公开/公告号CN103551379A
专利类型发明专利
公开/公告日2014-02-05
原文格式PDF
申请/专利权人 中国科学院武汉植物园;
申请/专利号CN201310538617.4
申请日2013-11-05
分类号B09C1/10(20060101);
代理机构42001 武汉宇晨专利事务所;
代理人黄瑞棠
地址 430074 湖北省武汉市武昌磨山
入库时间 2024-02-19 21:27:30
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-09-26
专利权人的姓名或者名称、地址的变更 IPC(主分类):B09C1/10 变更前: 变更后: 申请日:20131105
专利权人的姓名或者名称、地址的变更
2015-11-18
专利权的转移 IPC(主分类):B09C1/10 登记生效日:20151030 变更前: 变更后: 申请日:20131105
专利申请权、专利权的转移
2015-06-10
授权
授权
2014-03-12
实质审查的生效 IPC(主分类):B09C1/10 申请日:20131105
实质审查的生效
2014-02-05
公开
公开
技术领域
本发明涉及微生物生态修复技术领域,尤其涉及一种利用耐镉真菌在镉污染土壤中进行生态修复的方法。
背景技术
镉是毒性最强的重金属元素之一,危害极其严重。土壤中过量的镉会抑制植物的正常生长,在可食部分的残留还会通过食物链影响到人体健康。近年来,镉污染事件频发,广东北江、广西龙江、湖南株洲、湖南浏阳以及日本镉污染大米等事件令人触目惊心。对镉污染土壤的治理也引起了国内外的广泛关注。
采用工程、物理和化学方法修复镉污染土壤具有一定的局限性,难以大规模处理,并且会导致土壤结构破坏,生物活性下降和土壤肥力退化。农业生态措施其周期太长,效果也不显著。作为新兴的高效生态修复技术——生物修复,以其良好的社会、生态综合效益,易被大众接受,具有广阔的应用前景。其中微生物在修复重金属污染土壤方面具有独特的作用。其主要的作用原理为:微生物可以吸附重金属;微生物可通过改变根际微环境,降低土壤中重金属的毒性或提高植物对重金属的吸收。
微生物修复具有下列优点:
①不破坏植物生长的土壤环境;
②不会形成二次污染或导致污染物的转移;
③可最大限度地原地降解污染物;
④费用低廉;
⑤操作简便,有效避免操作人员受污染物直接影响;
⑥高效,修复时间短,对周围环境干扰少。
目前,微生物在修复重金属污染土壤中也存在下列不足之处:
①微生物对土壤的适应性较差;
②微生物与植物的兼容性较低;
③微生物存活率低。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足,提供一种利用耐镉真菌在镉污染土壤中进行生态修复的方法。
本发明的目的是这样实现的:
1、基本思路
对镉污染土壤优势植物的根际土壤中的微生物进行耐镉筛选,选取耐镉性最强的微生物进行分离纯化,再将其添加到镉污染土壤中,以提高其耐镉性。
2、本方法包括下列步骤:
①将耐镉真菌分离纯化;
②将耐镉真菌鉴定;
③确定耐镉真菌最适生长条件
A、生长曲线绘制;
B、最适生长温度确定;
C、最适pH的确定;
④耐镉真菌修复基质制备;
⑤修复镉污染土壤。
本发明具有下列优点和积极效果:
①利用镉污染地区优势植物的根际土壤作为耐镉微生物筛选的来源,克服了筛选出的耐镉微生物对修复地土壤环境的适应性问题;
②应用既有一定能力耐镉性,又与耐镉真菌有兼容性的狗牙根,克服了植物-微生物间的排斥作用;
③将耐镉真菌接种到锯末中进行施用,确保了微生物生长的养分供应,有效利用了废弃物;
④成本低廉、操作简便,微生物生长迅速,可大规模繁殖。
具体实施方式
下面结合实施例详细说明:
一、方法
①将耐镉真菌分离纯化
选取10g中国株洲重金属污染区狗牙根根际土壤置于三角瓶中,无菌条件下,加入适量玻璃珠和90ml无菌水,在旋转式摇床150rpm、30℃振荡30min,以使微生物从土壤中充分洗脱,然后静置20min,吸取上清液用无菌水稀释100倍,即为土壤菌悬液;取1ml上清液均匀涂布到镉浓度为50mg/L的固体平板上(牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏琼脂培养基、高氏一号培养基),待菌落长成后,利用平板划线分离法接种到镉浓度为100、150、200mg/L的固体培养基中,30℃培养;将耐镉能力最强的菌落选出,对其单菌落连续4次采用平板划线分离法进行纯化;
②将耐镉真菌鉴定
将耐镉能力最强的菌株接种至装有30ml液体培养基(马丁氏琼脂培养基)的离心管中(50ml)振荡培养一天,8000rpm离心10min,倒掉上清液并加入无菌水重复离心2次后取出沉淀,在无菌条件下利用真菌DNA提取试剂盒抽提基因组DNA,提取产物利用PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶产物切割回收并纯化后利用真菌ITS序列测序,测序结果提交至Gene Bank并利用BLAST进行序列比对,利用序列相似性确定真菌的种属关系;
③确定耐镉真菌最适生长条件
采用比浊法测定菌悬液浓度来确定生长曲线、最适生长温度及最适pH值;
具体步骤为:
A、生长曲线绘制
将1ml菌悬液接种到新配制并灭菌的25ml马丁氏液体培养基中,加入无菌的镉溶液(CdNO3形式),使其最终浓度为1.5mM,以不加镉为对照,分别于2、4、8、12、24、48、60、72h取样5ml,用紫外-可见分光光度计于600nm波长测定吸光度值,每个样品重复三次,以培养时间为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制生长曲线;
B、最适生长温度的确定
将1ml菌悬液接种到新配制并灭菌的25ml马丁氏液体培养基中,分别于15、20、25、30、35、40℃下振荡培养36h,取样5ml,三次重复,测定吸光度值,最终确定该真菌菌株最适生长温度为30℃;
C、最适pH的确定
将1ml菌悬液接种到新配制并灭菌的25ml马丁氏液体培养基中,精确调整培养液pH值至4、5、6、7、8,在30℃下振荡培养36h,取样5ml,三次重复,测定吸光度值,最终确定该真菌菌株最适pH值为pH6.0;
④耐镉真菌修复基质制备
采用浇灌法将耐镉真菌-棘孢曲霉接种到锯木屑中培养,调节pH值至6.0,在30℃培养两天,然后再次浇灌棘孢曲霉接种液,以确保接种成活率;
⑤修复镉污染土壤
将接种有棘孢曲霉的锯末施入镉污染土壤;
可有效降低土壤中镉对植物的毒害以及促进镉在狗牙根根部积累,减少向地上部的运输。
二、实施例
1、实施例一
将狗牙根种植在已高温高压灭菌、未受镉污染的土壤中,30℃培养,每隔2天用耐镉微生物(棘孢曲霉)菌悬液浇灌,共浇灌7次,并以不接种微生物为对照。研究发现,土壤中棘孢曲霉为优势菌群大量存在,接种棘孢曲霉后,狗牙根植株和根系与对照相比无显著差异,未出现病变现象,且生长和蒸腾速率均未受到影响,同时发现在接种5次后蒸腾速率高于对照,表现出一定的生长促进作用。
2、实施例二
将狗牙根种植于已高温高压灭菌、未受镉污染的土壤中,用2mM CdSO4(由1/2Hoagland营养液配置)溶液浇灌,接种棘孢曲霉真菌菌株,在可控条件下(30℃)培养7天,测定土壤中微生物数量,狗牙根生长速率、蒸腾速率、草坪质量、叶绿素含量等指标;然后继续提高胁迫浓度至4mM,培养7天后测定上述指标,依次类推(每次递增2mM)直至胁迫浓度达到10mM;结果发现,在5个浓度的土壤中棘孢曲霉均为优势菌群,数量显著多于其他微生物;随着胁迫浓度的递增,狗牙根生长速率、草坪质量、叶绿素含量等指标略高于对照,未达到显著水平;镉含量分析表明:土壤中有效镉含量降低,狗牙根根部镉含量上升,地上部镉含量下降。
3、实施例三
将狗牙根种植于已高温高压灭菌、未受镉污染且添加有耐镉真菌修复基质的土壤中,用2mM CdSO4(由0.5xHoagland营养液配置)溶液浇灌,接种棘孢曲霉真菌菌株,在可控条件下(30℃)培养7天,测定土壤中微生物数量,狗牙根生长速率、蒸腾速率、草坪质量、叶绿素含量等指标;继续提高胁迫浓度至4mM,培养7天后测定上述指标,依次类推(每次递增2mM)直至胁迫浓度达到10mM;结果发现,在5个浓度的土壤中棘孢曲霉均为优势菌群,数量显著多于其他微生物;随着胁迫浓度的递增,狗牙根的生长速率、草坪质量、叶绿素含量等指标均显著高于对照;镉含量分析表明:土壤中有效镉含量降低,狗牙根根部镉含量上升,地上部镉含量下降。
机译: 技术上被镉,铅,锌和铬污染的土壤的生态修复方法
机译: 编码酵母镉因子或经其修饰基因转化的植物的基因(YCF1),以及使用该植物对污染了土壤的土壤进行消毒的方法
机译: 利用热带植物对裸露水质污染土壤中铁的吸收和镉耐受性的方法