碳纳米粒子修饰电极电化学发光测定博来霉素的方法

摘要

一种博来霉素（BLMs）含量的检测方法，属于电化学发光和传感器技术领域。利用电化学发光试剂标记DNA制备DNA探针（Ru-DNA），将羧基化的碳纳米粒子修饰电极，通过静电斥力和π-π堆积作用之间的竞争作用，利用DNA与碳纳米粒子非共价键自组装原理构建了碳纳米粒子修饰电极电化学发光生物传感器。将目标物博来霉素与DNA探针作用，导致DNA被切割，吸附在碳纳米粒子修饰电极上DNA探针减少，产生的弱的电化学发光信号，以此实现对博来霉素的测定。这种方法有着简单、快速的优势。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学与电化学发光传感器领域，具体为一种碳纳米粒子修饰电极电化学发光测定博来霉素的方法及应用。

技术背景

对于现代生化学科和生物医学研究来说，灵敏、准确测量与疾病有关的蛋白质在很多方面是至关重要的，特别是对于癌症早期特征蛋白的检测和精准预测具有重要的意义。免疫检测是一种强有力的分析测定技术，其已被广泛用于肿瘤标记物的检测分析。由于抗体具有高特异性和强的识别作用，因而被用作识别元素。然而，由于抗体在其生产、产品的稳定性以及临床操作上的缺陷，人们正在寻求其替代品。

DNA生物传感器是一种能够将与DNA相互作用的目标物转变成可检测的光、电等信号的传感装置，利用DNA与目标物的相互作用可以建立许多用于生命科学研究的检测技术。DNA生物传感器是一种强有力的分析测试方法，在许多方面可以替代传统的基于抗原抗体建立的分析方法。DNA生物传感器是迅速发展起来的全新的生物传感器，开辟了分子生物学与电化学，光谱学等学科的新研究领域，为生命科学的研究提供了新技术、新方法，对临床医学以及遗传工程的研究具有深远的意义。

电化学发光（电致化学发光），简称ECL，是通过电极对含有化学发光物质的体系施加一定的电压或通过一定的电流，电极氧化还原产物之间或电极氧化还原产物与体系其它共存物质之间发生化学反应并生成某种不稳定的中间态物质，该物质分解而产生的化学发光现象。电化学发光技术是电化学与化学发光相结合的检测技术，该技术既集成了发光与电化学分析技术的优点，又具有二者结合产生的可控性、选择性、重现性好、灵敏度高、检测限低及动力学响应范围宽等新优势。 

博来霉素（Bleomycins，BLMs，BLM）是一类糖肽类抗生素。它是日本科学家梅泽滨于1996年首次从轮枝链霉菌的培养液中分离得到。薄来霉素在氧气和氧化还原金属离子（如Fe²⁺等）的存在下可以选择性地切断单链DNA或双链DNA，从而将癌细胞杀死。基于此机理，薄来霉素和金属离子的复合物被广泛应用于皮肤癌、肺癌、食管癌、脑癌等多种癌症的辅助治疗。目前已报道的博来霉素的测定方法有荧光法（Feng Li, Yan Feng, Can Zhao, Peng Li and Bo Tang, A sensitive graphene oxide–DNA based sensing platform for fluorescence “turn-on” detection of bleomycin, Chem. Comm., 2012, 48:127; Yoshitsugu Akiyama, Qian Ma, Erin Edgar, Andrei Laikhter and Sidney M Hecht, A novel DNA hairpin substrate for bleomycin, Org. Lett., 2008, 10:2127）和电化学发光法等（Honglan Qi, Xiaoying Qiu, Chen Wang, Qiang Gao and Chengxiao Zhang，Anal. Methods, 2013, 5:612）。本发明建立了一种羧基化碳纳米粒子修饰金电极电化学发光生物传感器，并用其测定博来霉素。所提供的是一种简单而灵敏的电化学发光传感技术，利用本发明实现了博来霉素的测定。

发明内容

针对现有技术的不足以及本领域研究和应用的需求，本发明的目的是提供一种简单而灵敏的电化学发光传感技术，利用本发明实现了博来霉素的测定；同时本发明还可应用到其他对DNA具有切割作用的蛋白质类抗生素的测定，也可以很容易地扩展为多功能即时检测装置。

本发明的目的通过以下技术方案实现：碳纳米粒子修饰电极电化学发光生物传感器测定博来霉素的方法，具体包括以下步骤：

  碳纳米粒子修饰电极电化学发光生物传感器的建立，其特征在于具体包括以下步骤：

羧基化碳纳米粒子（cCNP）制备：将0.1~1.0 g聚乙烯醇溶解在10 ml水中制得均相溶液，然后放入微波炉（600 W）加热9.5分钟（min）至溶液颜色改变。将上述溶液以13000 rpm离心30 min去除杂质，得碳纳米粒子；

 将0.1~2.0克碳纳米粒子与0.5 mL 63%的硝酸和0.5 mL二甲基甲酰胺混合后在100摄氏度下反应8小时（h），得羧基化碳纳米粒子；

所述的电化学发光探针，具体制备步骤如下：

优选的，将200 μL 2 OD DNA加入200 μL 1.0×10^-3 mol/L Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS（二(2,2'-联吡啶) (2,2'-吡啶-4,4'-二碳酸)琥珀酰胺钌）。室温下振荡6~18 h。随后，在该溶液中加入100 μL 3 mol/L 醋酸钠和2.0 mL 冷无水乙醇，溶液在-16 ℃冷却24 h。然后在12000转速和-4 ℃下离心30 min。沉淀物用1 mL冷乙醇清洗三次，除去未反应的Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS。得Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS标记的DNA探针（电化学发光探针）用1.0 mL 0.10 mol/L 磷酸缓冲溶液溶解，储藏在-18 ℃中备用；

优选的，所述氨基化DNA序列部分为：5'-CGCTTTAAAAAAAGTG-(CH₂)₆-NH₂-3'（DNA，SEQ ID NO：1）。

修饰电极制备，具体制备步骤如下：

  金电极经1.0 μm，0.3 μm，0.05 μm的α-A1₂O₃抛光粉抛光后，用二次蒸馏水冲洗干净，并在超声波水浴中超声5 min，用高纯氮气吹干，备用；

将处理好的金电极浸入100 μL（10^-4 M）的巯基乙胺中，固定2~8 h（37℃）后，用磷酸缓冲溶液冲洗二次，取1 mL羧基化碳纳米粒子溶液，加入NHS 3.6 mg、EDC 7.2 mg，在37 °C下活化1 h，再将上述电极浸入其中，反应过夜，制得碳纳米粒子修饰电极；

利用静电斥力和π-π堆积作用之间的竞争作用，得碳纳米粒子修饰电极电化学发光生物传感器。

碳纳米粒子修饰电极电化学发光生物传感器测定博来霉素的方法，其特征在于具体包括以下步骤：

[0019]   优选的，在100 μL电化学发光探针中加入不同浓度的博来霉素样品溶液和0.1 mM的Fe²⁺，然后将修饰电极浸入其中反应一段时间，取出电极按常规方法测定电化学发光信号，根据电化学发光信号对博来霉素进行定量检测。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

通过静电斥力和π-π堆积作用之间的竞争作用，利用DNA与碳纳米粒子非共价键自组装原理构建了碳纳米粒子修饰电极电化学发光生物传感器；

利用构建的碳纳米粒子修饰电极电化学发光生物传感器建立了一种检测博来霉素的新方法。这种设计所采用的方法有着简单、快速的优势。因此，本发明涉及的电化学发光传感器在构建检测目标物的研究方法中体现出良好的发展前景。 

附图说明

图1为碳纳米粒子修饰电极电化学发光生物传感器及测定博来霉素原理图。

  图2为修饰电极在博来霉素与探针、Fe²⁺作用后的溶液中浸泡时间对电化学发光信号（ΔI_ECL）的影响关系图。

图3为电化学发光强度与博来霉素浓度的标准曲线图。

具体实施方式

以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例

1.实验部分

1.1仪器与试剂

1-（3-二甲氨基醛）-3-乙基二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），购于天津市巴斯夫化工有限公司；Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS（二(2,2'-联吡啶) (2,2'-吡啶-4,4'-二碳酸)琥珀酰胺钌，Ru）、HS-(CH₂)₆-NH₂购于Sigma-Aldrich。

所用人工合成DNA序列（北京赛百盛生物工程有限公司购得）如下：

5'-CGCTTTAAAAAAAGTG-(CH₂)₆-NH₂-3'（DNA，SEQ ID NO：1）。

CHI660B电化学工作站（上海辰华仪器公司）；Anke-TGL-16C飞翁牌高速离心机（上海市安亭科学仪器厂）；实验采用三电极系统：金电极及修饰金电极为工作电极，Ag/AgC1（饱和KCl）电极为参比电极，铂丝电极为对电极。

1.2实验步骤

1.2.1电化学发光探针的制备

200 μL 2 OD DNA加入200 μL 1.0×10^-3 mol/L Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS。室温下振荡6~18 h。随后，在该溶液中加入100 μL 3 mol/L 醋酸钠和2.0 mL 冷无水乙醇，溶液在-16 ℃冷却24 h。然后在12000转速和-4 ℃下离心30 min。沉淀物用1 mL冷乙醇清洗三次，除去未反应的Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS。得Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS标记的DNA探针（电化学发光探针）用1.0 mL 0.10 mol/L 磷酸缓冲溶液溶解，储藏在-18 ℃中备用。

1.2.2羧基化碳纳米粒子的制备

（1）碳纳米粒子的制备：将0.5 g聚乙烯醇溶解在10 ml水中制得均相溶液，然后放入微波炉（600 W）加热9.5 min至溶液颜色改变。将上述溶液以13000 rpm离心30 min去除杂质，再用透析膜（截留分子量2000）在纯净水中对其透析，持续4天以去除残余聚乙烯醇，得碳纳米粒子。

（2）利用碳纳米粒子制备羧基化碳纳米粒子：将1克碳纳米粒子与0.5 mL 63%的硝酸和0.5 mL二甲基甲酰胺混合后在100摄氏度下反应8 h。然后，将产物利用0.22 μM超滤膜进行过滤，将滤液离心10 min（14000 rmp条件下），并用二次蒸馏水洗涤三次，得羧基化碳纳米粒子，然后分散在二次蒸馏水中制备成浓度为2.0 mg/mL溶液。

1.2.3碳纳米粒子修饰电极的制备

  （1）金电极的预处理

  金电极经1.0 μm，0.3 μm，0.05 μm的α-A1₂O₃抛光粉抛光后，用二次蒸馏水冲洗干净，并在超声波水浴中超声5 min，用高纯氮气吹干。采用三电极系统检测，工作电极为金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，在K₃[Fe(CN)₆]溶液中，设置电压为0～0.8 V，对金电极进行循环伏安（CV）扫描。若氧化还原电流峰在0～100 mV内，则已说明电极表面已被处理好。否则重新处理，直至符合要求为止。测完后，用二次水冲洗电极，吹干电极表面，备用。

（2）修饰电极的制备

将上述处理好的金电极浸入100 μL（10^-4 M）的巯基乙胺中，固定4 h（37℃）后，用磷酸缓冲溶液冲洗二次，取1 mL羧基化碳纳米粒子溶液，加入NHS 3.6 mg，EDC 7.2 mg，在37 °C下活化1 h，再将上述电极浸入其中，反应过夜，制得碳纳米粒子修饰电极。

1.2.4博来霉素的检测

在100 μL电化学发光探针中加入不同浓度的博来霉素溶液和0.1 mM Fe²⁺，反应30 min。然后将碳纳米粒子修饰电极浸入其中，37 °C下反应7 min。用10 mM的磷酸缓冲溶液（pH 7.4）冲洗电极三次。以该电极作为工作电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，以电化学发光信号为分析信号，进行博来霉素的测定。参数设置为：高压800 V，放大级数为3，控制电位为0-1.30 V。

1.3结果与讨论

  实验原理

   如图1所示，在该发明中，利用分子识别后的切割作用，从而产生信号变化，据此建立了测定博来霉素的电化学发光生物传感器。利用单链DNA为分子识别元素，以博来霉素为分析测定对象，对该发明进行了验证。

设计了DNA部分序列（5'-CGCTTTAAAAAAAGTG-(CH₂)₆-NH₂-3'），将一个末端用Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS进行标记作为电化学发光信号探针。当博莱霉素存在，Ru-DNA被切割，形成片段DNA，其在碳纳米粒子修饰电极表面吸附量减少，电化学发光信号弱。当博莱霉素不存在时，溶液中的Ru-DNA不被切割，由于碳纳米粒子与DNA的静电斥力和π-π堆积作用，Ru-DNA被吸附在碳纳米粒子修饰电极表面，电化学发光信号强，据此实现对博来霉素的测定。

如图2所示，碳纳米粒子修饰电极浸泡在DNA探针、Fe²⁺、博来霉素样品作用后溶液时间对电化学发光信号（ΔI_ECL）具有影响。在1～5 min范围内，电化学发光信号强度随浸泡时间的增大而增强，5 min后电化学发光信号强度缓慢增加，直到7 min时达到最大值，大于7 min之后变化不大。因此确定碳纳米粒子修饰电极浸泡在DNA探针、Fe²⁺、博来霉素样品作用后溶液的最佳时间为7 min。

  本实施例中研究了金属离子对博来霉素 切割DNA反应的影响。在反应体系中分别加入Fe²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Ba²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺金属离子时，实验发现只有Fe²⁺有明显的作用，而其它金属离子则对博来霉素切割DNA不起作用。这表明博来霉素与DNA的氧化切割作用需Fe²⁺离子作为辅助因子形成复合物从而使DNA链断裂。

本实施例的线性范围及检出限如下：优选的，在最优条件下，实验考察了不同浓度博来霉素与电化学发光强度之间的关系，得到了检测博来霉素的标准曲线，线性范围及线性方程。当博来霉素的浓度在1.0×10^-10～3.0×10^-7 M之间时，体系的电化学发光强度随着博来霉素浓度的增大而增大（如图3所示）。非线性回归方程为ΔI_ECL = -5618.44*exp(-C/79.05) -1156.30*exp(-C/3.67) + 6933.49（ΔI_ECL为体系的电化学发光强度；C为博来霉素的浓度，10^-9 M；n = 7，R = 0.9980）。博来霉素的线性范围为1.0×10^-10～3.0×10^-8 M，线性回归方程为ΔI_ECL = 198.75C + 120.72。该方法检测限为4.0×10^-11 M （3σ）。对浓度5.0×10^-9 M 的博来霉素进行7次平行重复测定的RSD为3.5%，表明本发明有较好的重现性。