1-萘基)-L-丙氨酰-1-(4, 噻唑基)-L-丙氨酰(35,45)-4-氨基-3-羟基-5-环-己戊酰-N-己酰胺）；SKF108566 （E-α-2-[2-丁基-1-(羧基苯基)甲基]1H-咪唑-5-基[亚甲基]-2-噻吩丙酸）；氯沙坦 （DUP753/MK954）；以及雷米克林。

“血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂”包括氨基酸和它们的衍生物、肽类，包 括二肽和三肽以及ACE抗体，它们通过抑制ACE活性在肾素-血管紧张素系统 中进行干预，由此减少或消除升压物质血管紧张素II的形成。已知作为ACE抑 制剂有用的化合物类包括酰基巯基脯氨酸和巯基烷酰基脯氨酸（如卡托普利和 佐芬普利）、羧烷基二肽（如依那普利、赖诺普利、喹那普利、雷米普利以及 培哚普利）、羧烷基二肽模拟物（如西拉普利和贝那普利）、氧膦基烷酰基脯 氨酸（如福辛普利和群多普利）。

“抗炎”剂包括阿氯芬酸、阿氯米松双丙酸酯、阿孕奈德；α淀粉酶；安西法 尔；安西非特；氨芬酸钠；盐酸氨普立糖；阿那白滞素；阿尼罗酸；阿尼扎芬； 阿扎丙宗；巴柳氮二钠；苄达酸；苯噁洛芬；盐酸苄达明；菠萝蛋白酶；溴哌 莫；布地奈德；卡洛芬；环洛芬；辛喷他宗；克利洛芬；丙酸氯倍米松；丁酸 氯倍他松；氯吡酸；丙酸氯硫卡松；醋酸三氟米松；可托多松；地夫可特；地 奈德；去羟米松；二丙酸地塞米松；双氯芬酸钾；双氯酚酸钠；双醋二氟拉松； 二氟米酮钠；二氟尼柳；二氟泼尼酯；地弗他酮；二甲亚砜；羟西奈德；甲地 松；恩莫单抗；依诺利康钠；依匹唑；依托度酸；依托芬那酯；联苯乙酸；非 那莫；芬布芬；芬氯酸；苯克洛酸；芬度柳；苯吡噁二酮；芬替酸；夫拉扎酮； 氟扎可特；氟芬那酸；氟咪唑；醋酸氟尼缩松；氟尼辛；氟尼辛葡胺；氟考丁 酯；醋酸氟美松龙；氟喹宗；氟比洛芬；氟瑞托芬；丙酸氟替卡松；呋喃洛芬； 呋罗布芬；哈西奈德；丙酸卤倍他索；醋酸卤泼尼松；异丁芬酸；布洛芬；布 洛芬铝；布洛芬吡甲酯；伊洛达普；吲哚美辛；吲哚美辛钠；吲哚洛芬；吲哚 克索；吲四唑；醋异氟龙；伊索克酸；伊索昔康；酮洛芬；盐酸洛非咪唑；氯 诺昔康；依碳氯替泼诺；甲氯灭酸钠；甲氯芬那酸；二丁酸甲氯松；甲芬那酸； 美沙拉秦；美西拉宗；磺庚甲泼尼龙；吗尼氟酯；萘丁美酮；萘普生；萘普生 钠；萘普索；尼马宗；奥沙拉秦钠；奥古蛋白；奥帕诺辛；奥沙普秦；羟布宗； 盐酸瑞尼托林；木聚硫钠；甘油保泰松钠；吡非尼酮；吡罗昔康；肉桂酸吡罗 昔康；吡罗昔康乙醇胺；吡洛芬；普立非酮；泼那扎特；普立非酮；普罗度酸； 普罗喹宗；普罗沙唑；枸橼酸普罗沙唑；利美索龙；氯马扎利；柳胆来司；沙 那西定；双水杨酯；水杨酸酯（Salycilate）；血根氯铵；司克拉宗；丝美辛；舒 多昔康；舒林酸；舒洛芬；他美辛；他尼氟酯；他洛柳酯；特丁非隆；替尼达 普；替尼达普钠；替诺昔康；替昔康；苄叉异喹酮；四氢甲吲胺；硫平酸；替 可的松匹伐酯；托美丁；托美丁钠；三氯奈德；三氟米酯；齐多美辛；糖皮质 激素；佐美酸钠；阿斯匹林；细胞因子抑制剂如细胞因子拮抗剂（例如IL-6受 体拮抗剂）、氮杂-烷基溶血磷脂（AALP）、以及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）抑制 剂，如抗TNF-α抗体、可溶性TNF受体、TNF-α、反义核酸分子、多价丙脒腙 （CNI-1493）、N-乙酰半胱氨酸、己酮可可碱（pentoxiphylline）、己酮可可碱 （oxpentifylline）、碳环核苷类似物、地塞比诺以及TNF-α抑制剂如依那西普和 英夫利昔单抗。

“β-肾上腺素能受体阻滞剂”拮抗儿茶酚胺在心绞痛、高血压以及心律失常中 的心血管效应，并且包括阿替洛尔、醋丁洛尔、阿普洛尔、苯呋洛尔、倍他洛 尔、布尼洛尔、卡替洛尔、塞利洛尔、hydroxalol、茚诺洛尔、拉贝洛尔、左布 诺洛尔、甲吲洛尔、美替洛尔、吲哚美辛、美托洛尔、metrizoranolol、氧烯洛尔、 吲哚洛尔、心得安、普拉洛尔、心得宁、索他洛尔纳多洛尔（sotalolnadolol）、替 普洛尔、tomalolol、噻吗洛尔、布拉洛尔、喷布洛尔、三甲苯心安、2-(3-(1,1- 二甲基乙基）-氨基-2-羟基丙氧基)-3-盐酸吡啶甲腈、1-丁基氨基-3-（2,5-二氯苯 氧基）-2-丙醇、1-异丙基氨基-3-(4-(2-环丙基甲氧基乙基)苯氧基)-2-丙醇、3-异 丙基氨基-1-(7-甲基茚满-4-基氧基)-2-丁醇、2-(3-叔丁基氨基-2-羟基-丙硫 基)-4-(5-氨基甲酰基-2-噻吩基)噻唑和7-(2-羟基-3-叔-丁基氨基丙氧基)苯酞。

“钙通道阻滞剂”属于三大类化学药物之一：二氢吡啶类（如硝苯地平）、苯 基烷基胺类（如维拉帕米）、以及苯并硫氮杂卓类（如地尔硫卓）。根据本发明 的其他有用的钙通道阻滞剂包括氨力农、氨氯地平、苄环烷、非洛地平、芬地 林、氟桂利嗪、伊拉地平、尼卡地平、尼莫地平、哌克昔林（perhexylene）、戈 洛帕米、噻帕米以及噻帕米类似物、苯妥英（phenyloin）、巴比妥类、以及肽类 强啡肽、Ω芋螺毒素以及Ω漏斗网蛛毒素。

“糖尿病”包括1型糖尿病（包括自身免疫性和特发性）、2型糖尿病和妊娠 糖尿病。糖尿病可以以复发性和持续性高血糖为特征，并且可以通过增加的血 糖水平和糖化血红蛋白（≥6.5%）而被诊断。根据当前的定义，两项空腹血 糖测量值超过126mg/dL（7.0mmol/L）被认为诊断为糖尿病。

“糖尿病相关病症”包括为糖尿病的结果或并发症的或另外地与糖尿病关联 或相关的任何病症或疾病，包括由高于正常的血糖水平引起的病症以及选自一 个列表的病症，该列表包括：低血糖、糖尿病酮症酸中毒、糖尿病神经病变、 肾脏疾病包括糖尿病肾病、心血管疾病、中风和糖尿病视网膜病以及动脉血管 疾病（arteriovascular disease）。

在本发明的上下文中的“生物标记”包含（不限于）在表1或表2中的蛋白质 以及其实际量度；编码表1或表2中的蛋白质的核酸；表1或表2中的蛋白质 的代谢物和降解产物；表1或表2中的蛋白质的多晶型、突变、变体、修饰、 亚基、肽类（如表3中的那些）以及片段；以及蛋白质-配体复合物（包括表1 或表2中的蛋白质）。生物标记还包括与表1或表2中的蛋白质具有至少50%、 60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性或相似性的蛋 白质以及表1或表2中的蛋白质的突变形式和编码这样的突变的核酸。这些生 物标记可以用来计算数学指数或其他量度，包括相对于本发明有用的时间趋势 和差异。

“妊娠糖尿病”是指在怀孕期间的葡萄糖耐受不良。这种病症导致在怀孕过程 中开始的或首次被诊断的高血糖。

“降血糖”药包括口服降血糖药并且包括（但不限于）第一代磺脲类：醋磺己 脲、氯磺丙脲、甲磺丁脲；二代磺脲类：格列吡嗪、格列本脲、格列美脲；双 胍类：二甲双胍；α-葡糖苷酶抑制剂：阿卡波糖、米格列醇；噻唑烷二酮类：罗 格列酮、吡格列酮、曲格列酮；氯茴苯酸类：瑞格列奈；以及其他降血糖药如 阿卡波糖；丁福明；盐酸丁氧胺；卡格列波糖；环格列酮；恩格列酮钠；达格 列酮钠；盐酸依托双胍；格列胺脲；格列波脲（Glibomuride）；格列他尼；格 列齐特钠；格列氟胺；胰高血糖素；格列己脲；格列嘧啶钠；格列辛脲；格列 帕脲；利诺格列；富马酸利诺格列；帕莫酸甲酯；帕莫酸钠；酒石酸吡咯格列； 人胰岛素原；醋酸司格列肽；妥拉磺脲；甲苯磺吡胺；唑泊司他。

“空腹血糖受损”（IFG）是一种与高于正常血糖水平但还没有高到足以被分 类为糖尿病的血糖水平相关的糖尿病前期状态。具有IFG的受试者可能具有低 于或等于125mg/dL，在100mg/dL与125mg/dL之间或在105mg/dL与125 mg/dL之间的空腹血糖（葡萄糖）水平。

使用在此的术语“一致性”是指在两个或更多个分子的序列间的关系，如通过 比较这些序列所确定的。“一致性”表示在多肽或核酸分子序列之间的序列相关性 程度，如这种情况可以是通过核苷酸或氨基酸序列串间的匹配而确定的。“一致 性”量度了在两个或多个带有空位比对的序列之间的相同匹配的百分比，该空位 比对通过计算机程序的特定数学模型解决。

“葡萄糖耐量降低”（IGT）是一种与高于正常血糖水平但还没有高到足以被 分类为糖尿病的血糖水平相关的糖尿病前期状态。患有IGT的受试者在75g口 服葡萄糖耐量试验中可能具有140mg/dL到199mg/dL（7.8mmoL到11.0mmoL） 的两小时葡萄糖水平。

“降血脂剂”包括吉非贝齐、考来烯胺（cholystyramine）、考来替泊、烟酸以 及HMG-CoA还原酶抑制剂，如辛伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀钠、氟伐他汀、 阿托伐他汀和西立伐他汀。

如在此使用的术语“测量（measuring）”以及变体如“测量（measure）”关于 在此描述的生物标记是指确定给定的生物标记的存在和/或量。

“糖尿病前期”是一种其中满足部分但不是所有糖尿病的诊断标准的状态。它 包括其中受试者表现为在正常与糖尿病水平之间的血糖水平的情况、其中受试 者经受葡萄糖耐量降低（IGT）、空腹血糖受损（IFG）和/或在5.7%与6.4%之间 的糖化血红蛋白的情况。

在本发明的上下文中的“样品”是分离自受试者的生物样品，并且可以包括 （通过举例但不限于）全血、血液部分、血清、血浆、血细胞、内皮细胞、组 织活检样品、淋巴液、腹水液、组织间液（也被称为“细胞外液”并且包括发现于 细胞之间的间隙的液体，包括尤其是龈沟液）、骨髓、脑脊液（CSF）、唾液、 粘液、痰液、汗液、尿液或任何其他分泌物、排泄物或其他体液。

术语“相似性”是与“一致性”有关的概念，但是相反地是指相似性的一种量 度，包括相同的匹配和保守置换匹配。由于保守置换应适用于多肽而不是核酸 分子，相似性仅涉及多肽序列的比较。例如，如果两个多肽序列的20个氨基酸 中有10个相同，并且剩余的都是非保守置换，那么一致性和相似性百分比两者 都是50%。在相同的实例中，如果有另外的5个位置存在保守置换，那么一致 性百分比仍为50%，但是相似性百分比为75%（20个中的15个）。因此，在存 在保守置换的情况下，在两个多肽序列之间的相似性程度将比这两个序列之间 的一致性百分比高。

术语“保守氨基酸置换”是指用一个标准的残基置换一个天然的氨基酸残基 使得对在该位置处的氨基酸残基的极性或电荷影响很小或没有影响。例如，用 其他任何非极性残基置换一个多肽中的非极性残基导致一个保守置换。此外， 多肽中的任何天然残基也可以用丙氨酸置换。保守氨基酸置换的一般规则在下 面的表中列出：

保守氨基酸置换还包括典型地通过化学肽合成而不是在生物系统中合成的 非天然发生的氨基酸残基。这些包括模拟肽，以及其他氨基酸部分的反转形式 或反向形式。预期氨基酸序列的保守修饰（以及相应的对应于编码核苷酸的修 饰）将产生具有与表1中的那些生物标记相似的功能特性和化学特性的多肽。 相反，表1中的生物标记的功能特性和/或化学特性的实质性修饰可以通过选择 与它们在维持（a）在该置换的区域中的分子主链的结构，例如一个折叠或螺旋 构象、（b）在目标位点的分子的电荷或疏水性、或（c）侧链的体积的作用方面 的显著不同的置换来实现。天然发生的残基可以基于常见的侧链性质分组：

1)疏水的：正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；

2)中性亲水的：半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；

3)酸性的：天冬氨酸、谷氨酸；

4)碱性的：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸；

5)影响链取向的残基:甘氨酸、脯氨酸；以及

6)芳香族的：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。

优选的用于确定一致性和/或相似性的方法被设计为在测试的序列之间给出 最大的匹配。用于确定一致性和相似性的方法被编入可公开获得的计算机程序 中。优选的用于确定在两个序列之间的一致性和相似性的计算机程序方法包括 GCG程序包，包括GAP（Devereux等人，《核酸研究》（Nuc.Acids Res.），12:387 （1984）；遗传学电脑集团（Genetics Computer Group），University of Wisconsi （威斯康辛大学），Madison（麦迪逊），威斯康辛）、BLASTP、BLASTN、以及 FASTA（Atschul等人，《分子生物学杂志》（J.Mol.Biol），215:403-10（1990））。 BLAST X程序从国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology  Information，NCBI）以及其他来源（Altschul等人，BLAST手册（NCB NLM NIH， Bethesda（贝塞斯达），Md.（马里兰州）；Altschul等人，1990，上文）是可公开 获得的。熟知的史密斯-沃特曼算法（Smith Waterman algorithm）也可以用来确 定一致性。

在本发明的上下文中的“受试者”优选地是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非 人灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马、或奶牛。受试者可以是已经在先前被诊 断或鉴定为患有糖尿病、糖尿病前期或糖尿病相关病症的受试者，并且任选地 已经经历或正在经历用于糖尿病、糖尿病前期或糖尿病相关病症的治疗性干预。 可替代地，受试者可以是在先前未曾被诊断为患有糖尿病前期、糖尿病和/或糖 尿病相关病症的受试者。例如，受试者可以是展现出糖尿病前期、糖尿病和/或 糖尿病相关病症的一个或多个风险因素的受试者，或者是没有展现出这种风险 因素的受试者或没有糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关病症的症状的受试者。 受试者还可以是正在遭受糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关病症或处于其产 生风险的受试者。

诊断和预测

本发明提供了改进的糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症的诊断和预测。 可以通过测量在此描述的一种或多种生物标记并且将测量值与参考或指标值比 较来评定发生糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症的风险。这样的比较可以 用数学算法或公式进行，以便将来自多个单独的生物标记结果的信息和其他参 数结合成单一的量度或指数。可以任选地选择被鉴定为具有增高的糖尿病前期、 糖尿病或糖尿病相关病症的风险的受试者来接受治疗方案，如给予预防性的或 治疗性的化合物或运动方案的实施或膳食补充剂来防止、治疗或延迟糖尿病前 期、糖尿病或糖尿病相关病症的发作。

可以测量在一个测试样品中的生物标记的量，并且与一个参照或正常水平 比较，利用例如参考限、鉴别限或风险定义阈值等技术来定义针对糖尿病前期、 糖尿病或糖尿病相关病症的截止点和异常值。正常的对照水平是典型地发现于 在没有经受糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症的受试者中的一种或多种生 物标记或组合的生物标记指数的水平。正常水平、异常水平和截止点可能基于 一种生物标记是单独地被使用还是在公式中与其他生物标记组合成指数而变 化。可替代地，正常或异常水平可以是在临床相关时间范围中来自产生或没有 产生或转化成糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症的先前测试的受试者的生 物标记模式或“特征”的数据库。

本发明可以用来进行产生或转化为糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症 的风险的连续或分类测量，从而用一个定义的临床状态诊断和定义受试者类别 的风险谱。在分类的情况下，本发明的方法可以用来在正常同期组群与患有糖 尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症的同期组群之间进行辨别。在其他实施例 中，本发明可以用来辨别糖尿病前期与糖尿病、糖尿病与正常情况、不同的糖 尿病相关病症、或不同的糖尿病病症与正常情况。这种区分用途可能在单独的 组、数学算法、和/或截止点中需要不同的生物标记组合，但是为了预期用途它 们经受相同的前述的精确度测量。

在产生糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症之前鉴定受试者使得能够选 择和开始各种治疗性干预或治疗方案，以便延迟、减缓或防止受试者转化到疾 病状态。监测至少一种生物标记的水平还允许糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相 关病症的治疗过程被监测。例如，可以从经历治疗方案或治疗性干预的受试者 提供样品，例如用于糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症的药物治疗。这种 治疗方案或治疗性干预可以包括运动方案、膳食调整、膳食补充、肥胖手术干 预、药物给予以及用于被诊断为或被鉴定为患有糖尿病前期、糖尿病或糖尿病 相关病症的受试者的治疗性或预防性治疗。可以在治疗之前、过程中或之后的 不同时间点从受试者获得样品。

本发明还可以用来筛选在不同情景下的群体。对于受试者群组，可以筛选： 鉴定需要干预的那些受试者；用于收集流行病学数据；评定他们用于健康保险 目的。当与糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症的临床量度相关联时，通过 群体筛选获得的数据将会是特别有价值的，并且可以被存储到数据阵列中或机 器可读介质中的其他收集物中，以便于被卫生保健服务提供者和联盟保健产业 使用，从而提高服务递送和效率并因此改善患者的结局。

机器可读存储介质包括任何用机器可读数据或数据阵列编码的数据存储材 料，当使用一种用指令编程的机器来使用所述数据时，能够用于多种目的，如 （但不限于）提供或产生关于随着时间的推移或者响应于干预或治疗以及药物 发现的糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症风险因素的受试者信息。本发明 的生物标记的评定或测量和/或由此确定的风险可以在可编程计算机上的计算机 程序执行中实施，可编程计算机包括（除了别的以外）一个处理器、一个数据 存储系统（包括易失性存储器和非易失性存储器和/或存储元件）、至少一种输入 设备、以及至少一种输出设备。应用程序代码或软件来输入数据，以便进行需 要产生所需要的输出的功能。

该程序代码或软件可以进行一种或多种与关于生物标记的数据有关的功 能，这些功能包括：确定生物标记的正常或异常水平并且将生物标记的水平与 参考值比较，例如，对照受试者或其糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症状 态已知的群体或指标值或基线值。参考样品或指标值或基线值可能取自或衍生 自一个或多个已经暴露于治疗的受试者，或者可能取自或衍生自一个或多个具 有低的产生糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症风险的受试者，或者可以取 自或衍生自由于暴露于治疗已经在一个或多个与糖尿病前期、糖尿病或糖尿病 相关病症（包括建立的临床参数）相关的风险因素方面显示出改善的受试者。 该参考样品或指标值或基线值也可以取自或衍生自一个或多个未曾暴露于治疗 的受试者。例如，可以从受试者收集样品来监测治疗的进展，这些受试者已经 接受用于糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症的初期治疗以及用于糖尿病前 期、糖尿病或糖尿病相关病症的后续治疗。参考值还可以包括衍生自风险预测 算法的值或衍生自群体研究的计算指数。

因此，本发明的生物标记可以用来产生受试者的生物标记特征谱或特征：(i) 不具有或预期不会产生糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症的受试者和/或(ii) 具有或者预期会产生糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症的受试者。受试者 的生物标记谱可以与预设或参考生物标记谱比较，以便诊断或鉴定具有产生糖 尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症的风险的受试者，监测疾病的进展、以及 疾病进展的速率，并且监测糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症治疗的效果。 优选地，本发明的生物标记谱被包含在机器可读介质中并且在它们在可以用接 到的另外的数据更新的范围内是“活的”，从而提高这些生物标记的强度和临床意 义。关于本发明的生物标记的数据也可以与其他数据或测试结果相结合或相关 联，如（但不限于）临床参数的测量或其他用于糖尿病前期、糖尿病或糖尿病 相关病症的算法。其他数据包括年龄、种族、体重指数（BMI）、总胆固醇水平、 葡萄糖水平、血压、LDL以及HDL水平。机器可读介质还可以包括受试者信息， 如病史和任何其他相关家族史。

本发明还提供了用于鉴定用于治疗糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症 的药剂的方法，这些药剂对于特定的受试者是适当的或另外地定制的。在这方 面，可以从来自暴露于治疗剂或药物的受试者取得测试样品，并且可以确定一 种或多种生物标记的水平。一种或多种生物标记的水平可以与在治疗之前或之 后从衍生自受试者的样品比较，或者可以与衍生自由于这样的治疗或暴露在风 险因素方面已经显示出改善的受试者中的样品比较。

测试

本发明的生物标记及其组可以在一系列的测试系统中实施。典型地，测试 系统包括一个用于从样品获得测试数据的装置、一个用于针对样品用于收集、 存储、处理和/或跟踪测试结果的装置（通常在一个数据库中）、以及一个用于报 告测试结果的装置。用于获得测试结果的装置可以包括被适配成利用生化分析、 免疫分析以及核酸检测分析的一种或多种进行自动测试的一个模块。一些测试 系统可以处理多种样品并且可以对给定样品运行多次测试。用于收集、存储、 处理和/或跟踪测试结果的装置可以包括物理和/或电子数据存储设备，如硬盘驱 动器或闪速存储器或纸打印装置。用于报告测试结果的装置可以包括一个可视 显示器、一个连接到数据结构或数据库的连接、或一台打印机。在这方面，该 报告装置可以简单地是一个数据连接，它被适配成向另一个设备（如数据库、 可视显示器、或打印机）发送结果。

因此，本发明提供了一种测试系统，该测试系统被适配成辅助鉴定具有产 生糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症的风险、或被诊断为糖尿病前期、糖 尿病或糖尿病相关病症的个体，该测试系统包括使用关于在此描述的至少一种 生物标记数据的一个装置。典型地，来自本发明的系统的测试结果作为向电脑 或微处理器的输入，该电脑或微处理器用机器码或软件编程，其带有关于在此 描述的至少一种生物标记的数据并且确定产生或者已经具有糖尿病前期、糖尿 病或糖尿病相关病症的风险。

生物标记选择

表1中的生物标记已经被鉴定为发现在患有糖尿病或糖尿病肾病患者中具 有改变的或调整的存在或浓度水平。因此，本发明的生物标记和方法允许本领 域的技术人员鉴定、诊断或者另外地评定受试者，这些受试者没有展现出糖尿 病前期、糖尿病或糖尿病相关病症的任何症状，但是尽管如此可能患有糖尿病 前期、糖尿病或糖尿病相关病症或者具有产生它们的风险。

可以选择表1或表2中的一种或多种生物标记来形成一组标记物。例如， 本发明的一个实施例是一种评估产生糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症的 方法，该方法包括测量来自表1或表2的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12或13种生物标记的水平的步骤。优选地，该组包括下列中的至少一种： 过氧化物还原酶2（P32119）、蛋白AMBP（P02760）；载脂蛋白A-IV（P06727） 以及补体C1q子成分亚基B（P02746）；脂联素（Q15848）、补体因子H相关蛋 白2（P36980）、血红蛋白亚基β（P68871）、载脂蛋白B-100（P04114）以及巯 基氧化酶1（O00391）中的至少一种；或者载脂蛋白C-III（P02656）、胰岛素样 生长因子结合蛋白3（P17936）、CD5抗原样蛋白（O43866）以及补体成分C8β 链（P07358）中的至少一种。

临床算法

使用本发明的生物标记获得的结果可以使用任何一种或多种公式结合到在 发明的实践中有用的指数中。如上所述（但不限于），在多种其他指示中，这些 指数可能表明从一种疾病状态转化到另一种疾病状态的概率、可能性、绝对或 相对风险、时间或速率，或者预测糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症的未 来生物标记量度。这可能持续一个特定的时期或范围，或者持续剩余的寿命风 险，或者简单地被提供作为相对于另一个参考受试者群体的指数。

优选的公式包括广泛类的统计分类算法，如相对操作特性（ROC）、判别分 析例如线性判别分析（LDA）的使用。可以使用具有不同阈值的基于特征基因 （eigengene）的方法（ELDA）或基于多元方差分析（MANOVA）的步进算法 来鉴定LDA特征。可以基于霍特林-劳利（Hotelling-Lawley）统计进行前向算 法、后向算法以及逐步算法将未分离的可能性降到最低限度。也可以分开地使 用或组合使用其他的公式包括支持向量机（SVM）、随机森林或递归分割来鉴定 最重要的生物标记组合。

可以使用其他的公式，以便在进一步处理之前将单独的生物标记测量的结 果预处理成更有价值的形式的信息。预处理包括使用数学转换（如对数函数或 逻辑函数）将生物标记结果进行反向转换和平方根转换、归一化。基于临床参 数（如年龄、性别、种族、BMI或性别）的归一化是特别优选的。

一个或多个临床参数可以结合本发明的生物标记用于本发明的实践中，作 为公式的输入或作为使用特定的生物标记组和公式测量的定义相关群体的预筛 选标准。临床参数还可以在生物标记的归一化和预处理、或者在生物标记的选 择、组构建、公式类型选择和衍生、以及公式结果后处理中是有用的。

本发明的生物标记组可以针对预期的群体和终点或用途而被定制。例如， 生物标记组和公式可以用于评定受试者的一级预防和诊断以及二级预防和管 理。对于初步评定，这些组和公式可以用于病症的预测和风险分层、糖尿病病 症的诊断、血糖水平和变化速率的预测以及未来诊断的指示。对于二级预防和 管理，这些组和公式可以用于糖尿病并发症的预测和风险分层。这些组和公式 可以用于临床决策支持，例如确定是否推迟到下一次就诊的干预、是否推荐常 规的预防性检查、是否推荐增加的就诊频率、是否推荐增加的测试以及是否推 荐治疗性干预。这些组和公式对于具有糖尿病病症的受试者中的干预可能也是 有用的，如治疗选择和反应、治疗的调整和给药、监测进行中的治疗效果以及 在治疗性干预中变化的指示。

本发明的疾病终点包括糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症。在此的组 和公式可以通过辅助诊断和/或确定糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症的严 重性和/或确定疾病或病症的亚类来评估疾病终点的当前状态在此的组和公式对 于确定干预的未来状态也是有用的，例如确定用疗法、干预和药物疗法的未来 糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症的预后。本发明可以被定制为特定的干 预、药物类、治疗类或疗法或药物疗法或它们的组合。

本发明的替代终点包括测量HBAIc、葡萄糖（I7PG和OGTT）、以及葡萄糖 类（正常葡萄糖耐量（NGT）、IGT、IFG以及T2DM）。在此的组和公式对于通 过诊断空腹或不空腹的葡糖糖类来确定替代终点的当前状态是有用的。可以使 用在此的生物标记组来确定替代终点的未来状态，如确定未来葡萄糖组的预后。 生物标记组和公式对于确定干预的未来状态也是有用的，例如确定用药物疗法 的未来葡萄糖组的预后。

糖尿病病症的并发症终点包括在此的糖尿病相关病症，如肾脏疾病、眼睛 视网膜病变、微血管损伤、肝损伤、截肢以及心血管并发症。这些生物标记组 和公式可以通过辅助诊断糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症来评估疾病终 点的当前状态。可以使用生物标记组和公式来确定并发症终点的未来状态，例 如确定未来糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症的预后。这些组和公式对于 确定干预的未来状态也是有用的，例如确定具有治疗的未来糖尿病前期、糖尿 病或糖尿病相关病症的预后。

用于治疗糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相关病症或降低其产生风险的药剂

本发明的生物标记也可以用来鉴定或评定用于治疗糖尿病前期、糖尿病或 糖尿病相关病症或降低其产生风险的药剂。因此，本发明还提供了一种鉴定或 评定用于治疗糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关病症或降低其产生风险的药 剂的方法，该方法包括：

(i)使表达来自表1或表2的至少一种生物标记的细胞与一种假定药剂接 触；并且

(ii)将来自表1或表2的至少一种生物标记在与该假定药剂接触之前的 细胞中的表达或水平与来自表1或表2的至少一种生物标记在与该假定药剂 接触之后的细胞中的表达进行比较；

其中表达或水平的变化将该药剂鉴定为用于治疗糖尿病前期、糖尿病和/ 或糖尿病相关病症的药剂。

这些细胞可以在体内与这些假定药剂接触，如在动物模型中，或者在体外 接触，如在细胞培养物或细胞系中。可以使用计算机驱动的程序或软件来比较 该表达或水平。

本发明还提供了一种治疗在受试者中的糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相 关病症或降低其产生风险的方法，该方法包括向受试者给予有效量的被适配成 改变表1或表2中的至少一种生物标记的表达或水平的药剂。

可以根据如由有适当资格的从业者选择的任何已知的方法来给予该药剂。 这些药剂可以作为包含有效量的与药学上可接受的物质（例如药学上可接受的 载体）混合的药剂的组合物的一部分而被给予。该载体材料可以是注射用水， 优选补充有用于向哺乳动物给予的常用于溶液中的其他材料。如果需要，可以 包括标准的药学上可接受的物质，例如载体、稀释剂、以及赋形剂。其他示例 性的组合物包括pH大约7.0到8.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，或pH大约4.0 到5.5的醋酸盐缓冲液，还可以进一步包括山梨醇或其适合的替代物。

可以由本领域的一位技术人员根据给药途径、递送形式以及所希望的剂型 确定该药剂的最优配方。参见，例如《雷明顿药物科学》（Remington's  Pharmaceutical Sciences），1435-1712（第18版，A.R.Gennaro编辑，马克出版 公司（Mack Publishing Company），1990）。这样的组合物可能影响物理状态、稳 定性、体内释放速率以及体内清除速率。

因此，在本发明还提供了一种药剂用于制备用于治疗糖尿病前期、糖尿病 和/或糖尿病相关病症或降低其产生风险的用途，该药剂被适配为改变表1或表 2中的至少一种生物标记的表达或水平。

优选地，该被适配为改变表1或表2中的至少一种生物标记的表达或水平 的药剂是一种用于治疗如在此定义的糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关病症 或降低期产生风险的药剂。其他用于治疗糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相关 病症或降低其产生风险的药剂包括脂肪酶抑制剂如新利司他；合成糊精类似物 如含有或不含有瘦素的醋酸普兰林肽制剂；钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂如 舍格列净、YM543、达格列净、双重脂肪甘油三酯脂酶和PI3激酶活化剂如 Adyvia；神经肽Y2、Y4和Y5受体的的拮抗剂，人激素PYY3-36合成类似物和 胰多肽；大麻素受体CB1受体拮抗剂如利莫纳班、泰伦那班、CP-945,598、激 素如油酰雌酮；血清素、多巴胺以及去甲肾上腺素的抑制剂（在本领域中也被 称为“三单胺再摄取抑制剂”），如特索芬辛；去甲肾上腺素以及多巴胺再摄取抑 制剂，如Contrave（安非他酮加上阿片拮抗剂纳曲酮）以及Excalia（安非他酮 加上抗惊厥药唑尼沙胺）；1型111.β羟基类固醇脱氢酶类（11b-HSD1）抑制剂； 皮质醇合成抑制剂如酮康唑；糖异生抑制剂；葡糖激酶激活剂；蛋白酪氨酸磷 酸酶-1B的反义抑制剂；以及其他药剂，像胃泌素和表皮生长因子（EGF）类似 物的注射剂如胰岛新生疗法（E1-I.N.T.）；以及倍他司汀。

生物标记测量

可以使用一系列的技术中的一种或多种测量生物标记。优选地，以一种使 受试者变异性最小化的方式测量这些生物标记。例如，可以在空腹状态下测量 它们，并且最常见地是在早晨，由于食物消耗和代谢以及昼夜变化，提供了降 低水平的受试者变异性。在本发明中，可以使用任何空腹的或基于时间的取样 程序。

可以使用本领域已知的任何方法在蛋白质水平或核酸水平上确定在此的生 物标记的水平的实际测量。例如，在核酸水平，可以使用Northern和Southern杂 交分析、以及使用特异性识别这些序列中的一种或多种的核糖核酸酶保护测定 来确定基因表达。还可以使用基于反转录的PCR测定（RT-PCR），例如，使用 用于基因的差异表达序列的引物来测量生物标记水平。优选地，可以在蛋白质 水平上，例如通过测量由在此描述的基因产物编码的肽的水平、或者其活性来 确定生物标记水平。这样的方法包括，例如基于针对由这些基因编码的蛋白质 的抗体的免疫测定、适配体或分子印迹。

可以以任何适合的方式检测表1或表2中的生物标记、多肽、肽、突变以 及其多晶型，但是典型地通过使来自受试者的样品与结合生物标记蛋白、多肽、 突变或多晶型的一种抗体接触并且然后检测反应产物的存在或不存在来进行检 测。抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体或前述抗体的一个片段， 并且检测反应产物的步骤可以用任何适合的免疫测定来进行。

根据本发明实施的免疫测定可以是均相测定或非均相测定。在均相测定中， 免疫反应通常涉及针对该生物标记的特异性抗体、标记的分析物、以及感兴趣 的样品。在该抗体与该标记的分析物结合后，直接或间接地改变了由该标记产 生的信号。该免疫反应和其检测程度两者都可以在一个均相溶液中进行。可能 被采用的免疫化学标记包括自由基、放射性同位素、荧光染料、酶、噬菌体、 或辅酶。

在非均相测定方法中，这些试剂通常是样品、抗体以及用于产生可检测信 号的装置。可以使用以上所述的样品。该抗体可以被固定到支持物上，如小球 （如蛋白A和蛋白G琼脂糖小球）、板或载玻片，并且与在液相中的被怀疑含有 抗原的标本接触。然后将该支持物从该液相中分离，并且采用用于产生这样的 信号的装置来检测该支持物相或该液相的可检测信号。这种信号与在样品中的 分析物的存在有关。用于产生可检测信号的装置包括放射性标记、荧光标记或 酶标记的使用。例如，如果待检测的抗原含有第二结合部位，则与该部位结合 的抗体可以与可检测基团结合并且在分离步骤之前将其添加到液相反应溶液 中。在固相支持物上的可检测基团的存在指示了在该测试样品中抗原的存在。 适合的免疫测定的实例包括寡核苷酸、免疫印迹法、免疫沉淀法、免疫荧光法、 化学发光法、电化学发光（ECL）或酶联免疫测定。

使用表1中的由生物标记数据库入口提供的序列信息，可以使用本领域的 普通技术人员熟知的方法检测和测量生物标记序列的表达（如果存在的话），如 Northern印迹杂交分析或特异性地并且优选地定量扩增特定核酸序列的方法。作 为另一个实例，这些序列可以用来构建用于特异性地扩增生物标记序列的引物， 例如在基于扩增的检测方法中，如基于反转录的聚合酶链式反应（RT-PCR）。当 基因表达中的改变与基因扩增、缺失、多态性或突变相关时，可以通过比较在 测试细胞群与参考细胞群中的被检验的DNA或RNA序列的相对量来进行在测 试群和参考群中的序列比较。

还可以使用本领域技术人员已知的多种方法中的一种或多种来测量生物标 记蛋白和/或核酸代谢物，包括折射率光谱（RI）、紫外线光谱（UV）、荧光分 析、放射化学分析、近红外光谱（近IR）、核磁共振光谱（NMR）、光散射分 析（LS）、质谱法（包括多重反应监测（MRM）质谱法、热解质谱法）、比浊 法、色散拉曼光谱、气相色谱质谱联合分析法、液相色谱质谱联合分析法、基 质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF）、离子喷雾光谱质谱联合 分析法、毛细管电泳、NMR以及IR检测。

当使用质谱法测量这些生物标记时，它们可以通过一种肽来测量，该肽选 自以下列表：

(i)来自表1或表2的蛋白质的一个5-25个氨基酸的肽；

(ii)来自表1或表2的蛋白质的一个5-20个氨基酸的肽；

(iii)来自表1或表2的蛋白质的一个10-20个氨基酸的肽；

(iv)来自表1或表2的蛋白质的一个10-15个氨基酸的肽；或者

(v)表3中的一个肽。

试剂盒

本发明还提供了一种生物标记检测试剂，例如一种对于表1或表2中的生 物标记蛋白或表3中的肽特异的抗体，或一种通过具有同源的核苷酸序列特异 性地识别或结合到一种或多种编码表1或表2中的生物标记蛋白或表3中的肽 的核酸，如寡核苷酸序列或适配体，其与以试剂盒的形式包装在一起的核酸的 一部分互补。除了别的以外，该试剂盒可以在分开的容器中含有一种核酸或一 种抗体（已经结合到固相基质上或者与用于将它们结合到该基质上的试剂分开 包装）、对照制剂（阳性和/或阴性）、和/或可检测标记如荧光素、绿色荧光蛋白、 罗丹明、花青染料、亚历克萨染料、萤光素酶、放射性示踪标记。进行测定的 说明书也可以包括在试剂盒中。例如，测定可以是Northern杂交、夹心ELISA 或蛋白质抗体阵列的形式。

用于检测本发明的生物标记的试剂可以被固定到固体基质（如多孔条）上 以便形成至少一个生物标记检测位点。该多孔条的测量或检测区域可以包括多 个含有抗体或核酸的位点。一个测试条也可以含有用于阴性和/或阳性对照的位 点。可替代地，对照位点可以位于与测试条分开的带上。任选地，不同的检测 位点可以含有不同量的固定的抗体或核酸，如在第一检测位点上的量较高而在 随后的位点上的量较低。在添加测试样品后，显示出可检测信号的位点的数目 提供了存在于该样品中的生物标记的量的定量指示。这些检测位点可以被配置 成任何适合的可检测形状，并且典型地呈跨过测试条的宽度的条或点的形状。

可替代地，试剂盒含有核酸基质阵列，该核酸基质阵列包含一个或多个核 酸序列。位于该阵列上的核酸特异性地识别一种或多种核酸序列，这种核酸序 列被适配为结合编码表1或表2中的生物标记的核酸序列。该基质阵列可以在 例如固体基质或“芯片”上。可替代地，该基质阵列可以是溶液阵列。

实例

实例1-糖尿病生物标记的鉴定和确认

1.材料/方法

A．同期组群说明

A.1.弗里曼特尔糖尿病研究（1期）

理论：本FDS1同期组群包括1294位患有2型糖尿病的患者。选择具有和 不具有糖尿病肾病的糖尿病受试者，以便提供显著不同的表型展示，使得能够 在蛋白质表达中差异最大。

I期弗里曼特尔研究（FDS）是在来自稳定的邮政编码限定的120,097人的 城市社区的患者中的糖尿病护理、控制、并发症以及花费的纵向观察研究。当 在1991年构思I期时，还很少有公开的糖尿病自然病史数据。

A.2.弗里曼特尔糖尿病研究（2期）

理论：FDS2同期组群招募了在弗里曼特尔地区以及其他来自FDS1同期组 群数据库中的被临床医生提及的糖尿病患者。选择具有和不具有糖尿病肾病的 糖尿病受试者，以便提供显著不同的表型展示，使得能够在蛋白质表达中差异 最大。

II期在2007年被构思用于改进的和扩展的数据收集，以便表征在同时期的 澳大利亚的城市的糖尿病的性质。

A.3.巴瑟尔顿糖尿病研究

理论：从一个乡村社区扩展关于糖尿病患者的信息。完善从FDS1和FDS2 城市研究中获得的信息。包括匹配的非糖尿病对照受试者。

巴瑟尔顿健康研究是世界上运行时间最长的流行病学研究计划之一。自从 1966年，在西澳大利亚的西南的一个沿海社区的巴瑟尔顿城市的居民已经参与 一系列健康调查。迄今为止，超过16,000的各年龄的男性、女性以及小孩已经 参加到调查中并且已经为帮助许多常见疾病和健康状况的了解做出贡献。

B.使用iTRAQ和2D LC MALDI TOF/TOF的蛋白质生物标记发现

该发现方法学涉及用化学方法标记不同组（例如糖尿病肾病相对于没有肾 病的糖尿病患者）的患者的血浆并且用质谱法确定特定蛋白质的存在的相对比。 在分析之后具有显著的改变的浓度的蛋白质指示了与其他组相比的一组患者在 生物化学方面的变化。本技术被用来测量每个样品中的130-200种蛋白质的相对 浓度。鉴定了在组间具有显著不同的浓度的蛋白质，并且选择这些蛋白质用于 进一步通过MRM方法学进行检验（下面的C部分）。

B.1.样品制备

在免疫耗竭之前使用MARS14HPLC柱（安捷伦科技）汇集具有14种最丰 富的蛋白质的血浆样品（N=10或20）。使用10kDa截留自旋过滤器（赛多利 斯）将免疫耗竭的样品缓冲交换为1M三乙基碳酸氢铵。根据iTRAQ方案（应 用生物系统公司）将蛋白质样品还原、烷基化、胰蛋白酶消化并且标记。

B.2.仪器分析

在用强阳离子交换液相色谱（SCX）在安捷伦1100HPLC上用一种聚磺乙 基柱（4.6mm×100mm，5μm，）在分离之前，在一个Strata-X33μM聚 合物反相柱（菲罗门）上对肽脱盐。用0mM到400mM的线性梯度的KCl洗 脱肽。将SCX组分脱盐并加载到终极3000纳米HPLC系统（戴安C18，PepMap 100，3μm）上并且使用ProBot（LC填料）机械点渍（robotic spotter）用10%-40% 梯度的乙腈（0.1%甲酸）分离。在4800MALDI TOF/TOF分析仪上分析产生的 斑点。

B0.3.数据分析

使用ProteinPilot^TM2.0.1软件（应用生物系统公司）进行数据分析。使用 PSPEP算法计算错误发现率，该PSPEP算法与ProteinPilot^TM2.0.1一起使用，并 且只接受总体错误发现率（FDR）<5%的来自来健康受试者的蛋白质。

C.使用多重反应检测（MRM）确认生物标记候选物

多重反应检测（MRM）是一种基于质谱法的方法，用来特异性地靶向针对 特征肽的转换（前体-片段离子对），这种肽代表整个生物标记候选蛋白的替代物。 对于每个候选物，使用对这种蛋白质是唯一的（当与SwissProt人类数据库57.1 版本相比较时）一个或两个肽。这种高通量方法被用来确认来自在大量的单独 的患者血浆样品中的发现阶段的生物标记（见以上B部分）。

C1.样品制备

制备与先前iTRAQ实验相同的汇集的样品以及与先前iTRAQ池（确认样 品）不同的单独的样品（每组N=10）。使用MARS14HPLC免疫耗竭样品中的 14种最丰富的蛋白质。用10kDa截留自旋过滤器缓冲交换免疫耗竭的样品。将 蛋白质样品还原、烷基化、胰蛋白酶消化并且脱盐。另外，用¹⁸O标记一种血浆 参照样品（健康个体的集合）并且最后在LC-MRM/MS分析之前掺入每个同期 组群样品中（1:1）。

C.2.将生物标记列表翻译为MRM转换列表

通过一系列的步骤产生预备MRM转换列表，这些步骤包括下载蛋白序列、 结合过滤器在电脑中消化蛋白质（例如，7-21个氨基酸，漏切率0），以及选择 每个肽的最少4个转变（通常前体带电z2，产物带电z1）。关于来自文献和资料 档案库（PeptideAtlas，MRMaid）的蛋白质特异性肽（proteotypic peptide）的有 用信息同样被结合，并且转换的选择由波谱库（ISB、NIST、GPM、BiblioSpec） 支持。一种被称为Skyline的开源软件（MacCoss研究室，华盛顿大学，西雅图， 华盛顿，美国）被用来产生并改进MRM转换以及用于分析MRM转换数据。

将1μg的血浆消化物的等分部分直接加载到纳米柱上（戴安C18，PepMap 100，3μm），并且用100分钟梯度的2%-30%的乙腈（0.1%甲酸）将肽洗脱到装 备有一个纳升电喷雾电离源的4000Qtrap中。每次运行最多需要200次MRM， 停留时间20毫秒，一个循环5秒。分析这些运行（即删除没有合理的转换的肽）， 并且使改进的这些肽和转换的列表经受MRM触发的MS/MS实验，以便确认肽 分配。由于低丰度蛋白的肽分配是一个没有标准的相当挑战性的工作，产物离 子扫描（EPI）设置不同，例如，扫描速率（1000-4000），LIT填充时间（20-300 毫秒）。选择每个肽中两个最强烈的转换用于确认，并且当一个转换超过阈值 1000cps时被发送，用于MS/MS（质量范围200-1200）。每次运行使用总共40次 MRM，停留时间20毫秒，并且一个循环约7秒。使用MASCOT针对具有人类 分类学过滤器（human taxonomy filter）的当前SwissProt数据库来搜索获得的 MS/MS。鉴定的肽与MRM数据相匹配（肽序列、保留时间）。最后，测试这些 确认的肽与MRM¹⁸O标记方法一起使用的适合性。每个同期组群研究的最终转 换列表由每种候选蛋白质（参见表1）的1-2个肽（参见表3）以及每个肽3个 转换组成。如果可能，排除对候选蛋白非独特性的肽序列以及具有氨基酸M、 W、N末端Q或E等的肽。

表3

C.3.仪器分析

复原所有的样品并且在LC-MRM/MS分析之前以1:1掺入¹⁸O标记的参考 血浆（健康个体的集合），以便校正这些轮之间的喷雾效率和电离差异。每个样 品一式两份地直接注射到纳米柱上（戴安C18，PepMap100，3μm），并且用100 分钟梯度的2%-30%的乙腈（0.1%甲酸）将肽洗脱到装备有纳升电喷雾电离源的 4000Qtrap中。针对所有的数据采集使用预定的MRM选项，具有4秒的目标扫 描时间（跨过一个峰至少8个数据点）和6-8分钟的MRM检测窗口，最少产 生50-60毫秒的停留时间。

C.4.数据分析

整合所有的转换，并且针对每个肽（加权的）计算未标记的肽的区域与标 记的肽的区域的比率。基于蛋白质的不变组，针对基于群体的差异，将比率归 一化。最后，将针对非参数数据的曼-怀二氏（Mann-Whitney）检验应用于该归 一化的比率，并且计算p值，该p值定义了在两个受试者组（例如健康组与患 病组）之间的显著差异性表达的蛋白质。

针对一些列的标记（单变量的和多变量的），还绘制了敏感性、或真阳性率 与假阳性率（相对操作特征曲线）。使用多个统计转换来提高效能，包括自然对 数（ln）、倒数（inv）和平方根（√）。

2.结果

D.生物标记

D1.用于糖尿病患者中的糖尿病肾病的生物标记

图1中的表显示了来自巴瑟尔顿和弗里曼特尔糖尿病研究两者中关于在所有患 有糖尿病的受试者中糖尿病肾病的存在的生物标记蛋白数据。解决的问题是‘用 于糖尿病患者中的糖尿病肾病的生物标记是什么？’

图1中的表格的结果作为盒须图展示在图2（研究FDS1）、图3（研究FDS2） 以及图4（研究BDS）中。对于每个生物标记候选物，通过MRM测量了每种蛋 白质的一个到两个特征肽。（左盒形图：糖尿病组；右盒形图：具有严重肾病的 糖尿病组；X轴：蛋白质/肽；y轴：相对丰度比）。

表4-表8中的ROC数据进一步展示了生物标记可以被用作糖尿病肾病的诊 断。

表4单变量分析

表5多变量分析（模型3）

表6多变量分析（模型FDS1）

表7多变量分析（模型FDS2）

表8多变量分析（模型BDS）

D2.患有肾病的糖尿病患者与健康患者的生物标记

图5中的表格描述了发现的患有糖尿病肾病的患者与没有糖尿病的健康对照组 的生物标记。这些数据源于巴瑟尔顿研究。

将显而易见的是，在不背离本发明的精神和范围下，可以提供各种变更和 等同形式。这包括在所附权利要求书的范围之内的修改连同所有修改、可替代 构建物和等同物。

在本说明书中，特定特征的存在并不排除另外的特征的存在。术语“包括” （comprising）、“包含”（including）以及“具有”（having）应当被解释为包含在 内而不是一种排除意义。

序列表