低产杂醇油酵母及其在降低小曲原酒杂醇油含量中的应用

摘要

本发明公开了一种低产杂醇油酵母，其分类命名为酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）Y19,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年3月19日，保藏编号为CCTCC NO.M2013091；使用该低产杂醇油酵母生产清香型小曲原酒，其中的杂醇油含量比传统发酵法降低24.7%，所生产的清香型小曲原酒清香纯正，入口绵甜，香味协调，尾净爽口，风格典型，饮后不上头。

说明书

技术领域

    本发明涉及一种生物材料，属于生物工程技术领域，具体是一种低产杂醇油酵母及其在降低小曲原酒杂醇油含量中的应用。

背景技术

市场上现有各种清香型不同酒精度的白酒大部分是经传统固态发酵法生产的原酒调配勾兑而成，因此，要控制白酒中的杂醇油含量，必须要从控制原酒中的杂醇油含量入手。杂醇油是指乙醇以外的具有3个碳链以上的一价醇类。这些醇类包括正丙醇、异丁醇、正丁醇、仲丁醇、戊醇、异戊醇、活性戊醇、正己醇、B一苯乙醇等，是原酒中的一类微量物质。它们还是一类高沸点的混合物，具有特殊的、强烈的刺激性气味。虽然目前白酒的国家标准中没有限制杂醇油的含量，但研究表明，如果酒中杂醇油含量过高，对人体有毒害作用，能使神经系统充血，使人感觉头痛，即常说的“上头”，其毒性随分子量增大而加剧。杂醇油在人体内的氧化速度比乙醇慢，在人体内停留时间长，而且杂醇油含量高也是造成勾兑后的酒中苦味、涩味、出现白色浑浊的原因之一。因此，如何降低原酒中杂醇油的含量已引起了业界的广泛关注。

原酒中的杂醇油是由酵母产生，酵母通过两种代谢途径产生杂醇油。一是降解途径。酿酒原料中都含有一定量的蛋白质，在发酵过程中，当蛋白质被蛋白酶分解后，或蛋白质受到酸、加热作用水解，产生氨基酸。氨基酸在酵母菌的作用下，脱氨基脱羧基，再经还原生成比氨基酸少一个碳原子的高级醇，即杂醇油。氨基则被酵母菌利用合成菌体。此时产生的杂醇油便存留在发酵醅中，这个反应只能在酵母体内完成。其中异戊醇由亮氨酸，异丁醇由缬氨酸，正丙醇由苏氨酸，活性戊醇由异亮氨酸生成；二是通过合成途径。当发酵糟醅中缺乏某些所需氨基酸时，或含量不足时，酵母由于自身生长、繁殖的需要，在酵母菌的作用下，由糖代谢的中间产物丙酮酸与活性乙醛缩台，经过还原、异构、脱水作用，形成相应的碳原子较高的α—酮酸，再经加氨即可形成相应的氨基酸，如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；若脱羧、加氢，则可形成少一个碳原子的相应高级醇 但是，如果遇到发酵糟中氮源不足时，不能供其全部胺化，则在合成过程中生成过剩的酮酸，脱羧还原生成新的高级醇。

目前降低原酒中杂醇油的方法有三种思路。一、采用后处理工艺降低其含量，后处理工艺主要有如下方法：1、新酿原酒合理贮存一段时间，或通过热处理、通风处理等一些理化手段，加速酒体中高级醇的成酸成酯反应，从而降低高级醇的含量。这种方法对杂醇油的降低作用有限；2，用吸附剂吸附及滤膜过滤。高级醇分子直径一般大于酒体中其他主要成分分子直径，利用这一特性，可采用滤膜装置截留分子直径较大的高级醇分子，也可采用大孔型吸附树脂定向吸附酒中的高级醇。这种方法投入成本较高，且同时会吸附降低酒中酯的含量；二、改进发酵工艺。生产工艺上为了降低原酒中高级醇的含量，可采取低温发酵、适当加大酵母菌接种量、控制发酵醪中氧的含量及营养物质等。但是，由于固态发酵的批次稳定性差，每批粮食的理化指标都不一致，且气温变化对发酵影响较大，导致实验得到的结论应用受到局限，效果不明显。三、选育低产杂醇油酵母菌。杂醇油的生成伴随着酵母菌的代谢活动，所以说杂醇油的生成是必然的。通过选育低产杂醇油的酵母菌种、针对菌种生理特性采取相应的工艺调整，是目前白酒酿造过程中控制杂醇油含量的关键手段。

发明内容

本发明的目的就是为降低小曲原酒中杂醇油含量而提供一种低产杂醇油酵母，同时应用该酵母降低小曲原酒中杂醇油的含量。

将该酵母应用于清香型小曲原酒的生产中，经检测，所产原酒杂醇油含量平均为84.73mg/100ml，比传统酵母生产的清香型小曲原酒中杂醇油平均含量低24.7%左右。所生产的清香型小曲原酒清香纯正，入口绵甜，香味协调，尾净爽口，风格典型，饮用后不上头。

本发明提供的低产杂醇油酵母，其分类命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y19（下称Y19酵母）,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年3月19日，保藏编号为CCTCC NO.M2013091。

1.  Y19酵母的分离与筛选

1.1米曲汁琼脂培养基的制备

将早籼米浸泡8—10h，磨浆，在米浆中加入过20目筛的早籼米粉和米糠，其中早籼米：早籼米粉：米糠的重量份比为63:35:2；搅拌均匀后，接种安琪根霉，接种量为早籼米、米粉及米糠总重量的3.0%—3.5%；再用手捏成直径6—7厘米的饼形曲坯，将曲坯排列于培养室内的木箱上，曲坯间距约为2—3厘米，盖上竹垫；培养室温度控制在30—32℃，当曲坯品温升至35℃时，揭去竹垫子；继续培养至曲坯品温降至25—28℃，然后将其在35℃下烘干；此曲坯即为种曲。

取烘干后的种曲400g捣碎，加入适量水，于65℃糖化24h；过滤，向滤液中加入20g葡萄糖，20g琼脂，溶化后补足水至1000ml，调pH至6.5,121℃灭菌20min，即制得米曲汁琼脂培养基。

1.2菌株分离和筛选

从劲牌公司毛铺酒厂制曲车间仓库采样，用四分法取样，将样品用粉碎机粉碎后，取1g，溶于盛有99ml无菌生理盐水的三角瓶中（三角瓶中加玻璃珠），充分振荡摇匀。从三角瓶中吸取1ml溶液溶入盛有9ml无菌水的试管中，再将其依次稀释制成10-3 的菌悬液，以此类推制成10-4，10-5,10-6的菌悬液；然后从其中各取1ml涂布于步骤1.1中制得的米曲汁琼脂培养基上，于30℃培养12-18小时，待长出菌落，再将其于另一米曲汁琼脂培养基划线纯化，直至得到纯培养物。

将纯化后的菌株，接种于盛有100ml米曲汁培养基的三角瓶中，装上发酵栓，发酵72小时，采用二氧化碳失重法测菌株的发酵力。发酵结束后，将发酵液离心，取上清发酵液5ml，装入15ml顶空进样瓶，再加3g氯化钠，采用顶空气相色谱法测定杂醇油含量。色谱条件为：Agilent780A气相色谱仪，检测器FID，CP-WAX毛细管色谱柱（50m*0.2um*0.25mm）。升温程序：柱温40℃保持8min，以5℃/min升至150℃。进样口温度250℃，检测器温度260℃，空气、氢气流速比300:30，载气为氮气，分流比30:1，柱流量1.0ml/min，进样方式：自动进样器。

检测结果见下表：

                                                 

由上表可知，菌株JY7虽然产杂醇油最低，但是发酵力较低。Y19菌株发酵力与其他发酵力好的菌株相当，且产杂醇油最低，所以Y19是我们要筛选的目的菌株。

筛选到的酵母菌种菌落特征为：菌落呈圆形，白色，凸起，边缘光滑，表面较湿润，菌落易挑取，菌落大小为（0.1-0.2）cm。参见图1。

1.3菌种鉴定：

将筛选出的低产杂醇油酵母进行分子生物学鉴定，利用酵母特异分类鉴定引物扩增菌株的18sRNA,经凝胶电脉检测，接着进行测序对比，确定菌种的属种，结果是酿酒酵母。

测序结果参见后附的序列表。

本发明的另一个目的就是提供上述低产杂醇油酵母在降低小曲原酒杂醇油含量中的应用，其应用的具体步骤如下:

①种曲和米曲汁培养基的制备 

将早籼米浸泡8—10h，磨浆，在米浆中加入过20目筛的早籼米粉和米糠，其中早籼米：早籼米粉：米糠的重量份比为63∶35∶2；搅拌均匀后，接种安琪根霉，接种量为早籼米、米粉及米糠总重量的3.0%—3.5%；再用手捏成直径6—7厘米的饼形曲坯，将曲坯排列于培养室内的木箱上，曲坯间距约为2—3厘米，盖上竹垫；培养室温度控制在30—32℃，当曲坯品温升至35℃时，揭去竹垫子；继续培养至曲坯品温降至25—28℃，然后将其在35℃下烘干；此曲坯即为种曲；

取烘干后的种曲400g捣碎，加入适量水，于65℃糖化24h；过滤，向滤液中加入20g葡萄糖，再将滤液补水至1000ml，调pH至6.5；121℃灭菌20min，即制得米曲汁培养基；

②制麸皮纯种酵母

于三角瓶中装200ml步骤①所制得的米曲汁培养基，121℃灭菌20min；冷却后，将保藏编号为CCTCC NO.M2013091的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y19试管纯培养物接种其中，摇床培养20—24小时；再接种到经过灭菌的麸皮培养基中，30℃下培养30—36小时；将麸皮培养物35℃下干燥6—8小时，制成麸皮纯种酵母；

③土曲的制备

将膨润土粉碎后过14目筛，米糠过16目筛，将步骤①制得的种曲碾碎后过20目筛；先将种曲与步骤②制得的麸皮纯种酵母及米糠混合均匀，再加入膨润土搅匀，其中种曲∶麸皮纯种酵母∶膨润土∶米糠的重量份比为1∶0.1∶75∶25;得混合料；加水至上述混合料中，使混合料中含水量为50%；搅匀，将混合料制成直径为7—8cm的球形曲坯，并将此曲坯置于培养室内的培养箱内，在曲坯上铺竹垫，控制培养室内温度在28—30℃之间，培养16—18小时；当曲坯品温升至34—35℃时，揭开竹垫，待曲坯品温降至25—26℃时，继续培养110—120小时；培养结束后，将曲坯置于烘房内于35—40℃下烘干，即制得土曲；

④制备小曲原酒

高粱经浸泡、初蒸、闷水和复蒸后，再将其摊凉至35—40℃，按1%的接种量加入步骤③所制得的土曲，将土曲与蒸熟高粱搅匀后，糖化24—28h，得粮醅；按粮醅∶配糟的重量比为1∶1.2的比例添加配糟，并控制所添加的配糟酸度为0.5—0.6mmol/L，再将配糟后的粮醅冷风降温至11—12℃后，入池发酵16—20天，蒸馏，即得小曲原酒；经检测，原酒中的杂醇油含量平均值在84.73mg/100ml左右。

     且该清香型小曲原酒清香纯正，入口绵甜，香味协调，尾净爽口，风格典型，饮用后不上头。

附图说明

 图1是Y19酵母菌落宏观形态图。

具体实施方式

用Y19酵母生产小曲原酒的方法实施例

实施例1

  ①种曲和米曲汁培养基的制备 

将早籼米浸泡8—10h，磨浆，在米浆中加入过20目筛的早籼米粉和米糠，其中早籼米：早籼米粉：米糠的重量份比为63∶35∶2；搅拌均匀后，接种安琪根霉，接种量为早籼米、米粉及米糠总重量的3.0%—3.5%；再用手捏成直径6—7厘米的饼形曲坯，将曲坯排列于培养室内的木箱上，曲坯间距约为2—3厘米，盖上竹垫；培养室温度控制在30—32℃，当曲坯品温升至35℃时，揭去竹垫子；继续培养至曲坯品温降至25—28℃，然后将其在35℃下烘干；此曲坯即为种曲；

取烘干后的种曲400g捣碎，加入适量水，于65℃糖化24h；过滤，向滤液中加入20g葡萄糖，再将滤液补水至1000ml，调pH至6.5；121℃灭菌20min，即制得米曲汁培养基；

②制麸皮纯种酵母

于三角瓶中装200ml步骤①所制得的米曲汁培养基，121℃灭菌20min；冷却后，将保藏编号为CCTCC NO.M2013091的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y19试管纯培养物接种其中，摇床培养20—24小时；再接种到经过灭菌的麸皮培养基中，30℃下培养30—36小时；将麸皮培养物35℃下干燥6—8小时，制成麸皮纯种酵母；

③土曲的制备

将膨润土粉碎后过14目筛，米糠过16目筛，将步骤①制得的种曲碾碎后过20目筛；先将种曲与步骤②制得的麸皮纯种酵母及米糠混合均匀，再加入膨润土搅匀，其中种曲∶麸皮纯种酵母∶膨润土∶米糠的重量份比为1∶0.1∶75∶25;得混合料；加水至上述混合料中，使混合料中含水量为50%；搅匀，将混合料制成直径为7—8cm的球形曲坯，并将此曲坯置于培养室内的培养箱内，在曲坯上铺竹垫，控制培养室内温度在28—30℃之间，培养16—18小时；当曲坯品温升至34—35℃时，揭开竹垫，待曲坯品温降至25—26℃时，继续培养110—120小时；培养结束后，将曲坯置于烘房内于35—40℃下烘干，即制得土曲；

④制备小曲原酒

高粱经浸泡、初蒸、闷水和复蒸后，再将其摊凉至35—40℃，按1%的接种量加入步骤③所制得的土曲，将土曲与蒸熟高粱搅匀后，糖化24—28h，得粮醅；按粮醅∶配糟的重量比为1∶1.2的比例添加配糟，并控制所添加的配糟酸度为0.5—0.6mmol/L，再将配糟后的粮醅冷风降温至11—12℃后，入池发酵16—20天，蒸馏，即得小曲原酒；经检测，原酒中的杂醇油含量为82.75mg/100ml。

按实施例1所公开的相同的方法步骤分别再制备两个批次的小曲原酒，经检测，原酒中的杂醇油含量分别为79.27mg/100ml和92.18mg/100ml，三个批次的平均值为84.73mg/100ml。

而本公司现有发酵方法所生产的小曲原酒，采用GBT10345-2007的方法测定其杂醇油含量，平均值为110mg/100ml。本发明所提供的保藏编号为CCTCC NO.M2013091的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y19按实施例1的方法用于小曲原酒的生产，与现有方法相比可降低杂醇油含量24.7%，实现了本发明的目的。

本发明生产的酒体风味清香纯正，入口绵甜，香味协调，尾净爽口，风格典型，饮用后不上头。                  

                                  序列表

<110>  劲牌有限公司

<120>  低产杂醇油酵母及其在降低小曲原酒杂醇油含量中的应用

<130>  2013

<160>  1     

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  810

<212>  DNA

<213>  酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y19

<400>  1

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