一种基于猪CD163基因的双荧光素酶报告基因载体

摘要

本发明属于家畜基因工程技术领域，涉及一种基于猪CD163基因的双荧光素酶报告基因载体的构建及应用。通过对PRRSV一关键受体基因猪CD163扩增测序获得该基因3’UTR区完整片段，预测调控猪CD163基因3’UTR区候选microRNAs和作用靶点，扩增含有作用靶点的猪CD163基因的序列，将其插入双荧光素酶载体构建猪CD163基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体psi-CHECK2-CD163-3UTR。该载体可用于检测候选microRNAs对猪CD163基因表达的调控活性及用于筛选抑制猪CD163基因表达的microRNAs等。

说明书

技术领域

本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及一种基于猪CD163基因的双荧光素酶报告基因载 体，该载体可以用于筛选检测调控猪CD163基因表达的候选microRNAs，探讨其抑制PRRSV感染增 殖的作用，从而用于间接筛选抗猪繁殖呼吸综合征病毒感染的microRNAs，进一步用于microRNAs 抗猪繁殖呼吸综合征的研究中。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS），因发病猪耳部发绀 呈紫红色斑块状，又称“蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染引起的一种危害极 大的传染病，该病主要导致母猪繁殖障碍（流产、死胎和木乃伊胎增多等）、仔猪呼吸道症状和高死 亡率、公猪精液品质下降等。自1987年首次在美国发现以来，几年之内PRRSV席卷了北美洲、欧洲、 亚太地区和国家。Neumann评估PRRS每年使美国养猪业收入减少将近6亿美元，远远超过猪瘟和伪 狂犬病的3.64亿美元和0.64亿美元。目前PRRS被公认为是危害养猪业的头号传染病。由于PRRSV 破坏宿主免疫系统，导致持续感染；PRRSV变异性高，且感染致病的分子机理和免疫机制等尚不清 楚，限制了安全高效疫苗和药物的研制，目前还没有一种疫苗能对猪体产生完全有效的保护。因此深 入研究PRRSV致病及猪抗病机理、寻找防治PRRS新药设计的靶分子、培育抗病新品种（系）是当 务之急。

CD163是PRRSV感染宿主细胞的关键受体之一，参与介导病毒的内吞和增殖。CD163是清道夫 受体（Scavenger receptor cysteine-rich，SRCR）超家族成员之一，结构包含信号肽、9个串联的SRCR 末端重复序列、一个跨膜区和胞质尾区。CD163是在2005年首次被发现与PRRSV感染有关，实验 表明PRRSV非易感的系猪肾细胞表达CD163后，可以被PRRSV感染并产生病毒增殖能力。随后， Calvert等将从各种细胞系中分离获得的CD163分子转染到PRRSV非敏感的细胞系后，这些细胞内都 产生子代病毒粒子，证明CD163确实是PRRSV感染有关的受体。猪肺泡巨噬细胞（PAM）是PRRSV 的天然靶细胞，而采用CD163的抗体可以有效阻止PRRSV感染PAM。且有报道表明永生化后的PAM 细胞系因无法正常表达CD163而变为PRRSV非易感细胞。CD163的表达量高低与PRRSV增殖率呈 正相关，上调CD163表达（用IL-10处理）会增加病毒增殖，下调CD163表达（用TPA或LPS处理） 可降低病毒增殖；并且采用CD163的抗体可以有效阻止PRRSV感染猪PAM细胞。本人参与的前期 研究结果表明CD163基因的第11号外显子上SNP不同基因型与PRRSV抗体水平密切相关，这些SNP 导致的氨基酸变化与PRRSV的感染有关。

MicroRNA（简称：miRNA）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA， 其大小长约为20-25个核苷酸，由具有发夹结构的70-90个碱基大小的单链RNA前体（pre-miRNA） 加工而来，能够互补或部分互补的靶mRNA结合，使mRNA降解或介导其翻译抑制。这类小RNA 在表达上具有组织和时间的特异性，它们介导了转录后的基因调控。成熟的miRNA可同时封闭多个 靶基因的翻译，干预调节miRNA可改变多个靶基因的表达水平，且干预调节效率很高。越来越多的 研究表明miRNA介导的基因调控对调节机体免疫功能具有重要作用。在人单核细胞中发现miR-146a 在细菌诱发的天然免疫中起作用，而对以病毒为抗原的免疫反应无效。在人肺泡上皮细胞中，增加 miR-146a的表达可对促炎因子IL-8和RNATES的释放有着负调节作用。在小鼠巨噬细胞中发现， miR-155在细菌和病毒诱导的免疫反应中均具有一定调节作用，缺少miR-155或其前体的实验小鼠， 其获得性免疫应答呈现减弱状态，在血管内注射沙门杆菌typhimurium属后，无法建立相关的免疫应 答，这种免疫应答的减弱可归咎于B细胞和T细胞功能损害以及树突状细胞的递呈缺陷。在免疫系统 中，miRNAs在B淋巴细胞的早期分化及效应B淋巴细胞的分化过程中发挥了关键作用。在T淋巴细 胞中，miRNA被发现是谱系诱导通路里的关键调节因子，同时也在调节性T细胞谱系的诱导，功能 维持方面发挥了很重要的作用。miRNA在通过Toll样受体调节树突状细胞与巨噬细胞的分化过程中 不可或缺，它能在细胞活化之前抑制其效应功能的发挥，并在刺激之后增强作用。可见，miRNA在 免疫系统中起到关键调控作用，它甚至可能是细胞最原始的免疫方式。

综上所述，猪CD163基因在PRRSV感染宿主猪细胞的过程中起关键作用，同时miRNA介导的 基因调控对调节机体免疫功能具有重要作用，广泛参与机体抗病毒反应。如近期有研究表明，miR-181 可通过结合PRRSV基因组序列可抑制PRRSV增殖。miRNA多数是通过与靶基因的3’UTR区序列特 异性识别来实现对基因表达的调控作用，而目前猪CD163基因的3’UTR序列并不完整，无法进行调 控猪CD163基因表达的候选miRNAs的研究，因此，获得猪CD163基因3’UTR区完整序列并构建其 双荧光素酶报告载体，可用于筛选获得调控CD163基因表达的候选miRNAs，也可作为抑制PRRSV 感染增殖的候选miRNAs做进一步研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，扩增获得猪CD163基因3’UTR区序列，以预测可调控该 基因表达的miRNAs及靶点。

本发明的进一步目的是提供一种猪CD163基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体及其构建方法。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人参考GeneBank猪CD163基因的cDNA序列（登录号NM_213976.1），通过cDNA3’末端 快速扩增（3’RACE）技术扩增获得猪CD163基因3’UTR区片段，测序获得其CDS下游新的长度为 181bp DNA序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所述。3’RACE扩增的槽式降落PCR上游特 异性引物序列如下：

外引物：5'CAGGTCGCTCATCTTTTGTTGC3'

内引物：5’TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT3’

利用TargetScan生物学软件预测可调控CD163基因3’UTR区的物种间保守的miRNAs （miR-181a,b,c,d、miR-4262、miR-23a,b,c等）及作用靶位点序列（TGAATGT和AATGTGA） （http://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_61/view_gene.cgi？taxid=9606&rs=NM_203416&memb  ers=&showcnc=0&shownc=0&showncf=），并发现新扩增获得的猪3’UTR区也包含这些保守miRNAs 的作用靶位点序列。

根据获得的猪CD163基因的全序列，设计包含3’UTR区的一对引物，在5’端和3’端分别引入 XhoI（CTCGAG）和NotI（GCGGCCGC）酶切识别位点及保护碱基，利用PCR方法扩增猪CD163 基因片段，其序列如SEQ ID：6所示，长度为469bp，并纯化PCR产物。其引物序列如下：

上游引物：5'CCGCTCGAGTCGCTCATCTTTTGTTGC3'

下游引物：5'ATTTGCGGCCGCTTTTATTTAATGCCCTTG3'

将扩增获得的猪CD163基因3’UTR区片段插入双荧光酶报告载体psi-CHECK2的XhoI和NotI 酶切位点，构建猪CD163基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体，申请人将这个载体命名为 psi-CHECK2-CD163-3UTR，其插入核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示。

本发明的双荧光素酶报告基因载体psi-CHECK2-CD163-3UTR，可用于非诊断目的的对候选 miRNAs对猪CD163基因表达的调控活性的检测，用于筛选可抑制猪CD163基因表达的miRNAs。

更详细技术细节如《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是3’末端快速扩增的槽式降落PCR外引物的上游引物序列。

序列表SEQ ID NO：2是3’末端快速扩增的槽式降落PCR外引物的下游引物序列。

序列表SEQ ID NO：3是扩增测序获得的猪CD163基因3’UTR区的181bp DNA序列。

序列表SEQ ID NO：4是PCR扩增猪CD163基因469bp片段的上游引物序列。

序列表SEQ ID NO：5是PCR扩增猪CD163基因469bp片段的下游引物序列。

序列表SEQ ID NO：6是PCR扩增猪CD163基因469bp片段核苷酸序列，该序列包含酶切位点和保 护碱基序列。

序列表SEQ ID NO：7是本发明构建的载体psi-CHECK2-CD163-3UTR核苷酸的全序列。

图1：是本发明的总体技术流程图。

图2：是猪CD163基因3’RACE PCR扩增结果图。图中：泳道1为第一轮PCR扩增结果，泳道2为 第二轮PCR扩增结果，泳道M是100bp DNA Ladder。

图3是猪CD163基因3’UTR扩增序列，用于构建载体的目的片段。泳道M1是100bp DNA Ladder， 泳道M2是DL2000DNA Marker，泳道CD163是扩增的猪CD163基因3’UTR片段。

图4是空载体psi-CHECK2的结构图谱。

图5是本发明构建的载体psi-CHECK2-CD163-3UTR结构图谱。

图6是构建的猪CD163基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体酶切鉴定图。泳道M1是DL10000DNA Marker，泳道M2是100bp DNA Ladder，泳道1,2,3是载体双酶切后片段。

图7是miRNA和psi-CHECK2-CD163-3UTR共转染Marc-145细胞48h后相对荧光素酶检测结果。图 中：纵坐标Related Luciferase Activity表示相对荧光活性值，**P<0.01。

具体实施方式

实施例1

1.猪CD163基因3’RACE测序

1.1引物设计

参考猪CD163基因GenBank的cDNA序列（登录号：NM_213976.1）设计外、内两个上游特异 性引物，结合宝生物工程大连有限公司的3’RACE试剂盒的外、内下游锚定引物，利用槽式降落PCR 扩增3’UTR区片段。引物序列如下：

外引物的上游引物：5'-CAGGTCGCTCATCTTTTGTTGC-3'（序列表SEQ ID NO：1）

外引物的下游引物：5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’

内引物的上游引物：5'-GCCTGAAAGCAGATGAAACGGA-3'（序列表SEQ ID NO：2）

内引物的下游引物：5’-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3’

1.2猪组织总RNA提取与检测

使用Trizol试剂（购自Invitrogen公司）提取湖北白猪（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所实验 猪场）肝脏组织总RNA，具体提取步骤参照Trizol试剂自带说明书。溶解后的RNA在含有溴化乙锭 （EB）的1.2%琼脂糖胶上电泳检测，同时在DNA浓度测定仪上测定浓度，存放于-20℃备用。

1.3反转录

以总RNA为模板，使用宝生物工程大连有限公司的3’RACE Adaptor引物进行反转录反应，合 成cDNA第一链。反应体系（10μl）为：总RNA（500ng/μl）1μl，3′RACE接头引物（5μM）1μl， 5×PrimeScript缓冲液2μl，dNTP混合液（10mM）1μl，RNA酶抑制剂（40U/μl）0.25μl，PrimeScript 反转录酶（200U/μl）0.25μl，无RNA酶dH₂O4.5μl。

反应程序为：42℃，60min；70℃，15min。

1.3槽式PCR扩增

进行第一轮外引物PCR扩增反应体系（50μl）为：反转录cDNA2μl，1×cDNA稀释缓冲液II8μl， RACE外引物的上游引物（10μM）2μl，外引物的下游引物（10μM）2ul，10×TransStart^TM Taq缓冲液 （含Mg²⁺）7μl，TransStart^TM Taq酶（2.5U/μl）0.5μl，ddH₂O28.5μl。反应程序为：95℃预热4min； 95℃变性30s，62℃-52℃退火30s（每个循环降低0.5℃），72℃延伸1.5min，共20个循环；95℃变性 30s，52℃退火30s，72℃延伸1.5min，共15个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

进行第二轮内引物PCR扩增反应体系（50μl）为：第1轮PCR产物1ul，dNTP混合液（2.5mM） 8μl，10×TransStart^TM Taq缓冲液（含Mg²⁺）10μl，RACE内引物的上游引物（10μM）2μl，内引物的 下游引物（10μM）2ul，TransStart^TM Taq酶（2.5U/μl）1μl，ddH₂O26μl。反应程序为：95℃预热4min； 95℃变性30s，64℃-54℃退火30s（每个循环降低0.5℃），72℃延伸1.5min，共20个循环；95℃变性 30s，54℃退火30s，72℃延伸1.5min，共15个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR反应产物用1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测，PCR结果见图2所示。从琼脂糖回收目的DNA，送北京奥科鼎盛生物科技有 限公司测序。在NM_213976.1已知的mRNA序列基础上向下游延伸获得包含PolyA特征的3’UTR核 苷酸序列（见序列表SEQ ID NO：3所示）。

2构建猪CD163-3’UTR荧光素酶报告载体

2.1生物信息学预测调控猪CD163基因3’UTR的miRNA及靶点

利用生物信息学工具TargenScan，参考人3’UTR序列，预测调控CD163基因表达的物种间保守 miRNAs（miR-181a,b,c,d、miR-23a,b,c等）及其作用靶位点序列（TGAATGT和AATGTGA），详见 http://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_61/view_gene.cgi？taxid=9606&rs=NM_203416&member  s=&showcnc=0&shownc=0&showncf=。对比新扩增获得的猪3’UTR区序列，发现也包含这些保守 miRNAs的靶位点序列（TGAATGT和AATGTGA）。

2.2扩增猪CD1633’URT片段及纯化

结合猪CD163基因CDS序列和以上测序结果，设计包含3’UTR区的一对引物，PCR扩增猪 CD163基因3’UTR469bp片段，所用引物为：上游引物:5'CCGCTCGAGTCGCTCATCTTTTGTTGC3' （序列表SEQ ID NO：4），含有XhoI（CTCGAG）酶切位点和保护碱基（CCG）；下游引物:5' ATTTGCGGCCGCTTTTATTTAATGCCCTTG3'（序列表SEQ ID NO：5），含有NotI（GCGGCCGC） 酶切识别位点和保护碱基（ATTT）。

PCR扩增反应体系（总体积50μl）为：反转录cDNA1μl，10×TransStart^TM Taq缓冲液（含Mg²⁺） 10μl，dNTP混合液（2.5mM）8μl，上游引物（10μM）2μl，下游引物（10μM）2ul，TransStart^TM Taq 酶（2.5U/μl）1μl，ddH₂O26μl。反应程序为：95℃预热4min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延 伸1.5min，5个循环；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min，共25个循环；72℃延伸10min； 4℃保存。

PCR反应产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测（图3），采用过柱离心的方法从琼脂糖回收纯化PCR产 物，并送测序验证（序列表SEQ ID NO：6）。

2.3载体psi-CHECK2扩增

载体psi-CHECK2同时含有萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶基因（图4），其中萤火虫荧光素酶基 因为内参基因，海肾荧光素酶基因为检测的报告基因。经过大肠杆菌DH5α扩增后，使用去内毒素质 粒小量提取抽提试剂盒（Omega E.Z.N.A.^TM Endo-Free Plasmid Mini KitISpin）进行抽提载体DNA， 具体步骤见试剂盒说明书。

2.4双酶切

由2.3中抽提的载体psi-CHECK2DNA和2.2中回收纯化的PCR产物，分别用XhoI和NotI限 制性内切酶进行双酶切，所用内切酶均购自宝生物工程大连有限公司。载体酶切体系如下：载体 psi-CHECK210μl，10×H缓冲液4μl，BSA4μl，XhoⅠ限制性内切酶2μl，NotⅠ限制性内切酶2μl， ddH₂O18μl，共40μl。PCR产物酶切体系如下：PCR产物20μl，10×H缓冲液4μl，BSA4μl，Xho  I限制性内切酶2μl，NotⅠ限制性内切酶2μl，ddH₂O8μl，共40μl。

混合体系于37℃酶切过夜。酶切产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳，采用过柱离心的方法回收。

2.5连接

将酶切后纯化的载体psi-CHECK2和CD163基因3’UTR切割片段，用T4连接酶进行连接。连接 体系为：psi-CHECK2载体2μl，CD163基因3’UTR扩增片段6μl，T4连接酶1μl，10×T4DNA连 接酶缓冲液1μl，共10μl。混合体系于4℃连接过夜。

2.6转化感受态细胞

将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中，具体步骤如下：

（1）向50μl感受态细胞中加入5μl的连接产物，轻轻混匀，冰上放置30min；

（2）42℃热激60s，立即冰上放置2min；

（3）加入400μl无氨苄的LB液体培养基，放入37℃恒温摇床中复苏60min；

（4）以4000rpm/min离心4min，去除300μl上清，将剩余的上清吹散细菌沉淀，并将他们均匀 涂抹在含有100μg/ml氨苄的LB固体培养基平板中；

（5）37℃正置培养60min（待菌液完全吸收）后，倒置培养14-16h，观察有无白色菌落长出。

2.7筛选阳性克隆并测序验证

用灭菌枪头从平板中挑取单克隆接入500μl含氨苄的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床扩大培 养6h。以菌液为模板，用2.2中引物和PCR反应条件检测，有目的条带的说明该克隆为阳性克隆， 将阳性克隆菌液送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。将测序正确的阳性克隆用去内毒素质粒小量 提取抽提试剂盒（Omega E.Z.N.A.^TM Endo-Free Plasmid Mini KitISpin）抽提重组载体DNA并测定浓 度，具体步骤参见试剂盒说明书。同时，用XhoI和NotI限制性内切酶进行双酶切该载体，再次验 证插入片段正确性（图6）。申请人将该载体命名为psi-CHECK2-CD163-3UTR，其核苷酸序列如SEQ  ID NO：7所示。。

3猪CD163-3’UTR荧光素酶报告载体的应用

3.1人工合成候选miRNAs

人工合成miR-181c、miR-181d、miR-23a和miR-4262（预测可调控CD163基因表达的候选 miRNAs）模拟物，及NC阴性对照。以上miRNAs及NC对照均由上海吉玛制药技术有限公司合成。

3.2利用psi-CHECK2-CD163-3UTR载体与miRNAs共转染Marc-145细胞

（1）在转染前一天，5×10⁴细胞接种在24孔板中，加入无抗生素的培养基培养细胞；

（2）将每孔加入200ng psi-CHECK2-CD163-3UTR载体、各miRNA模拟物（使终浓至80nM） 溶于50ul Opti-MEM无血清培养基中，室温静置5min；

（3）每孔加入2ul Lipofectamin^TM2000脂质体（购自Invitrogen公司）溶于50ul Opti-MEM无血 清培养基中，室温静置5min；

（4）将步骤（2）和（3）的液体混合，室温静置30min，然后均匀加入代转染细胞中；

（5）将细胞培养板放入无菌5%CO₂培养箱中，培养5h后，更换为新鲜完全培养基，48h后收 集细胞。

每组均做3孔生物学重复。

3.3双荧光素酶活性检测

转染48h后，用磷酸盐缓冲液（简称PBS，购自HyClone公司）清洗细胞2次，加入120ul细胞 裂解液1×PLB，室温摇晃15min充分裂解细胞，然后将裂解液收集至1.5ml离心管中，按照Promega 公司的双荧光素酶检测试剂盒（Dual-Luciferase Reporter Assay）说明书提供的方法，采用PerkinElmer 公司的VICTOR^TM X²Multilabel Plate Reader仪器检测双荧光素酶活性。萤火虫荧光值（M1）为内参 荧光值，海肾荧光值（M2）为报告基因检测值，结果以M2/M1比值计算，利用SPSS17.0对检测结 果进行统计分析，结果见表1。以NC对照为参照，相对荧光活性检测结果如图7所示。结果可以看 出，相对于NC对照而言，miR-181c（66%）、miR-181d（54%）、miR-23b（69%）和miR-4262（59%） 均可在显著抑制猪CD163基因表达，其中miR-181d抑制效果最佳，其活性仅为NC对照组的54%。

表1.双荧光素酶相对活性检测结果