快速鉴定工艺葫芦种子真实性和/或品种纯度的方法

摘要

本发明公开的是鉴定工艺葫芦种子真实性和/或品种纯度的方法，以工艺葫芦的种子为材料，经单粒机械粉碎，加入蛋白质提取液，将所得到的蛋白质进行SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳对比分析，得到每粒待检测种子的电泳图谱，将每粒待检测种子的电泳图谱与标准种子的电泳图谱进行比较，得出待检测种子的真实性和/或品种纯度，本方法实验时间短、不受环境时间限制，结果准确、费用低，易于操作推广。

说明书

技术领域

本发明涉及种子纯度的鉴别，特别是一种鉴定工艺葫芦种子真实性/或品种纯度的方法。 

背景技术   

葫芦（学名：Lagenaria siceraria）是属于葫芦科葫芦属的一种爬藤植物，其果实也被称为葫芦。葫芦的果实在未成熟时可作为蔬菜食用，成熟后可加工成工艺品。因为工艺葫芦具有多变的造型和精湛工艺，日益受到人们的钟爱。近年来工艺葫芦种植，加工销售已经成为山东聊城市的一大支柱产业。工艺葫芦种类繁多，包括：大亚腰葫芦、小亚腰葫芦、细长柄锤形葫芦、粗长柄锤形葫芦、冬瓜葫芦、疙瘩葫芦、棒子葫芦、大瓢葫芦、小瓢葫芦、鹤首葫芦、三挺葫芦、鸡蛋葫芦、美国小手捻葫芦、苹果葫芦、小南瓜葫芦、新疆特大亚腰葫芦、本长葫芦、异形葫芦、中号葫芦等几十个品种。不同品种有不同的制作工艺和商业价值。

由于目前工艺葫芦种子的真实性/或品种纯度尚无确定的鉴定方法，在葫芦的生产与销售过程中，多因种子纯度不够而招致收入损失的情况发生；如何保护工艺葫芦种质资源也是急需解决的问题；开展工艺葫芦遗传改良也屡屡遇到困境。 

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种通过种子蛋白质SDS—PAGE电泳方法鉴定工艺葫芦种子真实性/或品种纯度的方法。 

本发明的技术方案是： 

鉴定工艺葫芦种子真实性和/或品种纯度的方法，以工艺葫芦的种子为材料，经单粒机械粉碎，加入蛋白质提取液，将所得到的蛋白质进行SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳对比分析，得到每粒待检测种子的电泳图谱，将每粒待检测种子的电泳图谱与标准种子的电泳图谱进行比较，得出待检测种子的真实性和/或品种纯度。

前面所述的方法，优选的方案在于：具体包括下列步骤： 

A）挑取1粒饱满的种子去壳称重，将种子粉碎至粉末状，加入3-5倍体积(g／mI)的预冷的盐溶蛋白提取液和聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP)0.002g，混匀后4℃下冰上静置3 -4 h，4 ℃，12 000 r/min ^－ 1 离心20min，取其上清液4℃保存备用；

B）配制种子蛋白电泳胶板：采用SDS—PAGE，其中，分离胶工作液浓度为10％，浓缩胶工作液浓度为2.5％；

C）单向垂直板电泳灌胶：灌好分离胶后，马上用枪沿玻璃板均匀地加入双蒸水以压平胶面，待分离胶凝固后，将双蒸水吸出，灌入浓缩胶，插入梳子，待浓缩胶凝固后拔掉梳子，移去胶板周围的胶条，将胶板旋转方向水平旋转，低玻璃槽朝内，放人电泳槽，加入电极缓冲液，内侧液面要没过内层玻璃，准备点样；

D）电泳:样品上样量20ul，与等量的上样缓冲液混合上样。电泳槽电极接上电源后，把电压调到200伏特，待前沿指示剂跑到浓缩胶和分离胶的分界线时，将电压调到150伏特。前沿指示剂到底后再延长30 min，停止电泳；

E）染色:去掉浓缩胶，在分离胶的左上角切去一个小角(以作记号，易辨点样顺序)，把胶板剥入盛有染色液的培养皿中，染色过夜（12-14h）；

F）脱色:取出胶板放人盛有脱色液的培养皿中脱色，每5～6 h更换一次脱色液，直至胶板底色褪去，蛋白谱带清晰可见；

G）将每粒待检测种子的电泳图谱与按照所述步骤A)-F)的方法得到的标准种子的电泳图谱进行比较，得出待检测种子的真实性和/或品种纯度。

前面所述的方法，优选的方案在于：步骤A）所述盐溶蛋白提取液的制备：准确称取2.922g NaC1固体溶于80 ml双蒸水中，后加蒸馏水至100ml。 

前面所述的方法，优选的方案在于：步骤B）所述分离胶工作液的制备方法是：配制40ml的分离胶工作液需加入：13.3ml的30%丙烯酰胺（Acr）+0.8%N，N’—甲叉双丙烯酰胺（Bis）混合溶液、10ml 1.5mTris（PH8.8)、0.4ml 10%SDS溶液、13.3ml蒸馏水、加3ml的1.5%过硫酸铵(AP)溶液。 

前面所述的方法，优选的方案在于：所用30％丙烯酰胺储液（Acr）+0.8%N，N’—甲叉双丙烯酰胺（Bis）混合溶液的制备：准确称取73.00g丙烯酰胺和2.00g N，N’-甲叉丙烯酰胺，各自溶解后，混合溶于200 ml双蒸水中，并用双蒸水定容到250 ml，滤纸过滤，4℃下于棕色瓶中避光保存备用。 

前面所述的方法，优选的方案在于：所用1.5mol/LTris-HCL（PH值8.8)的制备：准确称量18.17gTris溶于80ml双蒸水，加入0.23ml的四甲基乙二胺( TEMED)，并用双蒸水定容到100ml，再用的10mol/L的盐酸调PH值到8.8，于4℃保存备用。 

前面所述的方法，优选的方案在于：步骤B）所述浓缩胶工作液的制备方法是：配制10ml的分离胶工作液需加入：1.25ml30%丙烯酰胺（Acr）+0.8%N，N’—甲叉双丙烯酰胺（Bis）混合溶液、2.5ml 0.5MTris-HCL（PH6.8)、0.1ml 10%SDS溶液、5.65ml的蒸馏水、再加0.5ml的1.5%过硫酸铵(AP)溶液。 

前面所述的方法，优选的方案在于：所用0.5mol/LTris-HCL（PH6.8)的制备：准确称量Tris 6.07g溶于双蒸水中，加入0.46ml的四甲基乙二胺( TEMED)，并用双蒸水定容到100 ml，再用3 mol/L的盐酸调pH值到6.8，于4℃保存备用。 

前面所述的方法，优选的方案在于：所用10％SDS溶液的制备：准确称取10.0 g SDS溶于80 ml双蒸水中，加热促溶，不断搅拌，直至溶液澄清，加双蒸水定容到100 ml，避光保存备用。 

本发明提供的利用种子蛋白质SDS—PAGE电泳方法鉴定工艺葫芦种子真实性/或品种纯度的理论依据是：品种的差异实质上就是基因型的差异，同工酶和蛋白质作为基因的产物，能够反映品种DNA组成上的差异。利用种子盐溶蛋白来鉴定工艺葫芦种子真实性/或品种纯度，具有重要意义：（1）不受地区、季节、气候限制，一年四季均可进行；（2）结果准确、灵敏度高；（3）快速、费用低、便于推广；（4）降低种子销售过程中因种子纯度不够而可能招致收入损失的风险。 

本发明提供了一种鉴定工艺葫芦种子真实性/或品种纯度的方法。该方法包括以下步骤：（1）将待检测种子进行单粒机械粉碎，加入蛋白质提取液，提取得到每粒待检测种子的蛋白质。（2）将所得到的蛋白质进行SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳对比分析，得到每粒待检测种子的电泳图谱；（3）将每粒待检测种子的电泳图谱与按照所述步骤1)和2)的方法得到的标准种子的电泳图谱进行比较，得出待检测种子的真实性和/或品种纯度。该方法保留蛋白质电泳的特色和关键技术，具有灵敏度高、快速、费用低、便于推广等特点，并且结果准确、灵敏度高，降低种子销售过程中因种子纯度不够而可能招致收入损失的风险。发明的优点在于：本发明利用盐溶蛋白来鉴定工艺葫芦种子真实性/或品种纯度在以下四个方面具有重要意义：（1）不受地区、季节、气候限制，一年四季均可进行；（2）结果准确、灵敏度高；（3）快速、费用低、便于推广；（4）降低种子销售过程中因种子纯度不够而可能招致收入损失的风险。 

本发明所用的盐溶蛋白鉴定葫芦种子真实性/或品种纯度实验时间短、不受环境时间限制，结果准确、费用低，易于操作推广。 

本发明首次采用葫芦盐溶蛋白鉴定方法，鉴定葫芦种子真实性/或品种纯度，这为保护工艺葫芦种质资源，开展工艺葫芦遗传改良提供了一条新途径。 

附图说明

图1是工艺葫芦各品种盐溶蛋白标准图谱。其中，1：‘大瓢’葫芦，2：‘小瓢’葫芦，3：‘鹤首’葫芦，4：‘大亚腰‘葫芦，5：‘三挺’葫芦，6：‘小亚腰’葫芦，7：‘天鹅’葫芦，8：‘粗长柄锤形’葫芦，9：‘美国小手捻’葫芦，10：‘中号’葫芦。    图2是鉴定‘大瓢H3359’品种纯度的盐溶蛋白PAGE电泳谱带。 

图3是鉴定‘长柄锤形葫芦H833’品种真实性的盐溶蛋白PAGE电泳谱带。 

具体实施方式

下面结合实施例详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例中各种原料或设备均可从市场购买。 

实施例1工艺葫芦各品种盐溶蛋白标准图谱构建，包括下列步骤: 

A）、挑取1粒饱满的种子去壳称重，将种子粉碎至粉末状，加入3-5倍体积(g／ml)的预冷的盐溶蛋白提取液和聚乙烯吡咯烷酮K30 （PVP)0.003g，混匀后4℃下冰上静置3 -4 h，4 ℃，12 000 r/min ^－ 1 离心20min，取其上清液4℃保存备用。

B）、种子蛋白电泳胶板的配制。电泳采用SDS—PAGE，分离胶12％ ，浓缩胶5％ ，具体配制方法如下： 

C）、分离胶工作液。配制40ml的分离胶工作液需加入：13.3ml的30%丙烯酰胺（Acr）+0.8%N，N’—甲叉双丙烯酰胺（Bis）混合溶液、10ml 1.5mTris（PH8.8)、0.4ml 10%SDS溶液、13.3ml蒸馏水、加3ml的1.5%过硫酸铵(AP)溶液。

D）、浓缩胶工作液。配制10ml的分离胶工作液需加入：1.25ml30%丙烯酰胺（Acr）+0.8%N，N’—甲叉双丙烯酰胺（Bis）混合溶液、2.5ml 0.5MTris-HCL（PH6.8)、0.1ml 10%SDS溶液、5.65ml的蒸馏水、再加0.5ml的1.5%过硫酸铵(AP)溶液。 

E）、单向垂直板电泳灌胶时应注意：灌好分离胶后，马上用枪沿玻璃板均匀地加入双蒸水以压平胶面，待分离胶凝固后，将双蒸水吸出，灌入浓缩胶，插入梳子，待浓缩胶凝固后拔掉梳子，移去胶板周围的胶条，将胶板旋转方向(水平旋转，低玻璃槽朝内)，放人电泳槽，加入电极缓冲液，内侧液面要没过内层玻璃，准备点样。 

F）电泳:样品上样量20ul，与等量的上样缓冲液混合上样。电泳槽电极接上电源后，把电压调到200伏特，待前沿指示剂跑到浓缩胶和分离胶的分界线时，将电压调到150伏特。前沿指示剂到底后再延长30 min，停止电泳; 

G）染色:去掉浓缩胶，在分离胶的左上角切去一个小角(以作记号，易辨点样顺序)，把胶板剥入盛有染色液的培养皿中，染色2～3 h。

H）、脱色。取出胶板放人盛有脱色液的培养皿中脱色，每5～6 h更换一次脱色液，直至胶板底色褪去，蛋白谱带清晰可见。 

图1是工艺葫芦各品种盐溶蛋白标准图谱。通过对各工艺葫芦品种间的盐溶蛋白PAGE 电泳结果比较,可以发现其主要的蛋白谱带表现出高度的一致,如图1中66.2KD和45.0KD的蛋白带是大部分品种所共有的。而除这共有的蛋白带以外,各供试材料还有一些自己特有的蛋白带,如果对特定品种进行重复电泳检测,即可建立起本品种特有的、稳定的蛋白特征谱带。根据标准谱带,再结合待检测品种本身是否具备这些特征谱带,就可以对其进行相关纯度和真伪性的检测。 

实施例2  通过种子蛋白质SDS—PAGE电泳方法鉴定 工艺葫芦‘大瓢H3359’品种纯度。 

一种工艺葫芦种子品种纯度的方法，从每一单交种检测样品中随机抽取葫芦种子至少30粒，分别粉碎，将种子粉碎至粉末状，加入蛋白质提取液、将所得到的蛋白质进行SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳对比分析，得到每粒待检测种子的电泳图谱、将每粒待检测种子的电泳图谱与按照所述步骤A)---H)的方法得到的标准种子的电泳图谱进行比较，得出待检测种子的品种纯度。具体包括下列步骤：

A）配制盐溶蛋白提取液。准确称取2.922g NaC1固体溶于80 ml双蒸水中，后加蒸馏水至100ml(0.5 mol／L NaC1)。

电泳药品配方： 

B）30％丙烯酰胺储液（Acr）+0.8%N，N’—甲叉双丙烯酰胺（Bis）混合溶液。准确称取73.00g（ 75.00g）丙烯酰胺和2.00g N，N’-甲叉丙烯酰胺，各自溶解后，混合溶于200 ml双蒸水中，并用双蒸水定容到250 ml，滤纸过滤，4℃下于棕色瓶中避光保存备用。

C）1.5mol/LTris-HCL（PH值8.8)：准确称量18.17gTris溶于80ml双蒸水，加入0.23ml的四甲基乙二胺( TEMED)，并用双蒸水定容到100ml，再用的10mol/L的盐酸调PH值到8.8，于4℃保存备用。 

D）0.5mol/LTris-HCL（PH6.8)：准确称量Tris 6.07g溶于双蒸水中，加入0.46ml的四甲基乙二胺( TEMED)，并用双蒸水定容到100 ml，再用3 mol/L的盐酸调pH值到6.8，于4℃保存备用。 

E）10％SDS溶液。准确称取10.0 g SDS溶于80ml双蒸水中，加热促溶，不断搅拌，直至溶液澄清，加双蒸水定容到100 ml，避光保存备用。 

F）1.5%过硫酸铵(AP)溶液：准确称量AP 0.15g，加水溶解定容到10ml，待用，该溶液要现用现配。 

10％过硫酸铵。准确称取1.0 g过硫酸铵溶于8ml双蒸水中，并用双蒸水定容到10 ml，储存时间最长不能超过7 d。 

G）电极缓冲液(5×)。准确称取Tris 15.0 g，甘氨酸72.0g，SDS 5.0 g，溶于双蒸水中，并定容到l L。 

H）染色液。准确量取90 m1无水乙醇，20 ml冰乙酸和0.2g考马斯亮蓝R-250溶于50 ml 双蒸水中，定容到200 ml。 

I）脱色液。准确量取10 m1无水乙醇和10 ml冰乙酸混合溶于60 ml双蒸水中，用双蒸水定容到100 ml。 

J）上样缓冲液。准确称取0.05 g甲基绿和40.00 g蔗糖溶于80 ml 双蒸水中，并用双蒸水定容到100 ml。 

方法： 

A）挑取1粒饱满的种子去壳称重，将种子粉碎至粉末状，加入3-5倍体积(g／mI)的预冷的盐溶蛋白提取液和聚乙烯吡咯烷酮K30 （PVP)0.002-0.005g，混匀后4℃下冰上静置3 -4 h，4 ℃，12 000 r/min ^－ 1 离心20min，取其上清液4℃保存备用。

B）种子蛋白电泳胶板的配制。电泳采用SDS—PAGE，分离胶12％ ，浓缩胶5％ ，具体配制方法如下： 

C）分离胶工作液。配制40ml的分离胶工作液需加入：13.3ml的30%丙烯酰胺（Acr）+0.8%N，N’—甲叉双丙烯酰胺（Bis）混合溶液、10ml 1.5mTris（PH8.8)、0.4ml 10%SDS溶液、13.3ml蒸馏水、加3ml的1.5%过硫酸铵(AP)溶液。

D）浓缩胶工作液。配制10ml的分离胶工作液需加入：1.25ml30%丙烯酰胺（Acr）+0.8%N，N’—甲叉双丙烯酰胺（Bis）混合溶液、2.5ml 0.5MTris-HCL（PH6.8)、0.1ml 10%SDS溶液、5.65ml的蒸馏水、再加0.5ml的1.5%过硫酸铵(AP)溶液。 

E）单向垂直板电泳灌胶时应注意：灌好分离胶后，马上用枪沿玻璃板均匀地加入双蒸水以压平胶面，待分离胶凝固后，将双蒸水吸出，灌入浓缩胶，插入梳子，待浓缩胶凝固后拔掉梳子，移去胶板周围的胶条，将胶板旋转方向(水平旋转，低玻璃槽朝内)，放人电泳槽，加入电极缓冲液，内侧液面要没过内层玻璃，准备点样。 

F）电泳。样品上样量10ul，与等量的上样缓冲液混合上样。电泳槽电极接上电源后，把电压调到200伏特，待前沿指示剂跑到浓缩胶和分离胶的分界线时，将电流调到20 mA。前沿指示剂到底后再延长30 min，停止电泳。 

G）染色。去掉浓缩胶，在分离胶的左上角切去一个小角(以作记号，易辨点样顺序)，把胶板剥入盛有染色液的培养皿中，染色过夜（12-14h）。 

H）脱色。取出胶板放人盛有脱色液的培养皿中脱色，每5～6 h更换一次脱色液，直至胶板底色褪去，蛋白谱带清晰可见。 

I）将每粒待检测种子的电泳图谱与按照所述步骤A)-H)的方法得到的标准种子的电泳图谱进行比较，得出待检测种子的真实性和/或品种纯度。 

所述的盐溶蛋白质的提取液为NaC1、PVP，其中：NaC1为氯化钠，PVP为聚乙烯吡咯烷酮K30。所述的浓缩胶预工作液为：丙烯酰胺（Acr）、N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）、Tris-HCL、十二烷基硫酸钠（SDS）、四甲基乙二胺( TEMED)、过硫酸铵(AP)。所述的浓缩胶预工作液为：丙烯酰胺（Acr）、N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）、Tris-HCL、十二烷基硫酸钠（SDS）、四甲基乙二胺( TEMED)、过硫酸铵(AP)。所述的电泳电压为200伏特，电泳时间为30 min。所述的电泳缓冲液为：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸。所述的染色液为：无水乙醇、冰乙酸和考马斯亮蓝R-250。所述的脱色液为：无水乙醇、冰乙酸。所述的上样缓冲液为：甲基绿、蔗糖。 

在对各品种盐溶蛋白检测试验中,混杂籽粒的盐溶蛋白在进行电泳检测时往往会出现与其他种子不同的蛋白条带，如待检测品种‘大瓢H3359’在被检测籽粒的盐溶蛋白电泳图谱（说明书附图2）中,个别籽粒出现与其他盐溶蛋白不一样的条带 ,而其他籽粒的蛋白带型基本一致, 从而可以判断籽10 应该属于混杂籽粒(说明书附图 2) 。在对各检测样品进行纯度检测后,最终确定‘大瓢H3359’的种子纯度为92.4%。 

实施例3 通过种子蛋白质SDS—PAGE电泳方法快速鉴定 工艺葫芦‘粗长柄锤形葫芦’品种真实性。 一种鉴定工艺葫芦种子真实性的方法，以工艺葫芦的种子为材料，经单粒机械粉碎，加入蛋白质提取液，将所得到的蛋白质进行SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳对比分析，得到每粒待检测种子的电泳图谱，将每粒待检测种子的电泳图谱与标准种子的电泳图谱进行比较，得出待检测种子的真实性和/或品种纯度，具体包括下列步骤： 

A）挑取1粒饱满的种子去壳称重，将种子粉碎至粉末状，加入3-5倍体积(g／mI)的预冷的盐溶蛋白提取液和聚乙烯吡咯烷酮K30 （PVP)0.002g，混匀后4℃下冰上静置3 -4 h，4 ℃，12 000 r/min ^－ 1 离心20min，取其上清液4℃保存备用；

B）配制种子蛋白电泳胶板：采用SDS—PAGE，其中，分离胶工作液浓度为10％，浓缩胶工作液浓度为2.5％；

C）单向垂直板电泳灌胶：灌好分离胶后，马上用枪沿玻璃板均匀地加入双蒸水以压平胶面，待分离胶凝固后，将双蒸水吸出，灌入浓缩胶，插入梳子，待浓缩胶凝固后拔掉梳子，移去胶板周围的胶条，将胶板旋转方向水平旋转，低玻璃槽朝内，放人电泳槽，加入电极缓冲液，内侧液面要没过内层玻璃，准备点样；

D）电泳:样品上样量20ul，与等量的上样缓冲液混合上样。电泳槽电极接上电源后，把电压调到200伏特，待前沿指示剂跑到浓缩胶和分离胶的分界线时，将电压调到150伏特。前沿指示剂到底后再延长30 min，停止电泳；

E）染色:去掉浓缩胶，在分离胶的左上角切去一个小角(以作记号，易辨点样顺序)，把胶板剥入盛有染色液的培养皿中，染色过夜（12-14h）；

F）脱色:取出胶板放人盛有脱色液的培养皿中脱色，每5～6 h更换一次脱色液，直至胶板底色褪去，蛋白谱带清晰可见；

G）将每粒待检测种子的电泳图谱与按照所述步骤A)-F)的方法得到的标准种子的电泳图谱进行比较，得出待检测种子的真实性和/或品种纯度。

步骤A）所述盐溶蛋白提取液的制备：准确称取2.922g NaC1固体溶于80 ml双蒸水中，后加蒸馏水至100ml。步骤B）所述分离胶工作液的制备方法是：配制40ml的分离胶工作液需加入：13.3ml的30%丙烯酰胺（Acr）+0.8%N，N’—甲叉双丙烯酰胺（Bis）混合溶液、10ml 1.5mTris（PH8.8)、0.4ml 10%SDS溶液、13.3ml蒸馏水、加3ml的1.5%过硫酸铵(AP)溶液。所用30％丙烯酰胺储液（Acr）+0.8%N，N’—甲叉双丙烯酰胺（Bis）混合溶液的制备：准确称取73.00g丙烯酰胺和2.00g N，N’-甲叉丙烯酰胺，各自溶解后，混合溶于200 ml双蒸水中，并用双蒸水定容到250 ml，滤纸过滤，4℃下于棕色瓶中避光保存备用。所用1.5mol/LTris-HCL（PH值8.8)的制备：准确称量18.17gTris溶于80ml双蒸水，加入0.23ml的四甲基乙二胺( TEMED)，并用双蒸水定容到100ml，再用的10mol/L的盐酸调PH值到8.8，于4℃保存备用。步骤B）所述浓缩胶工作液的制备方法是：配制10ml的分离胶工作液需加入：1.25ml30%丙烯酰胺（Acr）+0.8%N，N’—甲叉双丙烯酰胺（Bis）混合溶液、2.5ml 0.5MTris-HCL（PH6.8)、0.1ml 10%SDS溶液、5.65ml的蒸馏水、再加0.5ml的1.5%过硫酸铵(AP)溶液。所用0.5mol/LTris-HCL（PH6.8)的制备：准确称量Tris 6.07g溶于双蒸水中，加入0.46ml的四甲基乙二胺( TEMED)，并用双蒸水定容到100 ml，再用3 mol/L的盐酸调pH值到6.8，于4℃保存备用。所用10％SDS溶液的制备：准确称取10.0 g SDS溶于80ml双蒸水中，加热促溶，不断搅拌，直至溶液澄清，加双蒸水定容到100 ml，避光保存备用。 

结果表明：在对‘粗长柄锤形葫芦’品种真实性检测试验中,混杂籽粒的盐溶蛋白在进行电泳检测时往往会出现与标准谱带不同的蛋白条带，如待检测品种‘粗长柄锤形葫芦H833’在被检测籽粒的盐溶蛋白电泳图谱（图3）中：2、4号种子出现与其他盐溶蛋白不一样的条带 ，而其他籽粒的蛋白带型基本一致， 从而可以判断籽2、4 应该属于混杂籽粒(图 3) 。在对各检测样品进行纯度检测后,最终确定‘长柄锤形葫芦H833’种子的真实性为86.7%。 

本发明在聊城大学博士科研启动经费和山东省自然科学基金（ ZR2011CL010 ）资助下得以完成。