尿路感染的诊断方法

摘要

已经证明尿HBP的水平在患有尿路感染的个体中增加。因此，个体中尿HBP的水平可用于确定个体是否患有尿路感染。

说明书

发明领域

本发明涉及尿路感染的诊断和治疗。

发明背景

尿路感染（UTI）是常见的可在儿童和成人中引起严重并发症的诊断。有效的诊断和治疗对于减少肾衰竭的风险和过度使用抗生素是重要的。需要快速且安全的诊断方法作为细菌培养的替代。早治疗改善了尿路感染的预后，从而早诊断是至关重要的。尽可能早地确定个体是否患有尿路感染的可靠的生物或临床标志物是需要的。

发明概述

肝素结合蛋白（HBP，CAP37，Azurocidin）是与人嗜中性白细胞弹性蛋白酶显示44%序列同一性的一种糖基化的、单链、带正电的37kDa无活性丝氨酸蛋白酶同源物。已公布了HBP的三维结构（Iversen等人NatStruct Biol.1997Apr;4(4):265-8）。它被包含在人嗜中性白细胞的嗜天青颗粒和分泌囊泡中（Lindmark等人,J Leukoc Biol1999;66(4):634-43和Tapper等人,Blood 2000;96:2329-2337）。它是已显示通过改变血管细胞骨架的Ca²⁺平衡来引起血管渗漏的多功能蛋白（Gautam等人,Nature Medicine2001;7(10):1123-7）。与纤维蛋白原复合的A链球菌群（group Astreptococci，GAS）的M蛋白已显示通过刺激嗜中性白细胞的B2整联蛋白受体而引起HBP释放（Herwald等人,Cell 2004;116(3):367-79）。LPS还可以通过未知机制引起HBP释放（Rasmussen等人,FEBS Lett 1996;390(1):109 12）。HBP的序列是可公开获得的（例如以NCBI登录号NP_001691 REGION:27..248获得)且在以下被再现为SEQ ID NO.1

SEQ ID NO：1

IVGGRKARPRQFPFLASIQNQGRHFCGGALIHARFVMTAASCFQSQNPGVSTVVLGAYDLRRRE

RQSRQTFSTSSMSENGYDPQQNLNDLMLLQLDREANLTSSVTILPLPLQNATVEAGTRCQVAGW

GSQRSGGRLSRFPRFVNVTVTPEDQCRPNNVCTGVLTRRGGICNGDGGTPLVCEGLAHGVASFS

LGPCGRGPDFFTRVALFRDWIDGVLNNPGP

之前没有研究怀疑患有尿路感染的患者中的尿HBP水平。发明人第一次表明HBP的水平在患有尿路感染的个体中提高。根据本发明，因而提供了鉴定个体是否患有尿路感染的方法，该方法包括测量个体中的HBP从而确定个体是否患有尿路感染。

本发明还提供：

-用于确定个体是否患有尿路感染的检测HBP的剂；

-在用于确定个体是否患有尿路感染的方法中使用的测试试剂盒，该测试试剂盒包括用于检测个体中的HBP的剂；

-一种治疗个体的尿路感染的方法，该方法包括：

（i）使用本发明的方法确定个体是否患有尿路感染；和

（ii）向（i）中被鉴定为处于风险的个体施用治疗有效量的至少一种适于治疗尿路感染的剂。

附图说明

图1显示尿液HBP、U-WBC和IL-6的水平。每个点代表个体尿液样品中HBP（A和B）、WBC（C和D）和IL-6（E和F）的浓度。在方法部分描述了四个患者组。条代表值的中值。建议的HBP的临界值被标记在32ng/ml处，对于WBC在2WBC/μL处且对于IL-6在10pg/mL处。

图2显示尿HBP和IL-6的水平与尿液中细菌的浓度相关。每个点代表个体尿液样品中HBP（A）和IL-6（B）的浓度。条代表值的中值。

图3显示尿液中HBP和WBC之间、及尿液中IL-6和U-WBC之间的相关性。Spearman秩相关系数（rho）=0.79表明尿液中HBP和WBC的水平之间具有相关性（A）。IL-6的Spearman秩相关系数为0.338。每个点代表个体尿液样品中HBP、WBC和IL-6的浓度。

图4显示区分UTI和无UTI的尿液中HBP和WBC的接收者工作特征（ROC）曲线。HBP的ROC曲线下面积（AUC）为0.942（95%置信区间，0.889-0.996）、IL-6的为0.808（95%置信区间，0.675-0.941)、WBC的为0.858（95%置信区间，0.742-0.974)。

发明详述

诊断

本发明涉及鉴定受试者是否患有尿路感染的方法。本发明因此涉及尿路感染的诊断。

本发明人第一次研究了怀疑患有尿路感染的患者的尿HBP水平。发明人证明在患有尿路感染的患者中的尿HBP水平相对于没有患有尿路感染的患者升高了。

受测试的个体通常被怀疑患有尿路感染。所述个体通常是哺乳动物。所述哺乳动物通常是人或家养哺乳动物诸如马、牛、羊、狗或猫。所述个体优选是人。

受测试的个体可具有一种或多种尿路感染相关的症状，包括例如发热，通常高于37.5℃、腹部或背部疼痛、和/或阳性亚硝酸盐测试。

通常在从个体获得的样品中体外（in vitro）测量HBP的水平。样品通常包括个体的体液。流体样品可以是血液、血浆、血清、尿液、脑脊液或关节液的样品。样品优选为尿液样品。

根据本发明，与基线水平或浓度相比增加的HBP水平或浓度指示个体患有尿路感染。基线水平通常为没有患有尿路感染、或被怀疑患有尿路感染但随后证实没有患有尿路感染的个体的HBP水平。因此根据本发明的方法可包括样品中HBP水平与HBP的基线水平的比较。

根据本发明，样品中HBP的浓度大于15ng/ml、优选大于25ng/ml、更优选大于30ng/ml、更优选大于32ng/ml、更优选大于35ng/ml、以及最优选大于50ng/ml。此类水平可用于指示个体患有尿路感染。

在可选的方面，本方法可包括评价与基线水平或浓度相比，样品中HBP的相对水平或浓度。通常，一种方法，其中样品中HBP的水平或浓度相对于HBP的基线水平或浓度增加至少3倍或4倍指示尿路感染。

其他标志物诸如白细胞计数（WBC），特别是尿液WBC，和/或1L-6也可被包含在分析中。HBP还可与亚硝酸盐测试组合使用。

HBP的检测

本发明通常通过体外测量从个体中获得的样品中的HBP水平来执行。样品通常包括个体的体液。流体样品可以是血液、血浆、血清、尿液、脑脊液或关节液的样品。样品优选为尿液样品。

样品在测定之前例如通过离心可被处理。样品在测定之前通常还可以优选在-70℃以下被储存。

本领域已知的标准方法可用于测定HBP的水平。这些方法通常包括使用检测HBP的试剂。试剂通常特异性结合HBP。试剂可以是对HBP特异性的抗体、结合HBP的适体、丝氨酸蛋白酶抑制剂诸如牛胰蛋白酶抑制剂（aprotinin），例如描述在Petersen等人，Eur J Biochem1993;271-9中；或整联蛋白的可溶性片段，例如描述在Cai和Wright,S.D.J Exp Med 1996;184:213-23中。有关特异性，将理解所述试剂或抗体结合HBP而对任何其他分子特别是任何其他蛋白没有显著的交叉反应性。例如，对HBP特异性的试剂或抗体将不会显示与人嗜中性白细胞弹性蛋白酶的显著的交叉反应性。交叉反应性可以通过任何适宜的方法评价。

在本发明的方法中使用的抗体可以是完整抗体或其能够结合HBP的片段。抗体可以是单克隆的。这种完整抗体通常是通过本领域已知的任何适宜方法产生的抗体。例如，多克隆抗体可通过以下获得：在适宜条件下用HBP免疫哺乳动物，通常是兔或小鼠，并且从例如所述哺乳动物的血清中分离的抗体分子。单克隆抗体可通过杂交瘤或重组方法获得。

杂交瘤方法包括在合适条件下用HBP免疫哺乳动物，通常是兔、大鼠或小鼠，随后收集所述哺乳动物的脾细胞并将它们与骨髓瘤细胞融合。随后稀释融合细胞的混合物并从单个亲本细胞生长克隆。随后测试由不同克隆分泌的抗体结合HBP的能力，且随后将最多产并稳定的克隆生长在培养基中达到高体积。收集并纯化分泌的抗体。

重组方法包括将不同免疫球蛋白基因区段克隆到噬菌体或酵母中以创建具有稍微不同的氨基酸序列的抗体的文库。可选择产生结合HBP的抗体的那些序列并将序列克隆到例如细菌细胞系中用于生产。

通常抗体是哺乳动物抗体，诸如灵长类动物、人、啮齿动物（例如小鼠或大鼠）、兔、羊、猪、马或骆驼抗体。抗体可以是骆驼科抗体（camelidantibody）或鲨鱼抗体。抗体可以是纳米抗体。抗体可以是任何类或同种型抗体，例如IgM，但优选IgG。

可用在本方法中的完整抗体的片段包括抗原结合位点，例如Fab或F(ab)2片段或ScFV。完整抗体或片段可以与可用来将2个或更多个片段或抗体接合在一起的其他部分诸如接头缔合。此类接头可以是化学接头或能够以与片段或完整抗体的融合蛋白的形式存在。接头因而可用于将具有相同或不同结合特异性的完整抗体或片段，例如可结合相同或不同多态性的完整抗体或片段接合在一起。抗体可以是能够结合两种不同抗原，通常为本文提到的多态性中任何两种的双特异性抗体。抗体可以是通过背靠背接合两个可变结构域而形成的“双抗体”。在用于本方法的抗体以具有拥有不同特异性的不同抗原结合位点的上述形式中任一种存在的情况下，这些不同特异性则通常是针对不同位置处或不同蛋白上的多态性的。在一个实施方案中，抗体是包含来自不同天然抗体的序列的嵌合抗体，例如人源化抗体。

评价HBP水平的方法通常涉及将样品与能够特异性结合HBP的剂或抗体接触。此类方法可包括试纸条测定（dipstick assay）和酶联免疫吸附测定（ELISA）。通常试纸条包括特异性结合HBP的一种或多种抗体或蛋白。如果存在多于一种抗体，则抗体优选地具有不同的非重叠决定簇以使得它们可同时结合HBP。

ELISA是一种需要试剂分离的异质固相测定。ELISA通常使用夹心技术或竞争技术进行。夹心技术需要两种抗体。第一种特异性结合HBP并结合于固体支持体。第二种抗体结合标志物，通常为酶缀合物。酶的底物用于定量HBP抗体复合物和因此定量样品中HBP的量。抗原竞争性抑制测定通常还需要与支持体结合的HBP特异性抗体。HBP酶缀合物被添加到待测定的样品（包含HBP）中。在HBP酶缀合物和未标记的HBP之间的竞争性抑制允许对样品中HBP的量进行定量。用于ELISA反应的固体支持体优选地包含孔。

本发明还可在直接传感技术中采用HBP抗体，所述直接传感技术包括但不限于基于表面等离子体共振、表面声波、石英晶体微天平、微量热法或电化学阻抗谱的直接传感技术。

本发明还可以采用不包括抗体的测量HBP的方法。高效液相色谱（HPLC）分离和荧光检测优选地用作确定HBP水平的方法。可使用之前描述的HPLC装置和方法（Tsikas D等人J Chromatogr B Biomed Sci Appl1998;705:174-6)。在HPLC过程中的分离通常根据大小或电荷进行。在HPLC之前，内源性氨基酸和内标L-高精氨酸通常被添加至测定样品且这些在CBA盒（CBA cartridge，Varian，Harbor City，CA）上被相萃取（phaseextract）。样品内的氨基酸优选地用邻苯二甲醛（OPA）衍生。优选地在所有氨基酸的质量控制样品中确定该测定的准确性和精度。

本发明还提供了包括用于测量个体中的HBP水平从而确定所述个体是否患有尿路感染的工具（mean）的诊断试剂盒。试剂盒通常包含特异性结合HBP的一种或多种抗体。例如，试剂盒可包括单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、CDR移植的抗体或人源化抗体。抗体可以是完整的免疫球蛋白分子或其片段，诸如Fab、F(ab’)₂或Fv片段。如果存在多于一种抗体，则抗体优选地具有不同的非重叠决定簇以使得它们可同时结合HBP。

试剂盒可另外包括用于测量其他实验室或临床参数的工具。例如，试剂盒可包括用于测量个体中的WBC计数和/或尿亚硝酸盐、IL-6、葡萄糖、蛋白和血浆C反应蛋白的一种或多种的水平或浓度的工具。

试剂盒可另外包括一种或多种使得以上提到的方法的实施方案中的任一种能够被执行的其他试剂或器械。此类试剂或器械包括以下的一种或多种：适宜的缓冲液（水溶液）、从样品分离HBP的工具、从个体获得样品的工具（诸如器皿或包括针的器械）或包括可在其上进行定量反应的孔的支持体。试剂盒可以任选地包括使得试剂盒能够用于本发明的方法的说明书或有关该方法可对哪些个体执行的详细资料。

治疗

本发明还涉及由本发明的方法鉴定为患有尿路感染的个体的治疗。因此，在尿路感染的治疗中使用的物质可用于制造在由本发明的方法鉴定为患有尿路感染的个体的治疗中使用的药物。由本发明的方法鉴定为患有尿路感染的个体的病症因此可通过施用这种物质而改善。治疗有效量的可用于治疗尿路感染的物质的可被给予由本发明的方法鉴定为需要这种物质的个体。适于治疗尿路感染的物质通常包括一种或多种抗生素。

以下的实施例说明了本发明：

实施例

方法

研究群体

这项前瞻性的研究包括在2009年3月和6月之间住入瑞典赫尔辛堡医院儿科疾病部门（the Department of Paediatric Diseases,the Hospital ofHelsingborg,Sweden）的78名个体（26名男性和52名女性）。本研究中患者的选入标准是发热（体温≥37.5℃）或暗示尿路感染的症状，年纪较大个体的腹部或背部疼痛和年纪较小的儿童的非特异性的征象诸如易怒或进食困难。尿路感染包括下尿路感染和肾盂肾炎两者。排除具有嗜中性白细胞减少症的患者（中性粒细胞≤0.5x10⁹/L）或在此前72小时内接受过抗生素的患者。项目方案通过隆德大学医院（Lund University Hospital）伦理委员会的批准并获得经过他们的父母的来自所有患者的同意。患者被分为以下的组：1）基于细菌培养具有≥10⁵菌落形成单位（CFU）/ml的单一微生物的尿液样品和典型的临床症状，具有尿路感染的最终诊断的患者。2）基于临床特征或具有≥10³CFU/ml的单一微生物、或阳性的亚硝酸盐测试的尿液样品，具有疑似尿路感染的患者。菌尿症的较低的临界值是基于来自瑞典传染病控制研究所（Swedish Institute for Infectious Disease Control）的建议。3）具有发热、但非尿路感染的患者。4）不具有发热、且无尿路感染的患者。

临床和实验室评价

记录了体温并分析了血浆中的CRP。以中流（75个样品）样品或耻骨上吸引术（2个样品）收集尿液。在一名患者中没有登记技术。用细菌培养物和包括亚硝酸盐、白细胞（WBC）、白蛋白、红细胞和葡萄糖的测试的试纸条测试进行尿液样品的分析。在Clinitek Status（Bayer Health Care）上分析试纸条（Multisticks7,Siemens）。亚硝酸盐作为阳性或阴性呈现，且WBC以分级范围作为半定量值呈现：0，<15白细胞/μL尿液；1，≥15白细胞/μL尿液；2，≥70白细胞/μL尿液；3，≥125白细胞/μL尿液；4，≥500白细胞/μL尿液。为确定HBP水平，在取样1小时内离心尿液，且将等份的上清液储存在-70℃直到分析。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）确定HBP的浓度。用在包被缓冲液（0.05M NaHCO₃，pH9.6）中直接针对HBP的小鼠单克隆抗体包被微量滴定板（NUNC）。用磷酸盐缓冲盐水冲洗并用牛血清白蛋白（Sigma）封闭板。在样品缓冲液（1M NaCl）中1/40稀释尿液样品，一式两份添加至孔并在37℃孵育30min。每个板还包含已知浓度的重组HBP的校准样品。冲洗后，用1/7000稀释的针对HBP的多克隆兔抗血清孵育板。通过与过氧化酶缀合的针对兔IgG的抗体Bio-Rad（1/3000）一起孵育来检测结合的抗体。通过计算两份重复的平均光密度，并将其与标准曲线的结果相关联，来确定每个患者样品中的HBP水平。根据制造商的说明书，使用夹心-ELISA（ELISA MAX^TMDeluxe Sets）分析尿液中IL-6的水平。在孵育缓冲液中1/2稀释尿液样品，并一式两份地分析。

统计分析

通过非参数的Kruskal-Wallis检验进行组之间的比较，对于具有偏态分布的连续变量用曼-惠特尼-U-检验。通过Spearman非参数检验分析相关性。接收者工作特征曲线下面积用于说明HBP、IL-6、U-WBC和亚硝酸盐的权重。计算HBP、IL-6和U-WBC的灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值。定义统计显著的水平为双尾检验p值<0.05。将SPSS17.0软件系统（SPSS）用于统计分析。

结果

患者特征和实验室征象

78名个体被登记在研究中。患者的年龄从1个月到18岁（平均5.96岁）的范围且75%大于1岁。10名患者被诊断具有尿路感染（2名具有下尿路感染且8名具有肾盂肾炎），且所有患者在尿液培养物中都具有大肠杆菌（Escherichia coli）（组1）。5名患者基于指示尿路感染的特征症状或实验室结果患有疑似尿路感染（组2）。这5名患者中的3名的尿液中仅具有大肠杆菌或β溶血性B群链球菌（Streptococci）的中度生长（≥10³-≤10⁵CFU/ml），一名患者具有典型的膀胱炎的临床症状但未被培养且具有阴性的试纸条测试，及一名患者具有肾盂肾炎的特征征象、具有阴性尿液培养物和亚硝酸盐阳性的试纸条测试。30名患者患有发热但无尿路感染的实验室或临床征象（组3）。他们的尿液培养物为阴性或具有细菌的混合菌株（指示样品污染）。33名患者未患有发热且无尿路感染的实验室征象（组4）。他们的尿液培养物为阴性。这些患者中的一些具有如遗尿、奥尔波特综合征、亨诺-许兰综合症（Henoch-Schonlein-syndrome）和肾病综合征的诊断（在进入研究之前已知）。

来自血浆和尿液的结果的统计分析

组1（尿路感染）和2（疑似尿路感染）之间的中值年龄、性别、体温、血浆CRP、尿液HBP、尿液IL-6、尿液WBC或亚硝酸盐无显著差异。血浆CRP和尿葡萄糖未在任何组之间导致任何显著差异。尿白蛋白在组1和3（发热、非尿路感染）、1和4（无发热、未感染）、2和3之间但不在其它组之间具有显著差异。尿红细胞在组1和3、1和4之间但不在其他组之间具有显著差异。在组1和3之间的尿液HBP、IL-6和WBC的中值水平存在显著差异。还比较了组1和4，尿液HBP、IL-6和WBC的中值水平具有显著差异。与组3和组4的合并相比，组1和组2合并的尿液HBP、IL-6和WBC的水平存在显著差异（图1A-F）。一个令人感兴趣的暗示是，与具有较少或无细菌的尿液相比，具有高浓度的细菌（≥10⁵CFU/ml）的尿液表现为具有较高水平的HBP和WBC（图2A-B）。具有秩相关系数（rho）=0.79的Spearman检验表明尿液HBP和WBC的水平之间具有相对强的相关性（图3）。尿液中IL-6与WBC不具有这种强的相关性（rho=0.38）。

为了计算灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值，将组1和2合并称为尿路感染组，并与被称为非尿路感染的合并的组3和4相比。使用≥32ng/ml的HBP的临界水平，在诊断尿路感染时的灵敏度和特异性分别为93.3%和90.3%。与WBC、亚硝酸盐和IL-6相比，尿液HBP具有最高的灵敏度。与WBC和IL-6相比，尿液HBP还具有最高的特异性（表2）。与其它的标志物相比，亚硝酸盐具有最好的特异性。基于本研究中尿路感染的19.2%的患病率，用于尿路感染预测的HBP的阳性和阴性预测值分别为70.0%和98.3%（表2）。ROC曲线表明，与U-WBC和IL-6相比，具有曲线下面积（AUC）值为0.94的尿液HBP是尿路感染的最佳预测指标（图4）。

讨论

尿路感染可具有严重的后果且抗生素抗性是日渐增长的问题。因此，需要具有较高灵敏度和特异性的检测。一些之前的研究已研究出尿液中用于检测尿路感染的生物标志物，如IL-6、乳铁蛋白、IL-8、TNF-α、弹性蛋白酶和Clara细胞蛋白。血浆HBP已被研究作为用于成人脓毒症的生物标志物，且数据表明，具有疑似感染的发热患者的正常血浆HBP水平可以高的可能性（阴性预测值94.5%）排除发展为严重的脓毒症的风险。在本研究中，将尿液HBP的浓度与尿IL-6、亚硝酸盐、WBC、红细胞、白蛋白、葡萄糖和血浆CRP相比较。尿液HBP具有高于IL-6、亚硝酸盐和WBC的AUC值（0.94），从而是用于尿路感染的最佳预测指标。尿液HBP具有高的阴性预测值（98.3%），从而可以高的可能性排除疾病。亚硝酸盐测试具有其低灵敏度的限制。一些细菌种类不能将硝酸盐转化为亚硝酸盐，例如腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）和肠球菌（Enterococcus）。假阴性亚硝酸盐的其他原因是尿液在膀胱中短的孵育时间和高剂量维生素C的摄取。本研究中存在异常值。在组2（疑似尿路感染）中，一名具有肾盂肾炎症状且尿液培养物中具有β溶血性B群链球菌（10⁴-10⁵CFU/ml）的患者具有低的HBP水平（6.3ng/ml）。该患者在用于尿亚硝酸盐和WBC的快速测试中也为阴性。具有尿路感染的患者的尿液HBP水平比具有其它种类的感染的患者中的要高，这表明尿液中HBP的释放取决于通过例如尿液中细菌感染的白细胞的激活。

表1.患者特征.临床和实验室数据.

年龄、性别、CRP、HBP、体温、U-WBC和亚硝酸盐的中值、范围和P值。

注释：用曼-惠特尼检验（Mann-Whitney test）分析P值。x=组1对组2、xx=组1对组3、xxx=组1对组4

1）半定量范围：0，<15白细胞/μL；1，≥15白细胞/μL；2，≥70白细胞/μL；3，≥125白细胞/μL；4，≥500白细胞/μL

2）亚硝酸盐阳性被定义为1且亚硝酸盐阴性被定义为0。

表2.用于UTI预测的灵敏度、特异性、HBP的PPV和NPV、U-WBC和亚硝酸盐（HBP的临界值为32ng/mL、IL-6的为10pg/mL、U-WBC的为2、CRP的为100ng/ml、亚硝酸盐的为0.5、体温的为38℃).

灵敏度，% 特异性，% PPV，% NPV，%

PPV，阳性预测值；NPV，阴性预测值。