法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2016-09-28
授权
授权
2014-02-12
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K39/395 申请日:20111010
实质审查的生效
2014-01-08
公开
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优先权要求
本申请要求2010年10月8日提交的美国临时申请流水号61/391,558的权 益，其通过提述完整并入本文。
发明背景
癌症通过主动抑制免疫系统来避开免疫监视。一种预想用于抵消此免疫 抑制的方法是经由利用由肿瘤细胞独特地表达或过表达的抗原表位的疫苗 接种。例如，已经在临床中成功执行阻断信号传导途径、扣留生长因子和/ 或诱导免疫应答的单克隆抗体（单抗）以治疗癌症和其它疾病。由于单抗的 有利特性和临床成功，其已经是并且继续是强烈蛋白质工程化努力的主题。 这些努力已经得到实现改善的靶向的双特异性单抗；实现较好的肿瘤穿透和 血液清除的单链Fab可变片段(scFv)、双抗体和微型抗体(minibody)；和改变 免疫刺激或改善药动学/药效学特性的经修饰的Fc（经由突变或糖基化得到）。 类似地，单抗已经再工程化改造为允许位点特异性缀合小分子以实现改善的 投递（例如ThioMAB）或不可逆地结合其抗原（例如无限的亲和力单抗）。 单抗还已经开发为改善生物活性肽和其它生物制剂的循环和呈现（例如 CovXbody）。亦已经开发出与亲合素融合的单抗或scFv或异多聚体scFv以进 行预靶向疗法及改善肿瘤成像的检测限。
尽管单抗可以是有效的且相对于小分子办法具有一些优点，但是诸如由 于脱靶相互作用导致的不良副作用或由于缀合有放射性核素的单抗的长循 环时间导致的伴随损伤等限制指示仍有相当大的空间来改善其效力，包括改 善的靶向和协同。因此，增强抗体和小分子治疗效力在癌症和其它疾病的治 疗中会是有用的且期望的。
发明概述
显示了抗体结合肽C-QFDLSTRRLK-C(cQFD;SEQ ID NO:1)和 C-QYNLSSRALK-C(cQYN;SEQ ID NO:2)具有新的单抗结合特性。具体地， 显示了cQFD和cQYN（其亦称作“中间位(meditope)”）结合抗EGFR单抗西 妥昔单抗(cetuximab)的Fab框架区，而不与结合抗原的互补决定区(CDR)结 合。Fab框架上的该结合区与其它框架结合抗原如超抗原葡萄球菌蛋白A (SpA)(Graille等，2000)和大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)蛋白L (PpL)(Graille等，2001)截然不同，并且先前是未知的。因而，第一个实施方 案是一种框架结合界面，其包含独特的鼠-人抗体或其功能性片段的框架区， 所述框架区结合具有序列CQFDLSTRRLKC(SEQ ID NO:1)或 CQYNLSSRALKC(SEQ ID NO:2)的环状中间位。
通过表面等离振子共振对中间位的表征指示，cQFD和cQYN分别以约 0.70-0.95和2-5μM的解离常数结合Fab。设计为破坏特异性相互作用的点突变 进一步支持该结构模型。FACS分析揭示高浓度的cQFD中间位(60μM)在西妥 昔单抗结合MDA-MB-468细胞（其过表达EGFR受体）的能力中产生可忽略 的差异。如此，中间位结合不影响抗原结合。另外，将中间位与荧光基团缀 合，并且显示了其结合用西妥昔单抗预处理的MDA-MB-468细胞，但是不结 合用鼠抗EGFR抗体M425预处理的MDA-MB-468细胞（图29）。这些数据共 同限定Fab框架内的中间位结合界面，并且证明中间位结合不抑制抗原结合 （例如不起变构调节物的作用）。
在另一个实施方案中，可以使用具有上文所描述的新颖结合特性的中间 位（例如cQYN或cQFD）或其变体来向治疗性单克隆抗体（“单抗”）添加功 能性。在又一个实施方案中，可以利用本文中描述的中间位来影响治疗性物 质如单克隆抗体及其功能性片段或其它物质如小分子的效力。在又一个实施 方案中，为了诊断或治疗用途可以将标签或可检测标记物附接于中间位以鉴 定某些细胞或组织类型。
在一个分开的实施方案中，中间位含有半胱氨酸，其共价结合Fab中在 中间位结合位点处的半胱氨酸。将中间位与任何物质、分子或化合物（其可 以是治疗性分子如小分子诊断分子，如标志物）缀合。“Cys中间位”将缀合 物引导至IgG，并且经由共价连接结合。
附图简述
图1显示了结合西妥昔单抗框架环的中间位肽。图1A：西妥昔单抗Fab （轻链以VL和CL表示，重链以VH和CH表示）和环状CQFDLSTRRLKC（在阴 影区内描绘，并用词语“中间位”标记）(SEQ ID NO:1)的复合物指示中间 位结合Fab框架的界面，其与西妥昔单抗的CDR环截然不同。图1B显示了 cQFD中间位的棍表示，而图1C显示了cQYN中间位的棍表示。N和C端半胱 氨酸是溶剂暴露的，并且展现出高的热因数(thermal factor)。
图2显示了西妥昔单抗Fab结合界面的某些实施方案。西妥昔单抗是一种 鼠嵌合物，并且因此具有鼠Ig可变域和人Ig恒定域的混合物。图2A显示了与 中间位接触的噬菌体“负”选择、ch14.18、以及人源化曲妥珠单抗(trastuzumab) 的对应残基。图2B顶部小图显示了cQFD中间位中占据由西妥昔单抗的鼠序 列编码的独特袋（前景）的Arg9的立体视图。叠加曲妥珠单抗Fab（1N8Z.pdb； 背景）(Cho等，2003)。存在有从Asp85至中间位Arg9的胍盐基团和Leu10的 主链酰胺的盐桥。图2B底部小图图示了Fab片段的叠合，指示由于中间位中 的F至Y所导致的细微效应。具体地，疏水性基团F/Y3 L5和L10是几乎相同 定位的，但是cQYN中间位中Y5的羟基基团阻止R8与Q111主链相互作用，如 在cQFD中间位中观察到的（“空间相撞”）。此重排也导致β-转角的主链残基 的伴随变化（“主链旋转”）。
图3是两幅线图，其显示了cQFD和cQYN与Fab片段的表面等离振子共振 (SPR)迹线。将用于结晶学研究的西妥昔单抗Fab以低密度与CM5芯片偶联。 显示了递增浓度的cQFD（图3A）和cQYN（图3B）中间位的迹线。使用简 单指数将一系列迹线拟合至单一结合位点模型（例如信号=A*exp[kon*时 间]）。拟合的残差各自在下方显示。
图4显示了如先前假设的，本中间位不结合CDR。图4A表明晶体结 构，其中中间位结合西妥昔单抗Fab的中间“洞”。抗原EGFR域III在离中间 位结合位点相当大距离处在互补决定区结合。图4B显示了左手侧的凝胶结果 和右手侧的相关大小排阻层析结果。个别组分Fab、EGFR域III、和SMT-cQFD 中间位、以及所有3种的混合物的大小排阻实验指示异三聚体复合物和共洗 脱物的形成。非还原性SDS-PAGE凝胶显示了首先洗脱的级分，其指示从混 合物观察到的新峰（最左边的峰代表“复合物”，以浅灰色加阴影）内存在 所有3种组分。图4C显示了FACS分析的结果，指示中间位仅在存在西妥昔单 抗（箭头）的情况下结合EGFR阳性MD-MBA-468细胞。单独的中间位或在 存在M425（一种鼠EGFR抗体）情况下的中间位不结合。图4D和4E显示了使 用与西妥昔单抗scFv偶联的传感器芯片的表面等离振子共振实验的结果。该 实验指示在高达100μM浓度的cQFD中间位不能实现scFv的饱和。使用偶联有 西妥昔单抗Fab的传感器芯片的相同实验指示完全饱和。来自此实验的解离 常数是660nM。对照SPR实验显示了西妥昔单抗scFv容易地结合可溶性EGFR 域III片段，指示CDR环是功能性的。
图5是与细胞计数相比荧光强度的图，并且显示了经荧光标记的西妥昔 单抗在存在cQFD的情况下结合MDA-MB468细胞。西妥昔单抗在没有肽的情 况中、及在存在6μM和60μM肽以及同种型对照的情况下结合MDA-MB468 细胞。
图6显示了中间位和EGFR如何结合不同位点。顶部图像显示了 cQFD-Fab复合物和EGFR-Fab复合物(1YY8)的立体叠加。顶部图像显示了重 链的残基39-46是柔性的，并且容纳该中间位。
图7显示了Fab框架结合剂。与中间位、蛋白A、和蛋白L结合的Fab的叠 加指示每种结合Fab上的独特位点。
图8显示了一种用于增强肿瘤疗法的作用机制。肿瘤细胞上过表达的抗 原（例如ErbB受体家族）结合二价抗体（左侧小图），并且阻断受体信号传 导、改变胞吞和受体再循环和/或引发免疫应答。多价中间位的添加拴系/交 联治疗性单抗，并且可以增强其治疗潜力（右侧）。右侧小图描绘了从三价 中间位预期的雏菊状链连接。
图9显示了scFv-中间位接头。通过经由12-20个氨基酸的接头（典型为 {GGGS}3-5）将轻链可变域与重链可变域融合（或反之亦然）来创建scFv。
图10是显示中间位选择性结合鼠西妥昔单抗的凝胶。将生物素化的 cQFD肽添加到偶联有亲合素的珠，彻底清洗，并在PBS中平衡。然后，将西 妥昔单抗添加至珠（第1道），清洗（第2道-第4道），然后洗脱（第5道）。上 部条带是IgG重链，而底部条带是IgG轻链。
图11是空间遮蔽(steric mask)的绘图。中间位可以经由含有肿瘤关联蛋白 酶位点的柔性接头与Fab轻链或重链的N端融合。如显示的，分子内相互作用 会在空间上堵塞抗原结合位点。
图12显示了西妥昔单抗上亲合素-肽遮蔽的解离速率测定。左侧小图显 示了使用固定化的西妥昔单抗IgG通过SPR测量生物素化的cQFD中间位的结 合动力学。表面等离振子共振迹线上面的框示小图绘出了将单价中间位通过 二价IgG的草图。如右侧小图显示的，将亲合素用生物素化的中间位饱和， 并通过相同的固定化西妥昔单抗IgG。多价中间位的解离速率降低至少36倍。 （注意到两个实验间的时间比例尺是不同的）。SPR迹线上面的框示小图绘出 了四价中间位和二价IgG之间的“二价-二价相互作用”。
图13显示了依照一些实施方案的二聚体和三聚体中间位的合成。
图14例示了经异硫氰酸荧光素(FITC)标记的中间位二聚体7的表征。左 侧小图显示了最终二价中间位的HPLC迹线，而右侧小图显示了其质谱。
图15显示了依照一些实施方案的中间位-Fc拴系剂的核酸序列(SEQ ID NO:3)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
图16显示了二价中间位的结构。将中间位与肽接头的N端直接融合，所 述肽接头与IgG的Fc区直接融合。Fc是天然同二聚体的。如此，中间位-Fc构 建体是二价的。
图17显示了来自例示性FACS分析的结果。将过表达EGFR受体的 MDA-MB-468细胞用10nM西妥昔单抗预处理30分钟，漂洗，然后用4种浓度 的中间位-Fc构建体或单体中间位处理。底部迹线为阴性对照（无抗体）。接 着的4条迹线显示了单体中间位以浓度依赖性方式结合用西妥昔单抗预处理 的细胞。顶部4条迹线也显示了二价中间位Fc以浓度依赖性方式，但是以更 高的亲和力（例如向右移位）结合用西妥昔单抗预处理的细胞。这是预测到 的并且与多价相互作用一致。
图18是一种包含螺旋卷曲的备选接头，其可以依照某些实施方案使用。
图19：通过NMR筛选片段。在添加西妥昔单抗之前（红色迹线）和之后 （蓝色迹线）的片段集合的代表性NMR谱。使用此方法，已经鉴定出先导化 合物，并且使用衍射研究来测定结合位点。
图20显示了使用定向随机文库(directed random library)来改变和/或增强 单抗对中间位位点处结合的化合物或中间位的结合亲和力的步骤。具体地， 可以使用FAC分选（其中中间位和抗原用不同的生色团标记）选择基因文库， 其中作为中间位结合位点衬里的单抗残基的密码子用NNK（其中N是任意核 苷酸，而K是胸腺嘧啶或鸟苷）替换。GPI接头确保选出的单抗保持与编码 该基因序列的细胞结合。对编码来自所选细胞的轻链和重链的基因测序会鉴 定出高亲和力单抗。可以重复该方法来选择较高亲和力的中间位或中间位类 似物。
图21显示了序列差异的3D表面图像。顶部小图中的黑灰色区标示西妥昔 单抗和完全人曲妥珠单抗框架之间的氨基酸差异。方框内部的残基已经突变 到曲妥珠单抗框架上。已经鉴定出曲妥珠单抗的CDR环（黑色区；底部小图）， 并嫁接到西妥昔单抗框架上。
图22显示了中间位使能性曲妥珠单抗结合中间位-Fc。在顶部图中，在 曲妥珠单抗（一种结合肿瘤抗原Her2的完全人单抗）上创建中间位结合位点。 FACS分析显示了中间位使能性曲妥珠单抗结合过表达Her2的SKBR3细胞 （顶部两条迹线）。在底部图中，中间位-Fc结合中间位使能性曲妥珠单抗（顶 部两条迹线，向右移位的峰），但是不结合野生型曲妥珠单抗（从底部起第 二个）或阴性对照（底部迹线）。
图23A显示了中间位使能性曲妥珠单抗重链序列的核酸(SEQ ID NO:5) 序列。信号肽序列加以灰色阴影。图23B显示了与野生型(SEQ ID NO:7)相比， 中间位使能性曲妥珠单抗重链序列的氨基酸(SEQ ID NO:6)序列。差异以灰 色突出显示。在图23B中显示的氨基酸后，与重链的人序列没有剩余的差异。 图23C显示了中间位使能性曲妥珠单抗轻链序列的核酸(SEQ ID NO:8)序列。 信号肽序列加以灰色阴影。图23D显示了与野生型(SEQ ID NO:10)相比，中 间位使能性曲妥珠单抗轻链序列的氨基酸(SEQ ID NO:9)序列。差异以灰色 突出显示。
图24显示了西妥昔单抗框架上嫁接的Her2 CDR环结合中间位-Fc。在图 24A中，将曲妥珠单抗的Her2 CDR环嫁接到西妥昔单抗(其结合中间位)上。 FACS分析显示嫁接有Her2-CDR的中间位使能性单抗结合过表达Her2的 SKBR3细胞（不同浓度的顶部3条迹线）。图24B显示了中间位-Fc结合嫁接有 Her2-CDR的中间位使能性单抗（顶部3条迹线：以浓度依赖性方式向右移位 的峰），但是不结合野生型曲妥珠单抗（从底部起第二条）或阴性对照（底 部迹线）。
图25A显示了具有限制性位点和分泌序列的、嫁接有Her2 CDR的中间位 结合单抗重链的重链核酸(SEQ ID NO:11)和氨基酸(SEQ ID NO:12)序列。图 25B显示了具有限制性位点和分泌序列的、嫁接有Her2CDR的中间位结合单 抗的轻链核酸(SEQ ID NO:13)和氨基酸(SEQ ID NO:14)序列。加下划线且有 阴影的区域标示为实现中间位结合所采用的变化。可以以类似的方式嫁接增 强或改变中间位特异性的别的变化。
图26显示了IgG和IgE Fab域的序列和结构比对的例子，其指示IgE上靠近 中间位结合位点的残基。
图27是显示表面等离振子共振(SPR)研究的图。在不同的pH测定不同中 间位（cQFD、cQYN、和cQYD）对西妥昔单抗的结合亲和力。
图28显示了MTT测定法的结果，其将二价中间位-Fc的功效与单体中间 位的功效比较。图28A显示了仅中间位-Fc而非单体中间位在与西妥昔单抗组 合时可以抑制细胞生长。图28B显示了中间位-Fc增强西妥昔单抗的细胞杀伤 能力。
图29显示了中间位结合独特的西妥昔单抗框架，但不结合人框架或其它 鼠-嵌合物框架。将野生型中间位与CM5芯片缀合以用于表面等离振子共振 研究，并在浓度0.01、0.05、0.1、0.5和1uM测试西妥昔单抗（中间位结合Fab）、 曲妥珠单抗（完全人框架）、和利妥昔单抗(rituximab）（鼠-人嵌合框架）。仅 西妥昔单抗结合缀合有中间位的芯片。将曲妥珠单抗（1N8Z;Cho等2003） 和利妥昔单抗（2OSL;Du等2007）Fab的分子结构叠加到中间位结合的西妥 昔单抗Fab结构进一步突出该框架的独特性。此外，此结构比较给出哪些源 自西妥昔单抗Fab的残基促进中间位结合以及如何可以将它们嫁接到其它 Fab框架区上的清楚指示。
发明详述
本文中提供了将治疗剂或成像剂选择性投递至靶组织的抗体投递系统 及其使用方法。所述抗体投递系统可以包含与抗体结合分子（或“中间位”） 结合以形成抗体-中间位复合物的抗体框架结合界面（“框架结合界面”或“结 合界面”）。抗体-中间位复合物可以进一步与一种或多种别的抗体-中间位复 合物、治疗剂、成像剂或其组合缀合以在下文进一步描述的方法中使用。
依照一些实施方案，能结合中间位的抗体框架结合界面是由抗体或其功 能性片段的框架区而非互补决定区(CDR)形成的。如本文中使用的，“抗体或 其功能性片段”指特异性结合特定抗原或表位、或与特定抗原或表位免疫反 应性的免疫球蛋白分子，并且包含多克隆和单克隆抗体。术语“抗体”包含 免疫球蛋白的遗传工程化的或以其它方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体 (peptibody)、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体、中间位使能性(enabled) 抗体和异缀合物抗体（例如双特异性抗体、双抗体、三抗体、四抗体、串联 二-scFv、串联三-scFv）。术语“功能性抗体片段”包含抗体的抗原结合片段， 其包括但不限于，片段抗原结合(Fab)片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fv片段、 重组IgG(rIgG)片段、单链可变片段(scFv)和单域抗体（例如sdAb、sdFv、纳 米抗体(nanobody)）片段。
依照一些实施方案，可以利用或优化所述结合界面以增强抗体或其功能 性片段的结合和成像。在一个单独的实施方案中，中间位可以含有半胱氨酸 残基，其结合Fab中在中间位结合位点处的工程化半胱氨酸（例如ThioMAB）。 由此，将所述中间位与任何诊断性和/或治疗性物质、分子或化合物缀合。例 如，所述物质可以是小分子诊断性分子，如标志物。“Cys中间位”将缀合物 引导至IgG，并且经由共价连接结合。或者，所述中间位可以与Fab与掺入中 间位结合位点中的一个或多个非天然氨基酸缀合。可以与非天然氨基酸产生 的连接的例子包括(i)稳定的腙和肟连接，其通过掺入对乙酰基苯丙氨酸、间 乙酰基苯丙氨酸、对(3-氧丁酰基(oxobutaboyl))-1-苯丙氨酸、和对(2-氨基-3- 羟乙基)苯丙氨酸实现，(ii)硫醇反应性，其通过掺入苯基硒基(selenidyl)丙氨 酸实现，(iii)含有二苯甲酮的UV交联剂，其通过掺入对苯甲酰-l-苯丙氨酸实 现，(iv)胺反应性，其通过掺入对异丙基硫代羰基-苯丙氨酸或对乙基硫代羰 基-苯丙氨酸来实现，(v)叠氮化物炔Huisgen环加成，其通过掺入对炔丙基氧 苯丙氨酸或对叠氮基苯丙氨酸(p-azidophenylalanine)或本领域中已知的任何 其它合适的非天然氨基酸来实现。在一个实施方案中，所述中间位可以将反 应性基团引导至掺入Fab中的非天然氨基酸，如对乙酰基苯丙氨酸。
另外，可以将中间位框架结合界面嫁接到其它单抗上以生成中间位使能 性单抗。由于中间位结合位点可以嫁接到其它单抗上，结合界面代表一种广 泛有用的平台技术，其可以不仅与用于EGFR靶向性状况的西妥昔单抗一起 使用，而且与任何单克隆抗体一起使用。术语“中间位使能性”抗体、单克 隆抗体或治疗性抗体指任何能够在其框架结合界面结合中间位的抗体，包括 西妥昔单抗。如此，可以将该平台扩展用于可以使用治疗性抗体治疗或靶向 的任何癌症、疾病或其它状况的治疗、诊断或成像，所述癌症、疾病或其它 状况包括但不限于白血病和淋巴瘤（其可以使用例如阿仑单抗 (alemtuzumab)、bectumumab、吉姆单抗(gemtuzumab)、FBTA05、ibritumomab tiuzetan、奥法木单抗(ofatumumab)、利妥昔单抗、托西莫单抗(tositumomab) 治疗或成像）、乳腺癌（其可以使用例如曲妥珠单抗、阿德木单抗 (adecatumumab)、etrumaxomab治疗或成像）、前列腺癌（其可以使用例如阿 德木单抗、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、伊瑞西珠单抗(etaracizumab) 治疗或成像）、结肠直肠癌（其可以使用例如拉贝珠单抗(labetuzumab)、帕木 单抗(panitumumab)、altumumab pentetate、伏妥莫单抗(votumumab)治疗或成 像）、胃肠癌（其可以使用例如arcitumumab、卡妥索单抗(catumaxomab)治疗 或成像）、卵巢癌（其可以使用例如阿巴伏单抗(abagovomab)、卡妥索单抗、 伊瑞西珠单抗、伊戈伏单抗(igovomab)、奥戈伏单抗(oregovomab)治疗或成 像）、肺癌（其可以使用例如anatumumab mafenatox治疗或成像）、胰腺癌（其 可以使用例如clivatuzumab tetraxetan治疗或成像）、肾癌（其可以使用例如吉 利妥昔单抗(girentuximab)治疗或成像）、黑素瘤癌（其可以使用伊瑞西珠单 抗、易普利单抗(ipilimumab)、TRBS07治疗或成像）、神经胶质瘤（其可以使 用例如nimotuzumab治疗或成像）、骨转移（其可以使用例如地诺单抗 (denosumab)治疗或成像）、头和颈癌（其可以使用例如zalutumumab治疗或成 像）、心血管疾病（其可以使用例如阿昔单抗(abciximab)治疗或成像）、自身 免疫性病症（其可以使用例如阿达木单抗(adalimumab)、英夫利昔单抗 (infliximab)治疗或成像）、类风湿性关节炎（其可以使用例如atlizumab、戈利 木单抗(golimumab)、英夫利昔单抗治疗或成像）、移植物排斥（其可以使用 例如巴利昔单抗(basiliximab)、达克珠单抗(daclizumab)、莫罗单抗 (muromonab)-CD3治疗或成像）、克罗恩(Crohn)氏病（其可以使用例如赛妥 珠单抗(certolizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、 英夫利昔单抗、维西珠单抗(visilizumab)治疗或成像）、血红蛋白尿 (hemoglobinuria)（其可以使用依库利珠单抗(eculizumab)治疗或成像）、银屑 病（其可以使用例如依法利珠单抗(efalizumab)、英夫利昔单抗、ustekinumab 治疗或成像）、多发性硬化（其可以使用例如那他珠单抗、ustekinumab治疗 或成像）、哮喘（其可以使用例如贝纳利珠单抗(benralizumab)、美泊利单抗 (mepolizumab)、奥玛珠单抗(omalizumab)治疗或成像）、呼吸道合胞病毒 (respiratory syncytial virus)（RSV）（其可以使用例如帕利珠单抗(palivizumab) 治疗或成像）、黄斑变性（其可以使用例如兰尼单抗(ranibizumab)治疗或成 像）、阑尾炎（其可以使用例如法索单抗(fanolesomab)治疗或成像）以及任何 其它可以用抗体靶向或治疗的状况。上文所列的抗体和相关疾病或病症仅是 例子，而不限制该平台。
在一个实施方案中，环状抗体结合肽C-QFDLSTRRLK-C(cQFD;SEQ ID NO:1)和C-QYNLSSRALK-C(cQYN;SEQ ID NO:2)能经由非共价结合相互 作用结合抗体框架结合界面。结合相互作用的此非共价性质开启了用于修饰 框架结合界面、所述肽、或两者的新的备选方法，这扩展了生成高度特异性 中间位变体的可能性。在一个实施方案中，cQFD和cQYN肽结合西妥昔单抗 Fab区的框架区，而不结合CDR区，如下文描述的衍射和生物物理学数据显 示的。此结合位点与其它框架结合抗原如超抗原葡萄球菌蛋白A(SpA)和大 消化链球菌蛋白L(PpL)的结合位点不同（图7）。另外，蛋白A和蛋白L会结 合患者中存在的IgG。由此，该相互作用是特异性的。
X-射线结晶学分析已经揭示了，所述肽以约700nM的结合常数在Fab空 穴（如以重链和轻链限定的（见图1和4A））内结合。可以利用此相互作用来 改善裸单抗的治疗效力、增强成像剂或治疗剂的靶向投递、及改进基于单抗 的成像方法，等等。
cQFD和cQYN中间位结合嵌合框架结合区，如西妥昔单抗中找到的。如 本文中使用的，术语“中间位”（meditope，组合medius+topos的术语，拉 丁语代表中间，而希腊语代表位置）指在抗体的Fab轻链和重链之间结合的 抗体结合肽，如cQFD和cQYN肽或其变体。其它分子也可以在抗体的Fab轻 链和重链之间以与中间位的框架结合功能性类似的框架结合功能性结合。这 类分子可以包括但不限于小分子、适体、核酸分子、肽体和任何其它能够与 中间位结合相同结合界面的物质。本文中描述的框架结合界面与结合抗原表 位的CDR是不同的且与其远离（图4）。另外，生物化学测定法和基于细胞的 测定法已经证明了cQFD和cQYN环肽能结合预结合EGFR的鼠嵌合西妥昔单 抗（图4）。
西妥昔单抗是一种独特的鼠-人嵌合物，并且cQFD和cQYN中间位与西 妥昔单抗Fab之间的数种相互作用对此鼠-人嵌合IgG框架残基是特异性的， 如通过本文中描述的原子模型确定的。此外，中间位不能结合人IgG框架（例 如曲妥珠单抗），指示此相互作用对此鼠嵌合抗体是特异性的，但是对其它 鼠嵌合物如利妥昔单抗不是特异性的（图29）。这支持西妥昔单抗框架是高 度特异性的。将多种人和鼠Fab叠加至西妥昔单抗-环肽结构上指示，此肽和 鼠-人嵌合Fab之间的关键相互作用在仅人的和仅小鼠的IgG结构两者中是缺 乏的。环肽内关键残基的点突变降低其对Fab的结合亲和力，进一步确认高 特异性和结构模型（数据未显示）。如此，该相互作用对于此特定的鼠-人嵌 合物Fab的中央空穴和所选中间位似乎是特异性的。相比之下，PpL和SpA不 是鼠特异性的。PpL结合约66%鼠的和约50%人的IgGκ轻链，而SpA结合12% 鼠的和50%人的可变重链（Graille等，2002）。
西妥昔单抗目前用于治疗表达EGFR的转移性结肠直肠癌以及头和颈 癌。西妥昔单抗识别构象性表位（例如折叠的EGFR域III）。识别小分子抗原、 肽和蛋白质表位的抗体的比较显示，界面倾向于拥有不同特征（Collis等， 2003）。小分子倾向于在小袋中紧抱；肽适合线性沟；而蛋白质接触较大表 面。如此，如同西妥昔单抗-EGFR一样，成功再创建蛋白质-抗体相互作用的 肽一般是那些具有如下的蛋白质抗原的，所述蛋白质抗原有具有较大接触表 面积的未折叠域。例如，曲妥珠单抗识别蛋白质抗原（构象性表位），但是 主要与许多几何学约束性环接触（Du等，2007;Cho等，2003）。这类生物学 识别与肽模拟物更相容。
cQFD和cQYN中间位最初鉴定为结合西妥昔单抗的CDR区的候选肽。已 经使用噬菌体展示库来鉴定结合确立的治疗性抗体的互补决定区(CDR)的 肽，假设该肽会模拟抗原性表位以人工刺激对该抗原的免疫应答（Riemer等， 2004;Riemer等，2005;Li等，2006）。这些肽模拟物（也称为模拟表位或抗 独特型）可以是化学合成的，从而消除潜在的生物学污染并降低成本。然而， 基于此设计的疫苗导致部分的应答，并且经常继之以在没有丧失对肿瘤抗原 的免疫应答的情况中疾病的晚期复发（Sharav等，2007）。
由于cQFD和cQYN中间位结合框架而不结合CDR区，所述中间位不太可 能是用作疫苗的特异性西妥昔单抗样抗体免疫原的候选物。尽管Reimer等观 察到从用偶联有KLH的中间位免疫的小鼠收集的血清生成结合A431细胞并 阻断其增殖的抗体（Riemer等，2005），但是本文中描述的研究显示了与佐 剂偶联的中间位的多个拷贝使疫苗成为鼠IgG的混杂交联剂（类似于超抗 原）。支持此实施方案，使用BLAST在小鼠轻链以及小鼠和人重链两者中观 察到类似的种系或B细胞衍生的框架序列。如此，当与佐剂拴系在一起时， 中间位肽可以发挥功能以激活具有保守框架区的B细胞群体，并且与疫苗需 要的特异性免疫应答形成对比产生一般化的免疫应答。报告的ELISA竞争测 定法未指示EGFR的特异性结合位点，也未指示多克隆血清对EGFR上西妥昔 单抗表位的特异性的程度（例如报告未指示血清衍生的IgG是否可以通过未 标记的西妥昔单抗阻断）。衍射和生化研究不支持使用cQYN或cQFD中间位 作为人用疫苗。
可以依照本文中描述的实施方案使用的其它中间位包括结合西妥昔单 抗或任何其它治疗性抗体的抗体框架结合界面（即Fab轻链和重链之间）的 任何小肽。例如，在环肽cQFD和cQYN外，一些实施方案包括cQFD和cQYN 的一种或多种变体。
可以与化学合成串联使用结构和生物物理方法或修饰来开发与未修饰 的中间位cQFD和cQYN相比对西妥昔单抗具有升高或改变的亲和力（例如由 于pH的变化所致，如下文实施例中讨论的）的中间位变体。此外，将未修饰 的中间位或变体中间位缀合到多价拴系实体或支架上可以显著改善多价中 间位对结合肿瘤关联抗原的中间位使能性单抗的总体亲和力和靶向。可以用 于生成具有高亲和力的中间位变体的对cQFD和cQYN中间位的修饰可以包 括本领域中已知的任何用于修饰肽的方法。每个氨基酸位置可以用非天然氨 基酸改变或与片段化学缀合。
在某些实施方案中，可以将一种或多种中间位、中间位变体、多价中间 位拴系剂或多价中间位变体拴系剂与一种或多种成像剂、治疗有效量的治疗 有效药剂或化合物或两者缀合，使得中间位或其变体与一种或多种中间位使 能性抗体及治疗有效化合物的结合可以治疗、预防、诊断或监测疾病或状况。 与中间位使能性单抗偶联的高亲和力和/或多价中间位的这类缀合提供了高 度通用的平台技术，其会显著改善治疗和检测疾病的基于单抗的治疗学和成 像方法（见图8）。
在一些实施方案中，可以使用鼠特异性cQFD和cQYN中间位或其衍生物 来将两个或更多个抗体或其功能性片段拴系在一起。当在下文描述的拴系方 法中使用时，所述中间位可以是多价拴系剂（也称为“中间位支架”或“支 架”）的部分以增强癌症或肿瘤疗法和成像。
多价拴系剂可以包含两个或更多个cQFD和cQYN中间位或任何其它新 的中间位变体，其经由长接头和生物素与链霉亲合素偶联以创建多价中间位 拴系实体。在一个实施方案中，多价中间位拴系实体是四价中间位拴系剂。 四聚体拴系实体通过表面等离振子共振显示为与单价肽相比具有增强的对 IgG的结合，这与多价相互作用是一致的。根据FACS分析，四价中间位还增 强EGFR阳性细胞中西妥昔单抗的结合亲和力。
可以使用多价中间位支架来支撑或“雏菊状链接”与肿瘤关联抗原结合 的中间位使能性单抗以增强配体拮抗性，改变受体胞吞，和/或改善经由 ADCC/CDC的免疫应答（图8）。单克隆抗体（单抗）编码与二聚体Fc偶联的 两个Fab域。因此，这些二价IgG优先结合以高密度表达抗原的细胞。已经证 明了结合同一抗原上的独特表位的第二单抗能使受体聚簇，并且更有效地杀 死肿瘤细胞。此聚簇可以经由使用多价中间位重演。多价中间位的使用避免 了鉴定第二单抗的必要性及其开发的关联的且相当大的成本。
当与一种或多种中间位使能性单克隆抗体组合施用时，可以使用中间 位、中间位变体、多价中间位拴系剂和多价中间位变体拴系剂的特异性和结 合来投递治疗剂、诊断剂（例如成像剂）或其组合以对疾病或状况治疗、诊 断或成像。如此，可以通过在施用中间位、中间位变体、多价中间位拴系剂 或多价中间位变体拴系剂前施用中间位使能性单克隆抗体使用多价中间位 进行预靶向疗法和成像，如下文进一步描述的。此外，如已经针对工程化scFv 或化学缀合的单抗证明的，使用多价中间位可以增强选择性，并且改进肿瘤 检测，而且避免了这些非人构建体中固有的潜在免疫原性。
在一些实施方案中，可以将与中间位使能性抗体组合施用的中间位、抗 体-中间位复合物、与中间位使能性抗体组合施用的多价拴系剂、或其组合 与一种或多种成像剂缀合。在一个方面，成像剂可以包括但不限于荧光、发 光或磁性蛋白质、肽、或其衍生物（例如遗传工程化变体）。可以通过mRNA 组分表达的荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型GFP(EGFP)、红色、 蓝色、黄色、青色和宝石蓝色荧光蛋白，以及珊瑚礁荧光蛋白。可以通过 mRNA组分表达的发光蛋白包括萤光素酶、水母发光蛋白(aequorin)及其衍生 物。众多荧光和发光染料及蛋白质是本领域中已知的（参见例如美国专利申 请公开文本2004/0067503;Valeur,B.,“Molecular Fluorescence:Principles and Applications,”John Wiley and Sons,2002;Handbook of Fluorescent Probes and Research Products,Molecular Probes,第9增补版,2002;和The Handbook--A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,Invitrogen，第10版，在 Invitrogen网站可获得；两篇都在此通过提述收录，如同本文中完整列出的）。
在其它方面，可以将与中间位使能性抗体组合施用的中间位、抗体-中 间位复合物、与中间位使能性抗体组合施用的多价拴系剂、或其组合与非蛋 白质成像剂或投递媒介物如纳米颗粒、放射性物质（例如放射性同位素、放 射性核素、放射性标记物或放射性示踪剂）、染料、造影剂、荧光化合物或 分子、生物发光化合物或分子、酶和增强剂（例如顺磁性离子）进一步缀合 或以其它方式结合。另外，应当注意的是，一些纳米颗粒例如量子点和金属 纳米颗粒（在下文描述）也可以适合作为成像剂或治疗剂使用（例如使用高 温和光动力学疗法以及通过荧光和或MRI反差的成像剂）。
可以依照本公开内容的实施方案作为别的成像剂使用的荧光和发光物 质包括但不限于通常称为“染料”、“标记物”或“指示剂”的多种有机或无 机小分子。例子包括荧光素、罗丹明、吖啶染料、Alexa染料、和花青染料。
可以依照本公开内容的实施方案作为别的成像剂使用的酶包括但不限 于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷 酶、β-葡糖醛酸糖苷酶(glucoronidase，glucuronidase)或β-内酰胺酶。可以将 这类酶与色原、荧光生成化合物或发光化合物组合使用以产生可检测的信 号。
可以依照本公开内容的实施方案作为别的成像剂使用的放射性物质包 括但不限于18F,32P,33P,45Ti,47Sc,52Fe,59Fe,62Cu,64Cu,67Cu,67Ga,68Ga,77As, 86Y,90Y.89Sr,89Zr,94Tc,94Tc,99mTc,99Mo,105Pd,105Rh,111Ag,111In,123I,124I,125I, 131I,142Pr,143Pr,149Pm,153Sm,154-1581Gd,161Tb,166Dy,166Ho,169Er,175Lu,177Lu, 186Re,188Re,189Re,194Ir,198Au,199Au,211At,211Pb,212Bi,212Pb,213Bi,223Ra和 225Ac。依照本公开内容的实施方案可以作为别的其它成像剂使用的顺磁性离 子包括但不限于过渡和镧系金属（例如具有原子序数为21-29,42,43,44或 57-71的金属）的离子。这些金属包括Cr,V,Mn,Fe,Co,Ni,Cu,La,Ce,Pr,Nd, Pm,Sm,Eu,Gd,Tb,Dy,Ho,Er,Tm,Yb和Lu的离子。
当成像剂是放射性金属或顺磁性离子时，可以使该试剂与另一种长尾试 剂起反应，所述长尾试剂具有长尾部，其中一种或多种螯合基团附接于该长 尾部以结合这些离子。所述长尾部可以是聚合物如聚赖氨酸、多糖或其它衍 生化的或可衍生的链，该链具有可以为了结合金属或离子而添加的悬垂基 团。可以依照本公开内容使用的螯合基团的例子包括但不限于乙二胺四乙酸 (EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、DOTA、NOTA、NETA、卟啉、多胺、 冠醚、双-硫代缩氨基脲(bis-thiosemicarbazones)、多肟(polyoxime)、以及类 似基团。螯合物通常通过如下的基团与PSMA抗体或功能性抗体片段连接， 该基团在最小的免疫反应性损失和最少的聚集和/或内部交联的情况中与分 子实现键形成。在与非放射性金属（如锰、铁和钆）复合时，相同的螯合物 在与本文中描述的抗体和载体一起使用时可用于MRI。大环螯合物如NOTA、 DOTA和TETA分别与多种金属和射电金属，包括但不限于镓、钇和铜的放射 性核素一起使用。可以使用其它环型螯合物如大环聚醚，其对于稳定结合核 素，如223Ra（对于RAIT）是感兴趣的。在某些实施方案中，可以使用螯合 模块将PET成像剂如Al-18F复合物附接于靶向分子以在PET分析中使用。
在一些实施方案中，可以将中间位、抗体-中间位复合物、多价拴系剂、 或其组合与一种或多种治疗剂缀合。
如本文中使用的，“治疗剂”是可用于治疗本文中描述的癌症或其它状 况的原子、分子或化合物。可以与抗体-中间位复合物、多价拴系剂、多价 拴系剂或其组合缀合的治疗剂的例子包括但不限于药物、化疗剂、治疗性抗 体和抗体片段、毒素、放射性同位素、酶（例如在肿瘤部位将前药切割为细 胞毒剂的酶）、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、RNAi分子（例 如siRNA或shRNA）、螯合剂、硼化合物、光活剂和染料。治疗剂还可以包括 与螯合剂结合的金属、金属合金、金属间化合物或核壳(core-shell)纳米颗粒， 其起辐射敏化剂作用以使靶向的细胞与健康细胞相比对放射疗法更敏感。此 外，治疗剂可以包含用于MRI造影剂的顺磁性纳米颗粒（例如磁铁矿或 Fe3O4），并且可以与其它类型的疗法（例如光动力学疗法和高温疗法）和成 像（例如荧光成像（Au和CdSe））一起使用。
化疗剂在性质上经常是细胞毒性的或细胞抑制性的，并且可以包括烷化 剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制物激素 疗法、靶向疗法和免疫治疗剂。在一些实施方案中，可以依照本公开内容的 实施方案作为治疗剂使用的化疗剂包括但不限于13-顺-视黄酸(Retinoic Acid)、2-氯脱氧腺苷(2-Chlorodeoxyadenosine)、5-阿扎胞苷(5-Azacitidine)、 5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)、6-巯基嘌呤(6-Mercaptopurine)、6-硫鸟嘌呤 (6-Thioguanine)、放线菌素D、阿霉素(adriamycin)、阿地白介素(aldesleukin)、 阿仑单抗、阿利维A酸(alitretinoin)、全反式视黄酸(all-transretinoic acid)、α 干扰素、六甲蜜胺(altretamine)、甲氨蝶呤(amethopterin)、氨磷汀(amifostine)、 阿那格雷(anagrelide)、阿那曲唑(anastrozole)、阿糖胞苷(arabinosylcytosine)、 三氧化二砷(arsenic trioxide)、安吖啶(amsacrine)、氨基喜树碱(amino camptothecin)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、门冬酰胺酶(asparaginase)、氮 杂胞苷(azacytidine)、卡介苗(bacillus calmette-guerin,BCG)、苯达莫司汀 (bendamustine)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝沙罗汀(bexarotene)、比卡鲁胺 (bicalutamide)、硼替佐米(bortezomib)、博来霉素(bleomycin)、白消安 (busulfan)、甲酰四氢叶酸钙(calcium leucovorin)、嗜橙菌因子(citrovorum factor)、卡培他滨(capecitabine)、卡奈替尼(canertinib)、卡铂(carboplatin)、卡 莫司汀(carmustine)、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、 克拉屈滨(cladribine)、可的松(cortisone)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖 胞苷(cytarabine)、阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa)、达沙替尼(dasatinib)、道诺 霉素(daunomycin)、地西他滨(decitabine)、地尼白介素-毒素连接物(denileukin diftitox)、地塞米松(dexamethasone)、地塞米松磷酸钠(dexasone)、右雷佐生 (dexrazoxane)、更生霉素(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、氨烯咪胺 (decarbazine)、多西他赛(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、去氧氟尿苷 (doxifluridine)、恩尿嘧啶(eniluracil)、表柔比星(epirubicin)、阿法依伯汀 (epoetin alfa)、厄洛替尼(erlotinib)、依维莫司(everolimus)、依西美坦 (exemestane)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷(etoposide)、非格司亭 (filgrastim)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、氟维司群(fulvestrant)、flavopiridol、 氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟他胺 (flutamide)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)、吉姆单抗奥佐米星 (ozogamicin)、戈舍瑞林(goserelin)、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞 集落刺激因子、六甲蜜胺(hexamethylmelamine)、氢化可的松(hydrocortisone) 羟基脲(hydroxyurea)、替伊莫单抗、干扰素α、白介素-2、白介素-11、异维A 酸(isotretinoin)、伊沙匹隆(ixabepilone)、伊达比星(idarubicin)、甲磺酸伊马替 尼(imatinib mesylate)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)、拉帕 替尼(lapatinib)、来那度胺(lenalidomide)、来曲唑(letrozole)、亚叶酸钙 (leucovorin)、亮丙瑞林(leuprolide)、脂质体Ara-C、洛莫司汀(lomustine)、双 氯乙基甲胺(mechlorethamine)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑(melphalan)、巯 基嘌呤(mercaptopurine)、美司钠(mesna)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲泼尼龙 (methylprednisolone)、丝裂霉素C(mitomycin C)、米托坦(mitotane)、米托蒽 醌(mitoxantrone)、奈拉滨(nelarabine)、尼鲁米特(nilutamide)、奥曲肽 (octreotide)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、帕西他赛 (paclitaxel)、氨羟二磷酸二钠(pamidronate)、培美曲塞(pemetrexed)、帕木单 抗、PEG干扰素、培门冬酶(pegaspargase)、PEG非格司亭(pegfilgrastim)、 PEG-L-门冬酰胺酶、喷司他丁(pentostatin)、普卡霉素(plicamycin)、泼尼松 龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、丙卡巴肼(procarbazine)、雷洛昔芬 (raloxifene)、利妥昔单抗、罗米司亭(romiplostim)、雷替曲塞(ralitrexed， raltitrexed)、sapacitabine、沙格司亭(sargramostim)、沙铂(satraplatin)、索拉 非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、司莫司汀(semustine)、链佐星 (streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替加氟(tegafur)、替加氟-尿嘧啶、替西 罗莫司(temsirolimus)、替莫唑胺(temozolamide)、替尼泊苷(teniposide)、沙利 度胺(thalidomide)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、托泊替康 (topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫单抗、曲妥珠单抗、维A酸 (tretinoin)、三甲曲沙(trimitrexate,trimetrexate)、alrubicin、长春新碱 (vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindestine)、长春瑞滨 (vinorelbine)、伏立诺他(vorinostat)、或唑来膦酸(zoledronic acid)。
可以依照本公开内容的实施方案用作治疗剂的治疗性抗体和其功能性 片段包括但不限于阿仑单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、依决洛单抗 (edrecolomab)、吉姆单抗、ibritumomab tiuxetan、帕木单抗、利妥昔单抗、 托西莫单抗和曲妥珠单抗以及其它与本文中列出的具体疾病有关的抗体。
可以依照本公开内容的实施方案用作治疗剂的毒素包括但不限于蓖麻 毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶（RNA酶）、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素 -A、美洲商陆(pokeweed)抗病毒蛋白、白树毒素(gelonin)、白喉毒素、假单 胞菌(Pseudomonas)外毒素、和假单胞菌内毒素。
可以依照本公开内容的实施方案用作治疗剂的放射性同位素包括但不 限于，32P,89Sr,90Y,99mTc,99Mo,131I,153Sm,177Lu,186Re,213Bi,223Ra和225Ac。
中间位-单抗技术允许一种可以用于生成抗体-中间位复合物的系统，该 抗体-中间位复合物可以与一种或多种中间位使能性抗体、治疗剂、成像剂 或其组合进一步缀合。如此，一组中间位或高亲和力中间位变体(每个与独 特的细胞毒剂或成像剂缀合)会允许共施用期望的中间位缀合物和中间位使 能性单抗进行治疗。所述中间位缀合物是目前的抗体-药物缀合物（其具有 缺点如由于化学修饰或有效载荷的释放而导致的降低的特异性）的改善。
此平台技术对单抗投递领域具有广泛的影响，并且提供了对于提示西妥 昔单抗的EGFR阳性癌症，包括结肠直肠癌和鳞状细胞癌、头和颈癌的治疗 和诊断有用的方法。另外，将框架结合界面嫁接到其它治疗性抗体上允许该 平台技术在如上文描述的数种其它癌症、疾病和其它状况的治疗和诊断的方 法中利用。
本文中提供了用于增强治疗性抗体或其功能性片段的结合亲和力的方 法。这类方法可以包括经由任何合适的施用路径对受试者施用治疗有效量的 药物组合物。所述药物组合物可以包含与中间位使能性抗体组合的中间位或 中间位变体、与中间位使能性抗体组合的多价中间位或中间位变体拴系实 体、中间位使能性治疗性抗体或其功能性片段组合、药学可接受载体、或其 任意组合。多价中间位的增强的结合亲和力可以归因于与细胞表面结合的 IgG的多价交联。交联IgG（经由亲本鼠425抗体或使用抗IgG IgM）显著影响 信号传导、受体胞吞作用和再循环、以及细胞死亡。由此，多价肽可以与治 疗性单克隆抗体协同起作用以增强其治疗效力。
在一些实施方案中，中间位（单独的或作为拴系实体的一部分）可以含 有半胱氨酸或其它合适的烷化剂，其在结合位点处结合Fab半胱氨酸，如此 创建半胱氨酸-半胱氨酸相互作用。或者，中间位可以在非天然氨基酸（例 如对乙酰基苯丙氨酸）处结合Fab。将Cys中间位与任何物质缀合，并且其将 缀合物引导至IgG。
抗体-中间位复合物也可以在对可以通过治疗性抗体靶向的疾病或状况 中的特定类型的细胞或细胞群体的定向处理的方法中使用。这类治疗方法可 以包括经由任何合适的施用路径对具有所述疾病或状况的受试者施用治疗 有效量的药物组合物。药物组合物可以包含与中间位使能性抗体组合的中间 位或中间位变体、与中间位使能性抗体组合的多价中间位或中间位变体拴系 实体、中间位使能性治疗性抗体或其功能性片段。
在其它实施方案中，提供了用于对肿瘤或其它组织成像的方法。在这类 方法中，可以施用未修饰的治疗性抗体以靶向过表达相应抗原的肿瘤或其它 组织。随后，经由任何合适的施用路径施用用成像剂标记的多价中间位拴系 实体，并且其会结合与靶肿瘤或组织结合的治疗性抗体。见图8。成像剂的 例子包括但不限于放射性标记物（例如3H,14C,35S,90Y,99mTc,125I,131I,177Lu, 166Ho和153Sm）、金属或磁性标记物（例如金、铁、钆）、生物素、螯合剂（例 如1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸（“DOTA”））或上文描述的 任何试剂。在一个实施方案中，与本文中描述的方法一起使用的成像剂是 DOTA。
上文所描述的成像或治疗方法相对于已知方法有几个优点。首先，治疗 性单克隆抗体IgG的二价特征增强对肿瘤的选择性。如下文进一步论述的， 此增强的选择性在使用scFv和其它微型抗体的情况中丧失，并且不能经由增 强的亲和力弥补。其次，经标记的多价中间位拴系实体的质量会低于肾过滤 阈值（小于60kD，可以低至约10kD），从而允许其容易地滤出体外。相比之 下，通常避免用成像剂或其它治疗剂直接标记治疗性抗体IgG，因为它会在 身体中循环延长的时段。如此，经常使用不太有选择性的scFv来实现肿瘤或 其它患病器官的成像。
在别的实施方案中，可以使用cQFD和cQYN中间位或其变体来将两个或 更多个治疗性分子连接起来以形成药用化合物，所述药用化合物可以作为药 物组合物的部分以治疗有效量对受试者施用以治疗癌症、自身免疫性疾病或 其它状况。所述两种或更多种治疗性分子可以包括但不限于能靶向肿瘤或疾 病特异性受体的功能性抗体片段（例如F(ab’)2或Fab片段）、肽或其它小分子， 如上文所描述的那些。治疗性分子可以是两个或更多个同一种治疗性分子， 或者备选地，可以是靶向同一肿瘤或患病组织的两个或更多个不同分子。
在一些实施方案中，药用化合物可以包括使用专有的抗体或其部分如 CovX-BodyTM。例如，中间位可以用作接头来将两个或更多个治疗性分子连 接至特殊设计的CovX抗体的结合界面或结合位点。与起CovX特异性接头作 用的中间位结合的小分子、肽或scFv以其框架结合界面识别，所述框架结合 界面是CovX抗体的活性结合位点。当将这些组分组合时，所得的二价 CovX-BodyTM拥有小分子、肽或scFv的生物学作用，同时还保留抗体的延长 的半衰期。
在上文就治疗性单克隆抗体而言描述的益处外，可以合成作为接头使用 以拴系或结合治疗性分子的中间位，并且其比单克隆抗体更具生产成本有效 性。例如，尽管众多临床前/临床试验正调查两种单克隆抗体的共施用，但是 生产和销售这类治疗剂的成本可能是高得惊人的。
西妥昔单抗Fab的scFv（单链Fab可变片段）形式以比Fab自身实质性更 低的亲和力结合EGFR域III，这与临床感兴趣的其它scFv类似。这至少部分 归因于缺乏直接影响Fv域的取向、构象波动的Fab恒定域，并且可能归因于 较差的接头设计。
因此，在一些实施方案中，提供了用于改善scFv的稳定性和亲和力的方 法。所述方法包括在scFv接头中掺入肽中间位以使scFv稳定化。这会帮助加 强可变域的正确取向，及如此增强亲和力（图9）。
可以将上文所描述的实施方案应用于人抗体或人源化抗体（例如曲妥珠 单抗），其通过将一个或多个人框架残基用其相应的鼠残基替换（即生成一 处或多处点突变）进行。用相应的鼠残基替换的人残基存在于人框架的中央 Fab空穴内，并且因此未暴露于免疫系统（例如它们不应当是抗原性的）。另 外，可以进一步使用抗原性预测算法来指示具有所述点突变的人序列不应当 是抗原性的。
在一些实施方案中，用相应的鼠残基替换的一个或多个人框架残基可以 选自：轻链框架残基10,39-43,83,85,100和104（Kabat编号）和/或重链框架 残基编号40,89和111（Kabat编号）（见图2）。在一个实施方案中，用相应的 鼠残基替换的一个或多个人框架残基是轻链框架残基，包括但不限于40,41, 83和85。具体地，在一个实施方案中，轻链框架Pro40用Thr(P40T)或Ser(P40S) 替换，轻链框架Gly41用Asn(G41N)替换，轻链框架残基Phe83用Ile(F83I)或 Val(F83V)替换，且轻链框架残基Thr85用Asp(T85D)或Asn(T85N)替换。可 以利用人单克隆抗体内此Fab空穴的此中间位-位点嫁接（或“鼠源化”或“小 鼠化”）来创建用于中间位结合并与先前公开的技术一起使用的独特把手 (handle)。另外，可以通过生成药效团结合模型来工程化改造别的点突变以 进一步增强中间位的亲和力。
本文中描述的实施方案鉴定并表征Fab框架内的一种新颖的界面，并且 证明了它没有扰乱Fab对抗原的结合或起EGFR结合的变构拮抗物作用。另 外，两种肽中间位不结合西妥昔单抗CDR，并且如此不模拟抗原(EGFR)。
“治疗有效量”、“治疗有效浓度”或“治疗有效剂量”是在受试者中产 生期望的治疗效果，如预防或治疗目标状况、减轻与该状况有关的症状、产 生期望的生理学效果、或允许导致疾病或状况治疗的状况成像或诊断的化合 物量。精确的治疗有效量是就给定受试者中的治疗效力而言会产生最有效结 果的组合物量。此量会随多种因素而变化，所述因素包括但不限于治疗性化 合物的特征（包括活性、药动学、药效学和生物利用度）、受试者的生理学 状况（包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定剂量的响 应性、和药物类型）、配制物中一种或多种药学可接受载体的性质、和施用 路径。临床和药理学领域的技术人员会能够经由常规实验，即通过监测受试 者对化合物施用的响应并相应地调节剂量来确定治疗有效量。关于更多指 导，参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy第21版,Univ.of Sciences in Philadelphia(USIP),Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia, PA,2005。
“药学可接受载体”指牵涉将感兴趣的化合物从一种组织、器官或身体 部位携带或运输到另一种组织、器官或身体部位的药学可接受材料、组合物 或媒介物。例如，所述载体可以是液体或固体充填剂、稀释剂、赋形剂、溶 剂、或包囊材料、或其某种组合。载体的每种组分必须是“药学可接受的”， 这在于它必须与配制物的其它成分相容。它还必须适合于与其可能遇到的任 何组织、器官、或身体部位接触，这意味着它必须没有携带毒性、刺激、变 应性应答、免疫原性或任何其它过度超出其治疗益处的并发症的风险。
“施用路径”可以指本领域中已知的任何施用途径，包括但不限于气雾 剂、肠、鼻、眼、口、胃肠外、直肠、经皮、或阴道。“经皮”施用可以使 用表面乳膏或软膏剂，或依靠经皮贴片来实现。“胃肠外”指一般与注射有 关的施用路径，包括眶下、输注、动脉内、囊内、心脏内、皮内、肌肉内、 腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、 皮下、经粘膜或经气管。
如本文中使用的，“组合”或“与…组合”意味着在受试者中治疗同一 疾病或状况的过程中以任意次序使用两种或更多种药剂、药物、治疗方案、 治疗形态或其组合（例如与中间位或多价拴系剂组合的抗体）。这包括同时 施用（或“共施用”）、在施用第二药剂之前或之后施用第一药剂、以及以相 隔长达几天的时间间隔次序。这类组合治疗还可以包括任何一种或多种药 剂、药物、治疗方案或治疗形态的超过单次施用。此外，可以通过相同或不 同施用路径来施用两种或更多种药剂、药物、治疗方案、治疗形态或其组合。
“治疗性抗体”可以指用于治疗癌症、自身免疫性疾病、移植物排斥、 心血管疾病或其它疾病或状况(如本文中描述的那些疾病或状况)的任何抗体 或其功能性片段。可以依照本文中描述的实施方案使用的治疗性抗体的例子 包括但不限于鼠抗体、鼠源化或人源化嵌合抗体或人抗体，包括但不限于 Erbitux（西妥昔单抗）、ReoPro（阿昔单抗）、Simulect（巴利昔单抗）、Remicade （英夫利昔单抗）；Orthoclone OKT3（莫罗单抗-CD3）；Rituxan（利妥昔单 抗）、Bexxar（托西莫单抗）、Humira（阿达木单抗）、Campath（阿仑单抗）、 Simulect（巴利昔单抗）、Avastin（贝伐单抗）、Cimzia（certolizumab pegol）、 Zenapax（达克珠单抗）、Soliris（依库利珠单抗）、Raptiva（依法利珠单抗）、 Mylotarg（吉姆单抗）、Zevalin（ibritumomab tiuxetan）、Tysabri（那他珠单 抗）、Xolair（奥玛珠单抗）、Synagis（帕利珠单抗）、Vectibix（帕木单抗）、 Lucentis（兰尼单抗）、和Herceptin（曲妥珠单抗）。
“治疗”或“处理”状况可以指预防状况、延缓状况的发作或形成速率、 降低形成状况的风险、预防或延迟与状况有关的症状的进展、减少或终止与 状况有关的症状、对状况产生完全或部分消退、或其某种组合。
在一个实施方案中，本文中提供了筛选具有与中间位的框架结合功能性 类似的框架结合功能性的新颖的小分子和中间位的方法。这类方法可以包括 但不限于下列步骤：使假定的小分子或中间位的文库与中间位使能性抗体接 触；确定假定的小分子或中间位是否在框架结合界面结合中间位使能性抗 体；鉴定一种或多种具有与中间位的框架结合功能性类似的框架结合功能性 的候选小分子或中间位；测定一种或多种候选物的结合亲和力；并当结合解 离常数是至少0.70μM时将一种或多种候选物鉴定为具有与中间位的框架结 合功能性类似的框架结合功能性的小分子或中间位。另外，还提供了筛选新 颖的框架结合界面的方法，并在下文实施例中进一步描述。
已经参照实施方案和例示性实施例描述了本发明，本领域技术人员可以 领会对如描述和例示的本发明的修改，其不背离如本说明书中公开的本发明 的精神和范围。列出实施例以帮助理解本发明，但是并不意图且不应当理解 为以任何方式限制其范围。实施例不包括常规方法的详细描述。这类方法是 本领域普通技术人员公知的且记载于众多出版物中。此外，上文和下文实施 例中引用的所有参考文献在此通过提述完整收录，就像在本文中完整列出一 样。
实施例
实施例1：晶体结构的测定
材料和方法
试剂。如下获得西妥昔单抗的抗原结合片段[F(ab)’]（或“Fab”），即用固 定化的木瓜蛋白酶(Pierce)消化IgG，接着是用蛋白A的反向纯化和在Superdex 75柱(GE Healthcare)上的大小排阻层析(SEC)。合成西妥昔单抗的单链结合片 段(scFvC225)，在轻链和重链之间具有20个氨基酸的接头。将scFvC225和可 溶性表皮生长因子受体域III(sEGFRdIII)在Sf9细胞中表达，并纯化，如先前 描述的（Donaldson等，2009）。
如先前描述的那样（Riemer等2005）从噬菌体展示分离的中间位 CQFDLSTRRLKC(cQFD;SEQ ID NO:1)和CQYNLSSRALKC(cQYN;SEQ ID NO:2)在希望之城合成和聚合物化学核心设施(City of Hope Synthetic and Polymer Chemistry Core Facility)合成、氧化并纯化。
结晶和衍射数据。将西妥昔单抗的Fab片段(5mg/mL)与各种中间位以 1:10摩尔比混合，并使用Qiagen JCSG核心套件(IIV)于20℃筛选。在100mM 磷酸钠/柠檬酸钠，pH4.5，2.5M磷酸钠/钾和1.6%w/v中赤藓糖醇中培养衍射 超出的共晶体。将晶体芯吸通过14%w/v中赤藓糖醇，并在液氮中迅速 冻结。在希望之城的X射线设施实施结晶试验和初始筛选研究。在斯坦福同 步加速器放射实验室(Stanford Synchrotron Radiation Lab)，射束线(beam line) 9.1和11.1收集衍射数据。在西妥昔单抗的无配体结构（pdb:1YY8–链A和B） （Li等，2005）情况下使用程序Phaser（McCoy等，2007）通过分子替换测 定初始相。以Matthews系数3.26和溶剂含量62.4%将两个Fab置于不对称单元 中。Z得分（均值上的解法标准差）是27和25（对于旋转搜索）以及38和71 （对于平移搜索）。不能放置第三个Fab片段（不对称晶胞中的三个Fab在43% 溶剂时产生2.18的合理Matthews系数）。使用Coot（Emsley等，2004）和Phenix （Adams等，2002）经由多个迭代将中间位手动建立密度。
结晶和结构测定
为了鉴定西妥昔单抗上中间位的结合位点，生成并纯化Fab片段，将其 与cQFD中间位以1:10比率混合，并使用商业工厂来筛选晶体形成。于20℃ 在1至3天后形成晶体。对这些晶体的初始衍射分析指示晶胞与已经保藏在蛋 白质数据库(Protein Data Bank)(1YY8.pdb)（Li等，2005）中的西妥昔单抗Fab 类似，并且晶体包装（例如排除CDR）提示肽不存在于CDR环。不过，通过 分子替换解出结构，并检查实验图谱以鉴定与中间位一致的未建模的电子密 度。初始Fo-Fc图谱清楚地指示在Fab片段中间的区域为潜在的结合位点（图 1）。在仅使用Fab模型的一轮初始精化后，观察到与中间位一致的未建模密 度的连续区段。将中间位建立密度，并且R和RFree相应地下降。在使用Phenix （Adams等，2002）精化期间添加水分子。在下文表3中给出了衍射数据和 精化统计学。
共晶体结构的实验性和精化统计学
*括号中的数值针对I/σ(F)>0的最高分辨率壳
#对于cQFD或cQYN共晶体分别为F/σ(F)>1.99和>1.36
基于这些观察结果且作为比较点，生成与通过噬菌体展示鉴定的第二个 中间位cQYN结合的西妥昔单抗Fab的晶体。如前文，在Fab中心观察到清楚 的未建模电子密度。使用第一种结构，相应地对序列差异建模，并实施多轮 精化。在图1B和C中显示了两种中间位的代表性电子密度图谱。
实施例2：中间位对于西妥昔单抗Fab的鼠框架区是特异性的
材料和方法
在上文实施例1中描述的那些材料和方法外，还使用以下材料和方法。
中间位和点突变。如上文所描述的，在希望之城合成和聚合物核心设施 合成、氧化并纯化CQFDLSTRRLKC (cQFD; SEQ ID NO:1)和 CQYNLSSRALKC (cQYN; SEQ ID NO:2)。在残基3（Phe3至Ala）、5（Leu5 至Ala）、8（Arg8至Ala）和10（Leu10至Ala）处产生cQFD中间位中的丙氨 酸点突变，并且通过在SMT3的C端编码肽以细菌生成（Mossessova等，2000）。 在表面等离振子共振(SPR)分析前，向样品添加泛素样蛋白酶(Ulp1)以释放所 述肽。
中间位-Fab界面的表征。如先前描述的（Donaldson等，2009; Li等，2005）， 通过SPR实施亲和力分析。简言之，使用胺化学将scFvC225或FabC225固定 化于CM5芯片上。于20℃通过平衡方法评估肽或sEGFRdIII亲和力，并拟合 于等式RU={R最大值*[L]}/{[L]*Kd}+R偏移。使用Superdex 200 10/30柱(GE Healthcare)实施SEC。将蛋白质混合，于室温温育20分钟，并于4℃应用于柱。
使用MDA-MB-468细胞系来测试在存在肽中间位情况下的西妥昔单抗 结合。在有或无60μM cQFD肽的情况下，于4℃添加经标记的西妥昔单抗 （AF488, Invitrogen）达20分钟。使用经标记的MOPS-21作为同位素对照。 使用FACS Calibur仪（BD Biosciences）测定细胞荧光。
对中间位/Fab界面的分析
在本文中鉴定的中间位和Fab之间的结合位点界面是由IgG的所有4个域 （例如重链和轻链的可变域和恒定域）形成的。使用PISA服务器，在cQFD 或cQYN中间位-Fab界面掩埋的表面积分别为904（±28）和787（±42） 并且在轻链和重链之间相等分布。图2和4显示了来自Fab的接触中间位 的残基和环。
两种中间位都与西妥昔单抗Fab产生多个氢键和疏水性接触。图2A显示 了西妥昔单抗Fab（鼠嵌合物IgG）、在噬菌体展示实验中用作同种型对照的 人源化单克隆IgG(ch14.18)和人源化曲妥珠单抗Fab的中心空穴结合界面的 残基间的细微差异。人源化曲妥珠单抗Fab在西妥昔单抗Fab上的叠加指示， cQFD中间位的Arg9结合由鼠可变轻链创建的独特空穴。具体地，小鼠可变 轻链的Asp85、Ile83和Thr40就结合cQFD中间位的Arg9残基而言是重要的（图 2B）。鼠框架中的Asp85与cQFD中间位的Arg9的胍基形成盐桥和Asp85的羧基还与cQFD中间位的Leu10的主 链酰胺形成氢键来自轻链的Thr40的羟基也与中间位 Arg9的胍基形成氢键人Fab中Phe83中的苯基环和 Pro40的吡咯烷环在空间上阻塞Arg9的侧链。
尽管针对鼠和人Fab序列之间的差异选择cQFD中间位图谱中Arg9侧链， 但是还注意到cQYN中间位在与cQFD中间位中Arg9相同的位置处编码丙氨 酸，并且如此能潜在地结合人Fab。为了辨别尽管用hu14.18抗体预处理噬菌 体库，为何仍选出cQYN中间位，测定cQFD和cQYN中间位及其与西妥昔单 抗Fab的相互作用之间的差异。来自cQFD和cQYN结构的重链和轻链Fab的Cα 原子的叠加显示，来自每种中间位的残基Phe/Tyr3、Leu5和Leu10的疏水性侧 链几乎相同定位（图2B）。然而，cQFD和cQYN肽的主链迹线显著偏离。具 体地，cQFD中间位的Arg8侧链结构是延伸的，并且与Fab重链的Gln111主链 羰基形成强主链氢键然而，cQYN肽中的Tyr3的羟基 基团在空间上干扰Arg8侧链（图2B），并且阻断cQYN中间位的Arg8和重链 Asn111之间的相互作用。与此观察一致，cQYN复合物中的两条Arg8侧链在 电子密度图谱中是较差限定的，并且采取至少两种不同旋转异构体。（在不 对称单元中有两个Fab-中间位复合物）。伴随此变化，观察到主链氢键模式 的移位。cQFD中间位中的Thr7的酰胺羰基与西妥昔单抗Fab轻链中的酰胺 Asn41形成氢键此氢键在cQYN肽中Asn41主链的酰胺 中移位至Arg8主链的羰基
cQFD和cQYN之间的差异（例如丧失R8和重链Fab之间的盐桥）以及 cQFD中的Arg9结合的Fab轻链的序列差异（例如丧失任一种中间位的Asp85 和Leu10酰胺之间的氢键）共同指示，选出以结合鼠嵌合物的中间位与人Fab 框架具有实质上较弱的相互作用，并且在选择过程中在清洗中除去。
中间位不在Fab中诱导较大的构象变化
基于中间位-Fab界面的位置，测定中间位是否扰乱IgG域与未连接的和/ 或连接的结构的相对取向。首先，比较这两种中间位复合体的不对称晶胞内 的轻链和重链，然后将每条链与未连接的和EGFR连接的结构比较。结合任 一中间位的轻链可变域与西妥昔单抗的无配体结构是基本上相同的（r.m.s.d. 平均值：cQFD,cQYN,）。然而，重链的可变域 显示了显著更高的趋异（r.m.s.d.平均值：cQFD,cQYN,注意到此趋异主要源自框架环2的位置（残基39-46），因为将此环 中的所述残基删除并重新计算r.m.s.d.产生低得多的数值（cQFD,cQYN,（图6）。另外，此环在Fab C225-EGFR共晶体结构中 也是替换的，并且其相对B-因子值提示它是柔性的（图6）。最后，相对于EGFR 结合的或未结合的结构，中间位的存在没有导致对CDR结构的显著改变。尽 管与结合任一中间位的Fab结构相比，EGFR加配体的结构的重链CDR环3中 的Tyr101的主链是翻转的，但是在无配体的西妥昔单抗Fab结构中也观察到 此翻转（Li等，2005）。
中间位残基对界面的贡献
基于cQFD中间位-Fab复合体的结构，以及cQYN与cQFD的序列相似性， 产生cQFD中间位中的数处点突变（Phe3→Ala,Leu5→Ala,Arg8→Ala和 Leu10→Ala）以表征这些残基对于中间位的总体结合亲和力的作用。为了评 估结合亲和力，使用标准胺化学将Fab片段与CM5芯片偶联。接着，测量合 成的cQFD和cQYN中间位对西妥昔单抗Fab的亲和力。cQFD中间位以950± 30nM的亲和力结合Fab，而cQYN中间位以3.5±0.1μM（n=3）的亲和力结 合。还测量结合动力学（图3）。以双分子相互作用建模的结合常数对于cQFD 和cQYN分别为4.2(±0.1)x104M-1s-1和1.8(±0.1)x104M-1s-1。解离常数对于 cQFD和cQYN分别为2.5(±0.1)x10-2s-1和8.6(±0.1)x10-2s-1。基于这些测量 的KD值（对于cQFD为430(±30)nM，对于cQYN为3.5(±0.1)μM）与平衡测 量紧密一致。
接着，测量每种突变的cQFD中间位的亲和力。以与SMT3的C端融合物 生成点突变和野生型cQFD中间位，并将其在分析前用Ulp1切割。生物学生 成的野生型cQFD中间位以770 nM的亲和力结合，这类似于合成生成的 cQFD，而突变Phe3→Ala,Leu5→Ala和Arg8→Ala显著降低对Fab的亲和力 （表4，下文）。具体地，Arg8→Ala突变导致结合亲和力损失140倍。
cQFD模拟表位突变体的解离常数
最后，将曲妥珠单抗（一种人源化治疗性单克隆抗体）的Fab与CM5芯 片偶联以表征cQFD和cQYN中间位对人框架的亲和力。平衡测量揭示任一种 中间位的解离常数超过150μM。
实施例3：西妥昔单抗Fab同时结合中间位和EGFR
材料和方法
在上文实施例1和2中描述的那些材料和方法外，还使用了以下材料和方 法。
试剂。用轻链和重链之间的20个氨基酸的接头合成西妥昔单抗的单链结 合片段(scFvC225)。将scFvC225和可溶性表皮生长因子受体域III(sEGFRdIII) 在Sf9细胞中表达，并纯化，如先前描述的（Donaldson等，2009）。
中间位和点突变。如上文所描述的，在希望之城合成和聚合物核心设施 合成、氧化并纯化CQFDLSTRRLKC(cQFD;SEQ ID NO:1)和 CQYNLSSRALKC(cQYN;SEQ ID NO:2)。在残基3（Phe3至Ala）、5（Leu5 至Ala）、8（Arg8至Ala）和10（Leu10至Ala）处生成cQFD中间位中的丙氨 酸点突变，并且通过在SMT3的C端编码肽以细菌生成（Mossessova等，2000）。 在表面等离振子共振(SPR)分析前，向样品添加泛素样蛋白酶(Ulp1)以释放所 述肽。
EGFR和中间位对Fab的同时结合
衍射数据与如下假设矛盾，即这些肽作为疫苗是有效的。具体地，原子 模型显示中间位并不直接结合CDR，因此并不模拟抗原表位。然而，从用 cQYN中间位接种的小鼠收集的血清阻断细胞增殖（Riemer等，2005）。因此， 为了测试中间位是否阻塞抗原结合，将西妥昔单抗Fab与EGFR-域III和cQFD 一起温育，并施加到分析性SEC柱上。观察到在13.9mL处的峰，并且该峰的 非还原性SDS-PAGE显示了所有3种组分的存在（图4B）。个别组分在15.2mL (Fab C225)、15.6mL(sEGFRdIII)和16.3mL(SMT-CQFDLSTRRLKC;SEQ ID NO:1)处洗脱。
另外，测定中间位是否能结合西妥昔单抗的scFv。在scFv中，CDR环仍 然是完整的，但是Fab可变域经由短肽接头直接连接，从而消除Fab恒定域。 换言之，中间位结合袋在scFv中是消除的，而CDR受到最小程度的影响。SPR 表明EGFR域III和cQFD中间位结合至拴系于CM5芯片的西妥昔单抗Fab（见 图4B）。另外，EGFR域III以最小的亲和力损失结合拴系于第二CM5芯片的 scFv。然而，相对于Fab结合，cQFD中间位在高达100μM浓度的中间位时没 有使scFv饱和。这指示了中间位对CDR的最小程度(若有的话)亲和力，这与 结晶学研究一致。
中间位不影响西妥昔单抗对表达EGFR的细胞的结合
尽管Fab能同时结合中间位和EGFR域III，但是测定中间位是否可以影响 西妥昔单抗（以完整的IgG）对表达EGFR的细胞的结合。为了测试这点，使 用FACS分析来追踪IgG对MDA MB-468细胞（其过表达EGFR）的结合，作 为中间位浓度的函数。将细胞在存在递增的cQFD中间位浓度的情况下与西 妥昔单抗一起温育。即使在中间位浓度大于60μM的情况下，没有观察到西 妥昔单抗对细胞的结合的显著变化（图5）。此观察与上文所描述的SEC研究 一致，并且指示中间位并不起抗原结合的变构调节物作用。
在显著高于中间位KD的浓度显示EGFR域III和中间位对Fab的同时结合。 与cQFD和cQYN中间位一样，超抗原SpA和PpL结合Fab框架区而并不影响抗 原结合（Graille等，2000;Graille等，2001;Graille等，2002;Young等，1984）。
另外，可以使用与固体支持物偶联的中间位化学制品来纯化鼠嵌合物西 妥昔单抗，这代表一种用于纯化鼠嵌合物IgG以及嫁接有中间位的IgG的新方 法。见图10。此纯化办法有数个优点。首先，中间位是容易合成的，并且可 以容易地添加至常见的固体支持物（包括磁珠）。其次，中间位的亲和力容 易地受到点突变调控，这使得能够微调纯化规程并避免通常用于洗脱抗体的 严格条件如低pH。最后，如本文中描述的，可以使中间位为二价或多价的（如 在下文实施例4中描述的那些），并用于提取完整的鼠或小鼠化的人IgG。肽 的使用相对于使用蛋白A或蛋白L的目前纯化方法也会具有额外的优点，包 括与蛋白A或蛋白L生成有关的高成本、有限的生命期和外来生物学材料如 细菌病原体的潜在引入。
空间遮蔽
可以经由柔性接头将中间位拴系于鼠嵌合物或小鼠化人单抗的轻链N端 或重链N端（图11）。单抗IgG的N端与抗原结合位点并置，并且从N端延伸到 柔性接头会在空间上干扰抗原结合。通过在接头中编码肿瘤特异性蛋白酶位 点（例如MMP9、MMP14、前列腺特异性抗原(PSA)丝氨酸蛋白酶或其它合 适的位点），分子内“遮蔽”的IgG构建体的空间约束在肿瘤部位会切断，并 且允许抗体结合。此设计原理会避免分子内“遮蔽”的IgG对健康组织的结 合，而且避免由于脱靶结合所导致的不利副作用。在图12中显示了西妥昔单 抗上亲合素-肽遮蔽的解离速率测定。此图显示了多价中间位以比单价中间 位更高的亲和力结合，但是不遮蔽。
实施例4：多价中间位的生成
已经显示了识别同一抗原（例如EGFR）上的独特表位的单克隆抗体（单 抗）的组合增强细胞死亡并抑制肿瘤生长。虽然此增强的细胞死亡的精确机 制仍然是争议的（免疫学应答对受体下调对增强的配体拮抗性），但是先前 的研究指示两种单抗都应当是多价的（例如完整的IgG或F(ab)’2）以实现增 强的细胞死亡。因而，多价中间位可以作为第二抗体取代，如下文显示的。 因此，可以将本文中描述的中间位拴系于支架以创建实现增强的选择性和结 合亲和力的多价中间位。
经常经由多价实现特异性和亲和力。这对于二价配体可以以ΔG总共=ΔG1+ΔG2-ΔG接头（其与K总共=K1*K2/K接头等同）表示。在接头不对自由能产 生贡献的情况中（K接头约1），二价配体对二价靶物的表观亲和力是单体结合 常数的乘积。如此，可以实现亲和力的显著增加（例如对于具有KD=1μM的 中间位，“理论”二价中间位的亲和力是1pM）。然而，很少看到这类增加， 这主要是由于二价/三价/多价受体的几何学所致。受体的几何学对接头加以 严格约束，但是它也确保了特异性，这是靶向投递的一个重要目的。
为了解决接头上的受体约束，可以将未修饰的或经优化的中间位与多价 支架偶联。为了完成这点，对接头进行优化。由于肿瘤细胞具有高抗原密度， 多价中间位应当“锁住(latch-on)”相邻的IgG以形成“雏菊链”样排列（图8）。 虽然二价中间位和IgG的分子内结合是可能的，但是对于这类相互作用，IgG 的C2对称会对接头加以严格的几何学约束。三价或更高价的支架确保超过一 个抗体会是“雏菊状链接的”。通过纳入第三个中间位臂，三价中间位与抗 原结合的抗体的初始相遇的存在期会增加。继而，这会增加额外的臂会结合 相邻抗原结合的抗体，如此使总体复合物稳定化的可能性。
支架合成
基于“Click”化学使用（化合物2）开发经FITC标记的二价中间位的合 成（图13）。模板4和5（图13）的使用分别允许形成二价和三价中间位两者。 此合成代表了一项激动人心的进展，因为本发现描述了为制备多价中间位开 发的化学，并且允许聚焦于调查不同长度的聚乙二醇(PEG)（和其它）接头 以实现最佳结合。该合成办法也适合于掺入DOTA以进行放射性核素成像。 例如，已经在经FITC标记的二价中间位（即化合物13）的合成中掺入PEG 双功能性臂（图13）。IgG内CDR区间的距离为约因此，可以系统性 改变PEG接头的长度以确保此办法是最佳的。商品化PEG的末端间距离延伸 至(Pierce)，这会超过IgG距离。
多价表征
通过SPR和ITC表征每种多价中间位以确保与多价支架的缀合并不影响 中间位-IgG相互作用。然而，这些测量在其测定多价性的有效性中是有限的， 因为IgG未结合至肿瘤表面。取而代之，可以使用FACS分析和细胞存活力测 定法来直接量化多价中间位对过表达EGFR的细胞的影响。
对于FACS分析，将过表达EGFR的细胞系（MDA-MB-468和A431）与多 个浓度（1nM至100nM）的西妥昔单抗一起温育。接着，将经西妥昔单抗处 理的细胞与递增浓度（0.1nM至1μM）的经标记的多价中间位（图17；中间 位-Fc）一起温育，并使用CyAn FACS分选器来分析结合特征。可以观察到 远低于对单价中间位观察到的浓度的浓度时的转变（图17）和/或转变的细胞 百分数增加。为了进一步确认对多价中间位预期的叠加效应，可以使用未标 记的单价中间位来与经标记的多价中间位竞争抗原结合的西妥昔单抗。
还可以使用细胞存活力测定法来测量多价中间位在增强西妥昔单抗介 导的细胞死亡上的效力。简言之，将MDA-MB-468和A431细胞系铺板，并用 不同浓度的西妥昔单抗和多价中间位处理。作为对照，使用单价中间位，其 与单独的西妥昔单抗产生类似的结果。可以使用MTT，即3-(4,5-二甲基噻唑 -2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物来量化活细胞的数目。对于表明活性的多价中 间位，可以实施Western印迹分析来追踪EGFR以及AKT和MAP（其是EGFR 信号传导路径的部分）的磷酸化状态。然后，将这些数据与来自仅用西妥昔 单抗处理的细胞和用酪氨酸激酶抑制剂(AG1478)处理的细胞的数据进行比 较。总之，这应当作为多价中间位浓度的函数引起细胞死亡增加。
MTT测定法
使用MTT测定法来调查单体中间位或二价中间位-Fc与西妥昔单抗一起 对诱导细胞死亡的影响。将4000个MDA-MB-468细胞在96孔板的每孔中在 80μl培养基中放置。与10μl0.1、1或10μM中间位或中间位-Fc一起添加10μl 1μM西妥昔单抗至终浓度0.1μM西妥昔单抗和0.01、0.1和1μM中间位或中间 位-Fc。还与PBS一起单独添加每种组分作为对照。在48小时温育后，添加10μl MTT试剂，并让其再温育4小时。然后，除去培养物上清液，添加100μl MTT 晶体溶解试剂，并在630nm处读板。单独的中间位或中间位-Fc未显著改变细 胞生长，但是仅中间位-Fc而非单体中间位与西妥昔单抗一起可以抑制细胞 生长（图28A）。
为了显示与在西妥昔单抗外的第二抗-EGFR抗体的效果相似，多价中间 位在增强细胞杀伤中具有效力，比较西妥昔单抗与中间位-Fc或西妥昔单抗 与M425对肿瘤细胞生长抑制的效果。将4000个MDA-MB-468细胞在96孔板 的每孔中在80μl培养基中放置。与10μl2,4或8μM中间位-Fc或M425一起添加 10μl1μM西妥昔单抗至终浓度0.1μM西妥昔单抗和0.2,0.4或0.8μM中间位 -Fc或M425。将与PBS一起添加的西妥昔单抗用作对照。在48小时温育后， 添加10μl MTT试剂，并让其再温育4小时。然后，除去培养物上清液，添加 100μl MTT晶体溶解试剂，并在630nm处读板。可以看到中间位-Fc增强西妥 昔单抗的细胞杀伤能力，尽管不如M425那么有力（图28B）。
作为一种备选办法，可以使用不同支架和接头来生成高亲和力多价中间 位。例如，可以将DNA用作中间位的支架来创建更具刚性的支架。
将中间位（野生型）经由柔性肽接头与IgG的Fc区的N端融合（“中间位 -Fc”）（图15;SEQ ID NO:3-4）。在图15和16中分别显示了中间位-Fc的序列和 结构。Fc区“二聚化”配体的使用是完善建立的 （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18215087）。在本实施例中，选择长17 个氨基酸的、由甘氨酸和丝氨酸组成的接头，但是可以使用具有任意合适长 度的接头。为了证明由于多价所导致的增强的结合，将0.5x106个 MDA-MB-468细胞用10nM西妥昔单抗于室温标记30分钟，清洗，然后与0.1、 0.3、1和3μM二价中间位-Fc或单体中间位于室温一起温育30分钟，清洗，并 通过FACS分析。如图17中显示的，FACS分析指示针对化学计量学校正过的 中间位-Fc以显著更高的亲和力结合用西妥昔单抗预处理的细胞。此外，我 们证明了此相互作用对于中间位使能性单抗（西妥昔单抗）是特异性的。此 数据指示与中间位使能性单抗组合的中间位-Fc是协同的，并且可以取代第 二抗体。
还可以使用生物学和化学起源的不同支架来实现多价。这包括但不限 于，构建二价或三价支架，使用链霉亲合素或胶原 (http://ip.com/patapp/EP2065402A1)、链霉亲合素作为四价支架、独特的支架 (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283611000283)、Origami DNA(http://www.nature.com/nnano/journal/v4/n4/abs/nnano.2009.5.html)等。还 可以使用分子来创建化学支架，所述分子包括但不限于，DNA（单链、双链 体、霍利迪连结体(Holliday junction)、适体等）、RNA（单链、发夹、茎环、 适体等）、PNA（肽核酸）、实现刚性的DNA/PNA双链体和三链体，纳米颗 粒（直接偶联或经由有机聚合物如PEG偶联）、可以与自身和/或与DNA或 PNA形成双链体的有机聚合物。例如，在图13中，成功地合成三价中间位。 图14显示了用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的中间位二聚体7的表征。
另外，可以系统性探究Fc和中间位之间的距离和组成以优化亲和力和特 异性。在一个实施方案中，可以在接头内任何位置处取代每个天然的或非天 然的残基以进行优化。另外，2至100个或更多个残基的接头是可能的（例如 可以通过目前和将来的DNA合成仪生成，并插入中间位和Fc区之间）。接头 也可以是‘刚性化’的，以限制旋转半径及增强Fc-中间位的亲和力和特异 性。例如，可以将卷曲螺旋域置于中间位和Fc之间（图18）。或者，可以用 惰性蛋白质域（例如免疫球蛋白折叠）取代接头。可以将多个免疫球蛋白折 叠置于中间位和Fc域之间。在某些实施方案中，接头的组成是人起源的，从 而减轻潜在的抗原性。
实施例5：对中间位袋的修饰
可以系统性或随机改变（简并文库及选择）作为中间位位点衬里的残基 以增强和/或改变中间位或中间位类似物的特异性（对于做出改变的方法，见 例如Sheedy等2007和Akamatsu等2007，在此通过提述并入本文）。可以用 非天然的、非自然的氨基酸或两者取代这些位置，以改善中间位相互作用的 亲和力。最近，描述了在抗体中掺入非天然氨基酸以生成双特异性的抗体 （Hutchins等2001）。
可以系统性或随机改变以经由氢键、离子、静电或空间相互作用改善中 间位亲和力的与中间位接触/作为空穴衬里（在距结合的中间位-cQFD的任何 原子的内）的残基包括一个或多个轻链残基（例如轻链的P8,V9,I10,S14, E17,Q38,R39,T40,N41G42,S43,P44,D82,I83,A84,D85,Y86,Y87,G99, A100,G101,T102,K103,L104,E105,K107,R142,S162,V163,T164,E165, Q166,D167,S168或Y173；或重链的Q6,P9,R38,Q39,S40,P41,G42,K43, G44,L45,S87,D89,T90,A91,I92,Y93,Y94,W109,G110,Q111,G112,T113, L114,V115,T116,Y151,E154,P155,V156,T171,F172,P173,A174,V175, Y182,S183或L184）或其组合。另外，可以将中间位结合区中的其它残基突 变以允许中间位基团将其水合并以高亲和力结合。例如，可以使用轻链残基 的Tyr87、重链残基的Tyr94或两者来与源自中间位类似物的含醛或硼的化合 物形成水合物。
中间位位点的进化。证明了中间位不影响抗原结合，并且如此可以用于 投递药物、雏菊状链接/交联其它抗体或其它用于提高治疗性抗体的效力和功 效的方法。可以改变中间位结合位点的组成，使其可以以更高的亲和力结合 目前的中间位、不同的中间位类似物或小分子如DOTA（用于放射性投递）。 可以将作为中间位结合位点衬里的每个残基系统性改变，生成，并表征。然 而，突变数目是庞大的（>206种组合，潜在地>2016种组合）。为了更有效地 鉴定Fab中实现对中间位的结合的突变，可以在DNA水平上生成IgG库，从而 在给定位点处取代每个氨基酸。可以选出最有用的组合，详细地表征，并用 于别的修饰。
一种这样做的方法是创建DNA文库，其在感兴趣的位点（例如重链的 Ile90,Thr92,Leu114和Thr116和轻链的Lys103和Glu165）处使用简并寡聚物 以在这些位点处编码所有20种天然存在的氨基酸来进行。另外，可以向IgG 重链的C端添加GPI域。可以使用标准方法来转染文库，并且会允许表达独特 的IgG。为了确保抗原结合不受影响，可以通过FAC分选出结合经荧光标记 的抗原（例如Her2,EGFR,IGFR,CLTA-4等）的细胞（图20）。然后，对结合 抗原的细胞选择对特定中间位、中间位类似物或其它感兴趣的分子（例如 DOTA）的结合。一旦分选出细胞，就使用PCR来鉴定实现或增强中间位/类 似物/小分子结合的所得突变。这可以重复多次以“进化/优化”结合。
实施例6：中间位使能性抗体的生成
在某些实施方案中，可以经由突变其它IgG（如人、鼠或鸡的）的残基 在先前存在的和所有将来的单克隆抗体（包括IgG1-4（λ和κ同等型）、IgE、 IgA1、IgA2、IgD和IgM）上创建中间位结合位点。
结合中间位的框架是独特的，因为Fab可变区(Fv)是鼠的，而Fab恒定区 (CH1)是人的。此外，此Fab的成熟在每种IgG域内产生没有在小鼠或人嵌合 IgG中找到（基于已知IgG的序列比对）的残基的组合。为了显示这点，证明 了初始中间位不结合完全人的或完全鼠的血清IgG。因而，可以将中间位结 合位点定位（或工程化改造或突变）至任何框架（包括人IgG）上以实现中 间位结合。可以经由先前存在的单克隆抗体的CDR嫁接改变目前的中间位使 能性单克隆抗体的抗原特异性（图21）。
将人框架序列和西妥昔单抗框架之间的序列差异定位至西妥昔单抗Fab 的晶体结构上。将人框架（曲妥珠单抗-1N8Z.pdb）中作为中间位位点衬里 的残基突变为西妥昔单抗中的相应残基。使用标准方法合成重链和轻链，将 其亚克隆到用于哺乳动物表达的标准载体中，使用标准方法纯化突变的IgG， 并针对Her2和中间位结合进行表征。图23A和23C分别显示了重链(SEQ ID NO:5)和轻链(SEQ ID NO:8)的核酸序列，而图23B和23D显示了与中间位使能 性曲妥珠单抗的野生型序列（SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10）相比轻链(SEQ ID NO:6)和重链(SEQ ID NO:9)的相应氨基酸序列。
为了表征抗原结合，使用标准方案用Alexa647标记野生型曲妥珠单抗和 中间位使能性曲妥珠单抗。类似地，使用相同方案用Alexa488标记中间位-Fc。 为了显示中间位-Fc结合中间位使能性曲妥珠单抗而不结合野生型曲妥珠单 抗，将过表达Her2的SKBR3细胞（0.5x106）与经标记的野生型曲妥珠单抗 或中间位使能性中间位一起温育30分钟。清洗未结合的抗体，并将细胞与中 间位-Fc构建体一起温育30分钟。通过FAC分析来分析抗体结合和中间位结 合。作为“中间位-嫁接”的一种重要组分，FACS数据表明中间位使能性曲 妥珠单抗结合SKBR3细胞上表达的Her2（例如可以在不损失抗原特异性的情 况中将中间位位点嫁接到抗体上）（图22A）。FAC数据还表明中间位-Fc结合 中间位使能性曲妥珠单抗，但不结合野生型曲妥珠单抗（图22B）。
注意到必须优化中间位使能性曲妥珠单抗的生成以提供更多材料进行 严格定量表征，其可以造成明显降低的亲和力（例如在中间位使能性曲妥珠 单抗的终浓度及其用Alexa647标记中的不确定性）。类似地，我们注意到有 标准方法来优化抗原结合以及中间位结合（见对中间位结合位点的优化）。 无论如何，数据明确显示中间位使能性曲妥珠单抗结合过表达Her2的SKBR3 细胞，而且用中间位使能性曲妥珠单抗预处理的细胞结合中间位。
嫁接有Her2 CDR的中间位使能性抗体。CDR嫁接现在是生成人源化单 克隆抗体的标准实践。中间位结合位点是西妥昔单抗框架（而不是人、鼠或 其它鼠-人嵌合物，例如利妥昔单抗）独有的。另一个实施方案证明了可以 将其它抗体的CDR环嫁接到西妥昔单抗框架上以提供中间位结合，其通过将 曲妥珠单抗的CDR环嫁接到西妥昔单抗框架上来进行。虽然单抗的CDR环的 “边界”一般通过序列同源性结构方法清楚限定，我们将曲妥珠单抗的晶体 结构叠加到西妥昔单抗上，并检查每个残基的位置以解决在CDR环外部可能 对CDR环的构象具有次要影响的潜在差异。将轻链和重链的所得氨基酸序列 （例如西妥昔单抗上的曲妥珠单抗CDR环）转化成DNA序列，并合成编码每 种的基因。然后，将基因以符合读码框的方式克隆到剩余的IgG DNA序列中， 通过DNA测序确认，并置于各个表达载体中。将所得表达载体转化到NS0细 胞中以共表达重链和轻链。当分泌表达的嫁接有CDR的全长IgG时，通过离 心使上清液澄清、浓缩、并通过蛋白A柱。使用低pH溶液洗脱IgG，并立即 中和。在还原条件下的嫁接有CDR的全长IgG的SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶 电泳）指示具有与轻链和重链一致的表观质量的两条蛋白质条带。条带的位 置以与野生型西妥昔单抗相比类似的位置迁移。
为了表征抗原结合，使用标准方案用Alexa647标记野生型曲妥珠单抗和 嫁接有曲妥珠单抗CDR的中间位使能性单抗。如前文，使用相同方案用 Alexa488标记中间位-Fc。为了显示中间位-Fc结合嫁接有曲妥珠单抗CDR的 中间位使能性单抗而不结合野生型曲妥珠单抗，将过表达Her2的SKBR3细胞 （0.5x106）与经标记的野生型曲妥珠单抗或中间位使能性中间位一起温育 30分钟。清洗未结合的抗体，并将细胞与中间位-Fc构建体一起温育30分钟。 通过FAC分析来分析抗体结合和中间位结合。作为“中间位-嫁接”的一种重 要组分，FACS数据表明嫁接有曲妥珠单抗CDR的中间位使能性单抗结合 SKBR3细胞上表达的Her2（例如可以将CDR环嫁接到西妥昔单抗框架区上， 并且其结合Her2）（图24A）。FAC数据还表明中间位-Fc结合嫁接有曲妥珠单 抗CDR的中间位使能性单抗，但不结合野生型曲妥珠单抗（图24B）。
注意到必须优化中间位使能性曲妥珠单抗的生成以提供更多材料进行 严格/定量表征，其可以造成明显降低的亲和力（例如在中间位使能性曲妥珠 单抗的终浓度及其用Alexa 647标记中的不确定性）。有本领域已知的优化抗 原结合的方法，其可以应用于中间位结合。数据明确显示中间位使能性曲妥 珠单抗结合过表达Her2的SKBR3细胞，而且用中间位使能性曲妥珠单抗预处 理的细胞结合中间位。嫁接有Her2 CDR的中间位结合单抗序列显示于图25A （重链；SEQ ID NO:11-12）和图25B（轻链；SEQ ID NO:13-14）。
可以将此办法用于任何抗体（包括IgA,IgE,IgD和IgM）和来自生成抗体 的任何生物体的抗体，所述生物体包括但不限于鸡、鼠、大鼠、牛、灵长类 和山羊。举例而言，IgG和IgE“Fab”域的序列和结构比对指示IgE上靠近中 间位结合位点的残基（图26）。
实施例7：作为pH的函数的中间位结合亲和力
可以改变中间位的组成来影响作为pH函数的结合亲和力。如图27中显示 的，以缓冲液pH的函数测量3种不同中间位变体的结合亲和力。QYD中间位 变体显示在较低pH时的亲和力明显降低。在QYN变体中将天冬氨酸取代为 天冬酰胺产生平坦的pH依赖性。类似地，QFD变体的亲和力在较高pH时略 大。这些实验共同指示可以针对pH改编中间位-单抗相互作用的亲和力。
因此，在一些实施方案中，提供了对中间位变体（或“类似物”）的修 饰以在较低pH（例如在用于药物投递的溶酶体中）的特异性释放；以及对中 间位的修饰，从而使其在低氧环境（例如肿瘤基质pH经常低于正常组织）中 以较高的亲和力结合。
本发明的前述实施例和方法仅为例示性的，而并不意图以任何方式限制 本发明的范围。本领域中的普通技术人员会认识到对前述内容的各种修改在 本发明的意图范围内。
参考文献
下文和上文说明书中所引用的所有参考文献都通过提述完整并入本文， 就像在本文中完整列出一样。
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机译： 用于中间位的单克隆抗体框架结合界面，中间位递送系统及其使用方法
机译： 用于中间位的单克隆抗体框架结合界面，中间位递送系统及其使用方法
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