一种具有抗肿瘤活性的裂片石莼硫酸多糖的制备方法

摘要

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的裂片石莼硫酸多糖的制备方法：将裂片石莼粉碎后用水超声提取，醇沉制得粗多糖，用装填有弱碱性阴离子交换树脂的径向流色谱柱进行脱色素脱蛋白，洗脱后按分子量进行超滤分离，取分子量10KD至30KD的裂片石莼多糖组分加入装填有DEAE琼脂糖凝胶的径向流色谱柱进行富集提纯，制备的平均分子量为20KD多糖具有显著的抗肿瘤活性。

说明书

技术领域

本发明涉及海洋藻类多糖的研究与开发，具体涉及一种具有抗肿 瘤活性的裂片石莼硫酸多糖的制备方法及其应用，属于海洋生物技术 领域。

背景技术

海洋面积辽阔，海洋藻类植物来源丰富，海藻多糖正逐步成为生 物多糖的主要来源之一。海藻多糖具有很高的药用价值，在提高人体 非特异性免疫功能、抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、降血糖、降 血脂方面具有显著的作用。海藻多糖中的活性物质多为D-葡萄糖、 D-甘露糖、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸等单糖组成的水溶性酸性、中 性多糖。

目前多糖提取采用了不同的方法，包括溶剂提取法、酸提法、碱 提法、微波法等。提取后粗多糖中蛋白质和色素的脱除同样是其分离 工程中的重要步骤之一。目前多糖脱除蛋白质和色素往往采用化学 法，继而采用轴向色谱DEAE层析进行分级纯化，但存在产品产量 低、耗时长、分离效率低、压降大等缺点，特别对于海藻粘性多糖， 轴向色谱分离易造成压降大，效率低下。径向流色谱是一种新型色谱 分离纯化技术，独特的径向流动设计，使其相对于传统的轴向色谱， 具有流速高、操作压力低、线性放大等优势。

裂片石莼属于绿藻门、绿藻纲、石莼目、石莼科、石莼属。石莼 是重要的大型经济藻类，广泛分布于西太平洋沿海地区，在我国沿海 均有分布，市场上价格便宜，其中含有的多糖多为粘性多糖，粘性系 数高。

肿瘤严重威胁人类健康，临床上治疗该疾病的药物，一般都是化 学合成的抗肿瘤药，通常具有一定的毒副作用。从植物、微生物及海 洋生物中提取的天然药物具有安全低毒副作用、生物相容性好、可生 物降解的优点。近年来抗癌上市的新药中，60%来自天然产物。多糖 类化合物的活性存在一种间接的抗肿瘤活性，即由免疫体系传递的活 性，因此毒性极小，不会对人体造成伤害。采用化学方法分离纯化多 糖往往反应条件剧烈，会导致多糖构象发生变化，活性基团易受破坏， 产物质量不稳定等缺点，进而严重影响多糖生物活性。

公开号为CN200610026830.7公开了一种蜈蚣藻多糖提取物在制 备抗肿瘤及其它药物中的应用，但该方法只涉及蜈蚣藻粗多糖的提 取，并没有将其进行进一步的纯化分离。公开号为CN101921346A公 开了一种香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法，该方法提供了一种 将径向流色谱应用于粗多糖分离的方法。公开号为CN101709094A 公开了一种超滤膜分离甜茶多糖的方法，该方法前期预处理需进行脱 色素等步骤，且经过两次不同规格的超滤膜超滤，才能获得不同分子 量多糖。

发明内容

本发明的内容在于提供一种具有抗肿瘤活性的裂片石莼硫酸多 糖的制备方法，并提出所制得的石莼硫酸多糖可作为抗肿瘤药物的新 用途。

本发明的提取分离方法主要是超声波水提醇沉获得裂片石莼粘 性粗多糖；径向流色谱技术脱盐脱蛋白；按照分子量大小超滤处理， 分离出10KD至30KD裂片石莼多糖组分；再继续经过径向流离子交 换分离多糖组分，获得目的多糖产物。其中多糖目的产物具有明显抗 肿瘤活性。

本发明采用的技术方案是：

一种具有抗肿瘤活性的裂片石莼硫酸多糖的制备方法，所述方法 包括以下步骤：

(1)将裂片石莼洗净、干燥后粉碎，过100目筛，得颗粒均匀的 粉碎物；

(2)称取步骤(1)得到的粉碎物，加入质量为粉碎物60～70倍的 蒸馏水，在400-500W的超声条件下提取30～40分钟，然后冷却静置 （通常静置1～2h），离心分离，取上清液a；

(3)将步骤(2)得到的上清液a旋转蒸发浓缩至体积为原体积的 10%～15%，加入体积分数95%的乙醇溶液使乙醇的终体积浓度为 80%，静置10～20小时，离心分离，所得沉淀冷冻干燥，得粗多糖a；

(4)将步骤(3)得到的粗多糖a加水配制成质量浓度5～10mg/ml 的溶液，离心分离后，取上清液b过0.45μm微孔滤膜，得滤液b；

(5)将步骤(4)得到的滤液b加入装填有弱碱性阴离子交换树脂 的径向流色谱柱中进行脱色素脱蛋白，上样后用蒸馏水洗脱，径向流 色谱的条件为：上样流速/柱高为1-2ml/（min·cm），洗脱速度/柱高为 8-12ml/（min·cm），洗脱至流出液不再发生苯酚-硫酸法显色反应，表 示洗脱完毕，收集所有洗脱液，浓缩、冷冻干燥得粗多糖b；

(6)将步骤(5)得到的粗多糖b加水配制成质量浓度3～10mg/ml （优选5mg/ml）的溶液，通过100KD的超滤膜，膜压力控制在 0～30psi，收集截留液A，浓缩、冷冻干燥得分子量100KD以上的裂 片石莼多糖组分A，将滤过液A再通过30KD的超滤膜，膜压力控制 在0～30psi，收集截留液B，浓缩、冷冻干燥得分子量30KD至100KD 的裂片石莼多糖组分B，将滤过液B再通过10KD的超滤膜，膜压力 控制在0～30psi，收集截留液C，浓缩、冷冻干燥得分子量10KD至 30KD的裂片石莼多糖组分C，滤过液C浓缩、冷冻干燥得分子量 10KD以下的裂片石莼多糖组分D；

(7)称取步骤(6)所得的分子量10KD至30KD的裂片石莼多糖 组分C加水配制成质量浓度5～10mg/ml的溶液，离心分离后，取 上清液c过0.45μm微孔滤膜，得滤液c；将滤液c加入装填有DEAE 琼脂糖凝胶（英文DEAE-Sepharose Fast Flow）的径向流色谱柱中， 上样后用蒸馏水洗脱，径向流色谱的条件为：上样流速/柱高为1-2ml/ （min·cm），洗脱速度/柱高为8-12ml/（min·cm），洗脱至流出液不再 发生苯酚-硫酸法显色反应，表示洗脱完毕，检测洗脱液中多糖成分 的分子量，收集分子量范围为18～22KD（优选分子量范围为20KD） 的洗脱液，浓缩、冷冻干燥得到平均分子量为20KD的多糖组分，即 为裂片石莼硫酸多糖。

本发明方法中所述的离心分离，通常是在10000r/min转速下， 0～10℃温度下离心10～15分钟。

本发明所述步骤（1）中，所述干燥是在55～65℃温度下烘干。

所述步骤（5）中，所述弱碱性阴离子交换树脂为A103S、A105 或A100，优选A103S。

本发明还提供按照本发明上述方法制备得到的平均分子量为 20KD的多糖组分，即裂片石莼硫酸多糖。所述裂片石莼硫酸多糖具 有抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。本发明实施例数据表明，制 得的裂片石莼硫酸多糖对胃癌MKN45细胞和结肠腺癌DLD细胞的 抑制作用呈现剂量和时间依赖关系，当裂片石莼硫酸多糖浓度为800 μg/ml与作用72h时，对MKN45最大抑制率为72.3％，对结肠腺癌 DLD细胞最大抑制率达47.5%。因此，本发明提供的裂片石莼硫酸多 糖可用于制备抗胃癌或抗结肠腺癌的药物。

与已有的技术相比较，本发明的有益效果如下：

1、建立了一套从原料到产品的裂片石莼硫酸多糖物理分离工艺， 有利于最大限度保存多糖活性，该工艺具有分离纯化条件温和、不破 坏多糖结构、成本低、对环境友好、适于工业化生产等优点，并且适 用于大规模生产，可大幅度降低精制海藻多糖的工艺成本。

2、彻底摆脱了传统海藻多糖的生产工艺，完全不涉及有机溶剂脱 蛋白、单元脱色等高耗能、耗材料的过程，在降低成本的同时快速高 效地制备裂片石莼硫酸多糖。

3、采用径向流色谱脱蛋白脱色—按分子量超滤分离—径向流色谱 富集三步串联耦和分离过程，第一次径向流色谱采用弱碱性阴离子交 换树脂填料，用于脱蛋白脱色，第二次径向流色谱采用DEAE-琼脂 糖凝胶填料，进行富集提纯，这两次径向流色谱的目的不同，所采用 的填料不同，产生不同的分离效果，并首次将DEAE-琼脂糖凝胶填 料用于径向流色谱中，可进行大批量制备生产。本发明方法具有不损 害活性、分离效率高、设备简单、可连续生产、无污染等优点，可以 实现蛋白脱除率达95%，色素脱除率92%。制备的平均分子量为20KD 多糖具有显著的抗肿瘤活性，其可用于制备抗肿瘤和调节免疫的药品 或保健品等。

具体实施方式

下面以具体实施例来对本发明作进一步说明，但本发明的保护范 围不限于此。

实施例1

（1）将裂片石莼洗净、60℃下烘干、粉碎得粉末，过100目筛， 得颗粒均匀的粉碎物。

（2）称取步骤(1)中粉碎物60g，以料液比1:60加入3600ml、 pH7.0的蒸馏水，以超声功率480W进行超声波辅助提取30min。 冷却静置1h，以转速10000r/min、温度4℃离心10min，得上清液 和沉淀。

(3)将步骤(2)得到的上清液旋转蒸发浓缩至体积为原体积的 1/10，加入体积分数95%的乙醇溶液使乙醇的终体积浓度为80%，放 置15小时，1000r/min，4℃离心10min，所得沉淀冷冻干燥，得该 乙醇浓度下粗多糖12.0g。

(4)称取步骤(3)所得粗多糖加水配制成10mg/ml的溶液， 10000r/min，4℃离心15min后，取上清液过0.45μm微孔滤膜，得 滤过液。

(5)将步骤(4)得到的滤过液加入装填有A103S填料的径向流色 谱柱中进行脱色素脱蛋白，上样流速5ml/min，用蒸馏水以40ml/min 的流速对样品进行洗脱，采用自动部分收集器进行收集，洗脱至流出 液不再发生苯酚-硫酸法显色反应，证明多糖已全部洗脱完毕，收集 所有洗脱液，浓缩、冷冻干燥后可得10.0g的粗多糖备存，检测蛋白 脱除率达95%，色素脱除率达92%。所用径向流色谱为美国Sepragen 公司的型号SUPERFLO-250COLUMN的径向流色谱柱，其柱体积为 250ml、内径1.5cm和外径7.8cm，柱高5cm。

(6)将步骤(5)得到的10g粗多糖加入2000ml的蒸馏水配置成 5mg/ml的粗多糖溶液，通过100KD的超滤膜，膜压力控制在30psi 以下，收集截留液A，浓缩、冷冻干燥得分子量100KD以上的裂片 石莼多糖组分A3.2g，将滤过液A再通过30KD的超滤膜，膜压力控 制在30psi以下，收集截留液B，浓缩、冷冻干燥得分子量30KD至 100KD的裂片石莼多糖组分B2.3g，将滤过液B再通过10KD的超 滤膜，膜压力控制在30psi以下，收集截留液C，浓缩冷冻干燥得分 子量10KD至30KD的裂片石莼多糖组分C3.7g，滤过液C浓缩、冷 冻干燥得分子量10KD以下的裂片石莼多糖组分D0.8g。

(7)称取步骤(6)超滤所得分子量10KD至30KD的裂片石莼多 糖组分C加水配制成10mg/ml的溶液，10000r/min，4℃离心15min 后，取上清液过0.45μm微孔滤膜，得滤过液。将滤过液加入装填有 DEAE-琼脂糖凝胶的径向流色谱柱中，上样流速为5ml/min，用蒸馏 水以40ml/min的流速对样品进行洗脱，采用自动部分收集器进行收 集，洗脱至流出液不再发生苯酚-硫酸法显色反应，证明多糖已全部 洗脱完毕，检测洗脱液中多糖成分的分子量，收集分子量范围为 18～22KD的洗脱液，检测其中硫酸根含量为11.23%，将洗脱液浓缩、 冷冻干燥，可得平均分子量为20KD的多糖组分，即裂片石莼硫酸多 糖目标产物，得到0.48g。

步骤(7)所得裂片石莼硫酸多糖为浅褐色粉末，用DMEM培养基 分别配制成一系列浓度溶液，MTT法测定其对人胃癌MKN45细胞 和结肠腺癌DLD细胞体外增殖的抑制能力。结果表明，该多糖对胃 癌MKN45细胞和结肠腺癌DLD细胞的抑制作用呈现剂量和时间依 赖关系，当多糖浓度为800μg/ml与作用72h时，对MKN45最大抑 制率为72.3％，对结肠腺癌DLD细胞最大抑制率达47.5%。

实施例2

（1）将裂片石莼洗净、60℃下烘干、粉碎得粉末，过100目筛， 得颗粒均匀的粉碎物。

（2）称取步骤(1)中粉碎物60g，以料液比1:70加入4200ml、 pH7.0的蒸馏水，以超声功率500W进行超声波辅助提取40min。 冷却静置1h，以转速10000r/min、温度4℃离心10min，得上清液 和沉淀。

(3)将步骤(2)得到的上清液旋转蒸发浓缩至体积为原体积的 1/10，加入体积分数95%的乙醇溶液使乙醇的终体积浓度为80%，放 置20小时，1000r/min，4℃离心10min，所得沉淀冷冻干燥，得该 乙醇浓度下粗多糖12.8g。

(4)称取步骤(3)所得粗多糖加水配制成10mg/ml的溶液， 10000r/min，4℃离心15min后，取上清液过0.45μm微孔滤膜，得 滤过液。

(5)将步骤(4)得到的滤过液加入装填有A103S填料的径向流色 谱柱中进行脱色素脱蛋白，上样流速5ml/min，用蒸馏水以40ml/min 的流速对样品进行洗脱，采用自动部分收集器进行收集，洗脱至流出 液不再发生苯酚-硫酸法显色反应，证明多糖已全部洗脱完毕，收集 所有洗脱液，浓缩、冷冻干燥后可得10.6g的粗多糖备存，检测蛋白 脱除率达92%，色素脱除率达92%。所用径向流色谱为美国Sepragen 公司的型号SUPERFLO-250COLUMN的径向流色谱柱，其柱体积为 250ml、内径1.5cm和外径7.8cm，柱高5cm。

(6)将步骤(5)得到的10.6g粗多糖加入2000ml的蒸馏水配置成 5mg/ml的粗多糖溶液，通过100KD的超滤膜，膜压力控制在30psi 以下，收集截留液A，浓缩、冷冻干燥得分子量100KD以上的裂片 石莼多糖组分A3.3g，将滤过液A再通过30KD的超滤膜，膜压力控 制在30psi以下，收集截留液B，浓缩、冷冻干燥得分子量30KD至 100KD的裂片石莼多糖组分B2.5g，将滤过液B再通过10KD的超 滤膜，膜压力控制在30psi以下，收集截留液C，浓缩冷冻干燥得分 子量10KD至30KD的裂片石莼多糖组分C3.9g，滤过液C浓缩、冷 冻干燥得分子量10KD以下的裂片石莼多糖组分D0.9g。

(7)称取步骤(6)超滤所得分子量10KD至30KD的裂片石莼多 糖组分C加水配制成10mg/ml的溶液，10000r/min，4℃离心15min 后，取上清液过0.45μm微孔滤膜，得滤过液。将滤过液加入装填有 DEAE-琼脂糖凝胶的径向流色谱柱中，上样流速为5ml/min，用蒸馏 水以40ml/min的流速对样品进行洗脱，采用自动部分收集器进行收 集，洗脱至流出液不再发生苯酚-硫酸法显色反应，证明多糖已全部 洗脱完毕，检测洗脱液中多糖成分的分子量，收集分子量范围为 18～22KD（优选分子量范围为20KD）的洗脱液，检测其中硫酸根含 量为11.29%，将洗脱液浓缩、冷冻干燥，可得平均分子量为20KD 的多糖组分，即裂片石莼硫酸多糖目标产物，得到0.50g。

步骤(7)所得裂片石莼硫酸多糖为浅褐色粉末，用DMEM培养基 分别配制成一系列浓度溶液，MTT法测定其对人胃癌MKN45细胞 和结肠腺癌DLD细胞体外增殖的抑制能力。结果表明，该多糖对胃 癌MKN45细胞和结肠腺癌DLD细胞的抑制作用呈现剂量和时间依 赖关系，当多糖浓度为800μg/ml与作用72h时，对MKN45最大抑 制率为71.7％，对结肠腺癌DLD细胞最大抑制率达48.2%。

本发明的工艺方法具有分离纯化条件温和、不破坏多糖结构、成本 低、对环境友好、适于工业化生产等优点，制备的平均分子量为20KD 的裂片石莼多糖具有显著的抗肿瘤活性，因此具有广阔的应用前景， 其可用于制备抗肿瘤和调节免疫的药品或保健品等。