来自布尔弗雷德耳霉(CONIDIOBOLUS BREFELDIANUS)的酶及其制备方法

摘要

本发明涉及一种登录号为MTCC 5185的耳霉属（Conidiobolus）的真菌。本发明还涉及制备耳霉属的蛋白酶、糖酶和脂肪酶的酶混合物的方法。这样的酶在皮革、丝及其他工业中具有用途。

说明书

发明领域

本发明涉及包含来自布尔弗雷德耳霉（Conidiobolus brefeldianus）MTCC 5185的蛋白酶、脂肪酶和糖酶的酶组合物。此外，本发明涉及所述组合物的制备方法及其应用。 

发明背景 

工业酶当前的全世界估计销售价值是10亿美元。工业酶中，75%是水解酶。蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和木聚糖酶一起构成了销售的总酶的85-90%左右，其中来自植物、动物和微生物源的蛋白酶占大约60%。 

细菌蛋白酶是众所周知的，真菌源的蛋白酶虽然有限但有优势。此外，与其他酶结合的真菌源蛋白酶也是有限的。 

已知冠状耳霉（Conidiobolus coronatus）已被用作碱性蛋白酶的生产源，参考US6777219，US7186546，R.Seeta Laxman等"来自冠状耳霉的碱性蛋白酶的优化和规模扩大生产(Optimization and scale up of production of alkaline protease from Conidiobolus coronatus）"，发表在Process Biochemistry,Volume 40,Issue 9,第3152-3158页，发表日期2005年9月，doi:10.1016/j.procbio.2005.04.005；和S.H.Bhosale等"Thermostability of high-activity alkaline protease from Conidiobolus coronatus(NCL 86.8.20)(来自冠状耳霉的高度活性的碱性蛋白酶的热稳定性(NCL 86.8.20)）"，发表在Enzyme and Microbial Technology 17:136-139,1995。 

但是现有技术中没有包含来自耳霉属（Conidiobolus）种菌株的蛋白酶、脂肪酶和糖酶的酶组合物。US6777219和US7186546涉及从来自冠状耳霉制备碱性蛋白酶的方法。 

因此，本发明的目标是提供一种酶组合物，其包含来自迄今无人知道的布尔弗雷德耳霉菌株作为真菌源的选自蛋白酶、脂肪酶、蛋白聚糖酶和糖酶的至少一种酶。 

本发明的另一个目标是提供利用由本发明人分离的真菌培养物布尔弗雷德耳霉，来制备包含选自蛋白酶、脂肪酶和糖酶的至少一种酶的酶组合物的方法。 

本发明的另一个目标是提供在宽pH范围内保持活性和稳定并且发酵周期短的碱性蛋白酶的制备方法。 

本发明的还一个目标是提供生产单个的蛋白酶、脂肪酶和糖酶或其组合的经济方法。本发明的目标还在于通过由印度浦那（Pune）的国家化学试验室（National Chemical Laboratory）分离的属于布尔弗雷德耳霉种属的真菌培养物，在不昂贵的培养基上制备单个的蛋白酶、脂肪酶、蛋白聚糖酶和糖酶或其组合的方法。 

本发明的又一个目标是提供本发明的酶在皮革、清洁剂、食品、纺织品、丝脱胶、从丝/废丝中生产和回收丝胶蛋白/肽、动物组织培养、分析工具、药物、化妆品、分子生物学等工业中的应用方法。 

发明内容

因此，本发明提供了一种酶组合物，其包含从在此公开的一种迄今无人知道的布尔弗雷德耳霉MTCC菌株作为真菌源得到的选自但不限于蛋白酶、脂肪酶、糖酶、具有凝血活性和糖蛋白和降解活性 （glycoprotein and degrading activity）的酶的至少一种酶。也公开了所述酶组合物的制备方法及其应用。本发明的酶组合物包含在此单独组合公开的酶。 

本发明的蛋白酶选自但不限于单独或组合的碱性蛋白酶类、蛋白酶类、弹性蛋白酶、角蛋白酶和肽酶。 

本发明的糖酶选自但不限于糖苷酶类，尤其是，聚糖酶类，更尤其是单独或组合的壳多糖酶、昆布多糖酶、硫酸软骨素酶。 

本发明的脂肪酶包括酯酶。 

在一种实施方式中，本发明涉及包含碱性蛋白酶的酶组合物，其在宽的pH范围内保持活性和稳定、对化学品和温度变化稳定、并具有如本文中所公开的储存期限。本发明的组合物对于选自但是不局限于应用于皮革、化妆品、纺织品、食品、清洁剂、药物和其他工业中的清洁剂、有机溶剂、变性剂等化合物是稳定的。 

在本发明的又一种实施方式中，所述酶组合物处于生物质形态。 

在本发明的另一种实施方式中，所述酶组合物包含粗制形式的酶。 

在本发明的另一种实施方式中，所述酶组合物包含纯化形式的酶。 

在本发明的另一种实施方式中，所述酶组合物包含精制形式的酶。 

在本发明的又一种实施方式中，所述酶组合物包含游离形式的酶。 

在本发明的又一种实施方式中，所述酶组合物包含游离和固定形式相结合的酶。 

在本发明的又一种实施方式中，所述酶组合物包含固定形式的酶。 

在本发明的又一种实施方式中，所述酶组合物包含细胞结合形式的酶。 

在本发明的另一种实施方式中，所述酶组合物包含细胞内形式的酶。 

在本发明的又一种实施方式中，还提供了根据所使用的碳、氮气和诱导剂，从布尔弗雷德耳霉单独或同时制备选自蛋白酶、糖酶和脂肪酶的一种或多种酶的发酵方法，其中所述方法包括： 

a.在需氧条件、5.0至10.0的pH范围和15°至37°C的温度范围下，将真菌菌株布尔弗雷德耳霉MTCC 5185在包含碳和氮源以及诱导剂的培养基中生长2至5天时间； 

b.收获培养基，和 

c.通过常规方法分离/提取液相中的酶。 

在所述方法的一种实施方式中，所述生物体在180至220rpm振荡下，在浸没培养中生长。 

在另一种实施方式中，所述生物体在稳态条件下，在半固体培养中生长。 

碳源包括但是不局限于单独或以其组合的，糖、糖醇、多糖、农产品、农业副产品/废物等等。所述糖是葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖等；糖醇是甘油、甘露糖醇、山梨糖醇等；多糖是淀粉等；油/脂肪是橄榄油、葵花籽油、大豆油、芝麻油、芥子油、蓖麻油、椰子油、花生油、三丁酸甘油酯等；和农产品/废物是大豆粉、大豆粕、花生粕、芥菜籽饼、棉籽饼、麦麸、米糠等；包含壳多糖的像蟹壳等 的废物。 

氮源任选是单独或其组合的有机或无机氮源、无机氮源选自但不限于磷酸氢二铵、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、硝酸钾和尿素。 

有机氮源选自但不限于蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白（soyatose）、大豆蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酪蛋白、肉浸膏、牛肉浸膏、酵母提取物、鱼粉、羽毛粉、羽毛、玉米浆、和富含氮的豆类基质例如大豆粉、大豆粕、鹰嘴豆粉、绿豆粉、芥菜籽饼、棉籽饼、花生粕、麦麸、米糠等、来自乳品、家禽、肉和食品加工品的废料、富含角蛋白的废料像毛发、羽毛、渔业废物及其他废物，单独或以其组合。 

酶的常规分离方法是过滤、离心或用水或稀表面活性剂提取。在本发明的一种实施方式中，细胞内形式的酶通过包括用超声和机械研磨破碎细胞的步骤进行再分离。 

碳和氮源/诱导剂选自但不限于来自乳品如乳清、食品加工、肉和鱼例如鱼粉和鸡毛、羽毛粉等、或农业废物例如油籽饼、和碳水化合物废物如谷类/谷物、油、脂肪、皮革厂废料如削掉的肉片、边角料和铬革屑、富含角蛋白的基质如指甲、蹄、毛发的蛋白/含氮废物，单独或以其组合。 

在本发明的一种实施方式中，有机氮源是蛋白酶的诱导剂。 

在本发明的一个方面中，通过膜滤法，或通过添加盐例如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、氯化镁等、添加有机溶剂例如乙醇、丙酮进行盐析，或通过冷冻干燥或喷雾干燥，来达到酶的浓缩。 

在本发明的一个方面，冻干的蛋白酶在4至40°C范围的温度下是稳定的。 

在本发明的一个方面，喷雾干燥的蛋白酶在4至40°C范围的温度下是稳定的(760天)。 

本发明的蛋白酶在3-12的pH范围、优选pH7时是稳定的，在清洁剂、与水混溶的和与水不混溶的有机溶剂存在下是稳定的，并且在高达50°C是稳定的。所述蛋白酶在6-11的pH范围、30至60°C的温度范围并且在金属离子螯合剂的存在下是有活性的。 

在本发明的一种实施方式中，粗制和部分纯化的蛋白酶对酪蛋白、白蛋白、血红蛋白、角蛋白、弹性蛋白-苔黑素、偶氮酪蛋白、偶氮骨胶原、N-a-苯甲酰基-DL-精氨酸-对硝基苯胺(BAPNA)和明胶显示出活性。 

在本发明的另一种实施方式中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶并受苯甲基磺酰氟(PMSF)的抑制。 

在本发明的一种实施方式中，脂肪酶在4至9的pH范围、优选pH7和20至60°C的温度范围、优选50°C时是有活性的。 

在本发明的另一种实施方式中，所述酶组合物对纯胶原蛋白是惰性的。 

在本发明的另一种实施方式中，所述蛋白酶可用于丝脱胶和从脱胶废液中回收丝胶蛋白/肽。 

本发明的酶组合物在食品、化妆品、药品、皮革、纺织工业和从外消旋混合物拆分旋光异构体方面找到用途。蛋白酶在农业、皮革、纺织、丝脱胶、乳品、食品、饲料、清洁剂、制药工业、动物组织培养、从废摄影胶片除银和纳米粒子合成、肥料、从植物、动物、肽合成制备培养基成分和蛋白质水解物、分子生物学、化妆品、分离氨基 酸的外消旋混合物、废物处理等方面具有用途。角蛋白酶在皮革、清洁剂、疯牛病病的事先降解等方面具有用途。脂肪酶在农业、皮革、纺织业、乳品、食品、饲料、清洁剂、制药工业、肥料、化妆品、废物处理、聚合物合成等方面具有用途。壳多糖酶在农业中具有用途。硫酸软骨素酶在脊髓损伤中具有用途。 

附图说明

图1布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的显微照片：(a)显示原生质内含物的真菌菌丝体，(b)具有油滴的厚壁接合孢子。 

图2：树形图显示了根据18S rDNA序列的多重序列比对的同源性。新真菌菌株MTCC 5185的18S rDNA序列与布尔弗雷德耳霉显示出最大的同源性。 

图3：平板试验显示布尔弗雷德耳霉MTCC 5185产生脂肪酶。三丁酸甘油酯琼脂平板上生长五天之后真菌菌落周围的透明区表明真菌分泌脂肪酶。 

图4：平板试验显示布尔弗雷德耳霉MTCC 5185产生壳多糖酶。酸胀的壳多糖板上添加了培养物滤液的孔周围的透明区表明所述真菌分泌壳多糖酶。 

图5：平板试验显示布尔弗雷德耳霉MTCC 5185产生硫酸软骨素酶。在硫酸软骨素A板上生长4天之后，菌落周围的透明区表明所述真菌分泌硫酸软骨素酶。 

图6：来自布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的纯化蛋白酶的SDS-PAGE显示出分子量相当于29.9kDa左右的单峰。 

图7：部分纯化的蛋白酶的MALDI-TOF显示出分子量27.8kDa的主峰。 

图8：喷雾干燥的蛋白酶的储存期限。喷雾干燥的蛋白酶在高达40°C的温度下稳定达两年以上。 

图9：通过布尔弗雷德耳霉从废X-射线胶片除去含银明胶层：a-粗制蛋白酶；b-生物质滤液和c-生物质。由于从胶片上除去了明胶并同时将银释放到溶液中，溶液转为发黑。1h之后，由于完全除去了银和 明胶，胶片是透明的。 

图10：用蛋白酶脱胶前后，丝纤维的目视观察。在用蛋白酶脱胶之后，可看出丝纤维的光泽。 

图11：丝纤维在用蛋白酶脱胶前后的扫描电子显微照片。由于脱胶之后之后除去了丝胶，丝纤维是光滑的。 

图12：用布尔弗雷德耳霉5185蛋白酶进行酶法脱胶之后，废液中的丝胶回收。脱胶液中的不溶性丝胶残渣随着用于脱胶的蛋白酶浓度增加而增多。 

图13：在用布尔弗雷德耳霉5185蛋白酶进行酶脱胶之后，从废脱胶液中回收的丝胶肽的SDS-PAGE。 

图14：该图显示了血迹的除去。粗制蛋白酶能够除去血迹以及血凝块，而商业清洁剂只能除去血迹，a-水；b-清洁剂；c-蛋白酶；d-蛋白酶+清洁剂。 

具体实施方式

在本文中公开了一种酶组合物，其包含从迄今无人知道布尔弗雷德耳霉MTCC-5185菌株作为真菌源得到的选自但不限于具有血凝活性和糖蛋白降解活性的蛋白酶、脂肪酶、糖酶的至少一种酶。也公开了所述酶组合物的制备方法及其应用。本发明的酶组合物包含单独或其组合的在此公开的酶。 

真菌菌株布尔弗雷德耳霉从植物碎屑中分离，登录号为MTCC5185(微生物典型培养物保藏中心（Microbial Type Culture Collection），Chandigarh，印度)。布尔弗雷德耳霉的来源是土壤、昆虫、落叶层、小树枝等等。图1显示了布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的具有原生质内含物的真菌菌丝体和具有油滴的厚壁接合孢子的显微镜照片。图2显示了18S rDNA基因与其它生物体的序列同源性。根据18S rDNA序列同源性，本发明的分离菌株显示出与布尔弗雷德耳霉菌株AF368506.1有99%的同源性，并且与不同的冠状耳霉菌株有98%的同源性。新的布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185的18S rDNA基因序列已经保藏在 NCBI基因库中，登录号为FJ895304。 

本发明的蛋白酶选自但不限于碱性蛋白酶、蛋白酶、弹性蛋白酶和、角蛋白酶和肽酶，单独或以其组合。 

本发明的糖酶选自但不限于糖苷酶，特别是聚糖酶，更特别是壳多糖酶、昆布多糖酶、硫酸软骨素酶，单独或以其组合。 

本发明的脂肪酶包括酯酶。 

通过在本文中描述的方法执行酶活性测定。反应混合物在pH9.0的0.1M碳酸钠缓冲液中含有适当稀释的酶溶液等份和10mgHammerstein酪蛋白，总体积为2ml。在50°C温育10min之后，通过添加3ml 5%三氯乙酸(用浓盐酸酸化)来终止反应。在室温下静置30min之后，通过Whatman 1号滤纸过滤所形成的沉淀物。在280nm测量三氯乙酸可溶性级分的吸光度。从针对酪氨酸的预先校准的280nm吸光度图计算所产生的酪氨酸的微克数，单位用在试验条件下每分钟释放的酪氨酸的μmol数来表示。 

利用pH 7的含1%昆布多糖的50mM磷酸钾缓冲液测量昆布多糖酶(葡聚糖酶)活性。1ml总反应混合物含有0.5ml适当稀释的酶和0.5ml底物，并在50°C温育30min。通过二硝基水杨酸法测量释出的还原糖(P.Bernfeld 1955,淀粉酶：α&β（Amylase:α&β）,《酶学方法》（Methods in Enzymology）,Volume 1,149)。昆布多糖酶活性用试验条件下每分钟产生的还原糖(如葡萄糖当量)的μmol数来表示。 

脂肪酶活性通过两种不同的方法测量。 

a.利用对硝基酚丁酸酯(pNPB)作为底物的分光光度分析：将30mg pNPB溶解在10ml异丙醇和0.1ml Triton-X-100中，用pH7的50mM磷酸盐缓冲液将体积补到100ml。分析混合物含有0.9ml底物和 0.1ml适当稀释的酶。所述分析混合物在50°C温育30min并通过添加2ml异丙醇终止。在410nm测量释放出的对硝基酚的量。脂肪酶活性用在所述分析条件下每30min释放的对硝基酚的μmol数来表示。 

b.脂肪酶的滴定分析：将20ml橄榄油、165ml的10%阿拉伯树胶和15g冰在粉碎混合机中混合10分钟来制备底物，在玻璃棉上过滤并储存在4°C。对于脂肪酶分析而言，所述反应混合物含有2ml磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.0)、5ml底物和1ml粗制培养肉汤，并在50°C和50rpm振荡下温育1h。通过添加4ml丙酮:乙醇(1:1)，终止反应。在空白中，在通过丙酮:乙醇终止反应之后添加所述酶。用10mM NaOH滴定释放出的游离脂肪酸。脂肪酶活性用在所述分析条件下每分钟释放的游离脂肪酸的μmol数来表示。 

壳多糖酶分析使用0.7%的壳多糖测量。反应混合物含有1ml酶、1ml pH5的50mM乙酸盐缓冲液和1ml 0.7%壳多糖作为底物。反应混合物在50°C温育1h。释出的N-乙酰葡萄糖胺通过用对-二甲基氨基苯甲醛以分光光度法测量585nm下的吸光度来估算。一个单位的活性被定义为在所述分析条件下每分钟释放1μmol N-乙酰葡萄糖胺所需要的酶量。 

硫酸软骨素酶活性在37°C通过分光光度法测量。适当稀释的酶(0.8ml)在37°C平衡10min，之后添加0.2ml在pH8的250mM Tris HCl和300mM乙酸钠缓冲液中制备的0.05%牛血清清蛋白中的0.5%硫酸软骨素A，并立即混合。反应混合物在37°C温育最多21min。以3min的时间间隔抽取0.1ml等份并转移到含有0.9ml调整到pH8的50mMKCl的试管中，并在37°C继续温育另外10min。在10min结束时，将内含物离心并在232nm下测量吸光度。零分钟时的吸光度用作所述分析的空白。从吸光度对时间的图形的线性部分的斜率(吸光度增加/每分钟)如下所示计算活性。一个单位被定义为在所述分析条件下，每分钟从硫酸软骨素A释放一个微摩尔的2-乙酰胺基-2-脱氧-3-O-(β-D-葡萄糖-4-烯-吡喃糖醛酸)-4-O-硫代-D-半乳糖所需要的酶量。 

U/ml=斜率x1(ml)x稀释倍数

5.1(EmM)x0.1x0.8 

其中5.1是不饱和二糖对于硫酸软骨素A的毫摩尔消光系数。 

传统上，角蛋白酶已经用于生产羽毛粉、肥料和胶等等。它们的应用范围正在缓慢拓宽，现在它们正日渐被用于其他区域，例如清洁剂制剂、化妆品、皮革、医药和动物饲料。新近，它们在治疗疯牛病(降解朊病毒)、可生物降解的塑料和羽毛粉生产中具有用途。正在探索具有轻度弹性组织水解活性但是缺乏胶原水解活性的角蛋白酶在皮革制造的脱毛工艺中的应用。皮肤和生皮包含相当量的有价值的GAG(毛重的0.2–0.3%。包含脂肪酶、角蛋白酶、硫酸软骨素酶和壳多糖酶的酶组合物将可用于脱毛。 

本发明的酶组合物在食品、化妆品、药品、皮革、纺织工业、和从外消旋混合物拆分旋光异构体中有用途。蛋白酶在农业、皮革、纺织业、丝脱胶、乳品、食品、饲料、清洁剂、制药工业、动物组织培养、从废摄影胶片除银和纳米粒子合成、肥料、从植物、动物、肽合成制备培养基成分和蛋白质水解物、分子生物学、化妆品、分离氨基酸的外消旋混合物、废物处理等方面具有用途。角蛋白酶在皮革、清洁剂、疯牛病的事先降解等方面具有用途。脂肪酶在农业、皮革、纺织业、乳品、食品、饲料、清洁剂、制药工业、肥料、化妆品、废物处理、聚合物合成等方面具有用途。壳多糖酶在农业中具有用途。硫酸软骨素酶在脊髓损伤中具有用途。 

本发明在下面的本文中用实施例进行描述，所述实施例仅是说明性，不应该被解释为以无论任何方式限制本发明的范围。 

本发明在下面的本文中用实施例进行描述，所述实施例仅是说明性，不应该被解释为以无论任何方式限制本发明的范围。 

实施例

实施例1 

本实施例说明了布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的分离以及对其通过形态特征的鉴定。从印度马哈拉施特拉邦（Maharashtra）浦那（收集）的正在分解的植物碎屑中分离真菌培养物。将植物碎屑的细颗粒铺在贴在陪替氏平皿盖内表面的MGYP琼脂(麦芽浸膏-0.3%；酵母提取物-0.3%；蛋白胨-0.5，葡萄糖-1%，琼脂-2%)块上，并将平皿在28°C温育。挑取从强力放射的分生孢子产生的单个分离菌落，并转移到MGYP琼脂斜面，在28°C温育2-3天。所述生物体快速生长，并根据强力放射的大的球状分生孢子带有基底乳突的形态，被鉴定为属于耳霉属。菌丝体是无隔多核的，但是在后来的阶段中变得有隔。分生孢子梗有短丝，并且不能与菌丝体区分。在分子孢子梗的顶端，形成强力放射的大的球状分生孢子。分生孢子的大小在35-45微米之间变动。分生孢子或者萌芽产生菌丝体，或者在径向小梗上产生小分生孢子或接着成为次生分生孢子。可以看见所放射的分生孢子在所述生长培养物上方的玻璃上是发白的/带奶油色的沉积物。所述生物体是接合孢子并且所述接合孢子(休眠孢子)是圆形、光滑并且带厚壁的，所述厚壁具有2个不同的壁层并且内部有粒状内含物(图1)。 

实施例2A 

本实施例说明了通过十六浣基三甲基溴化铵(CTAB)方法分离布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的基因组DNA。为了分离DNA，将所述真菌在液体烧瓶中的麦芽浸膏葡萄糖酵母提取物蛋白胨(MGYP)培养基中生长，所述培养基的组成是(g/L)麦芽浸膏-3；酵母提取物-3；蛋白胨-5和葡萄糖-10。接种来自7日龄的MGYP斜面的孢子，引发生长。所述烧瓶在28°C下在旋转振荡器(200rpm)上温育48小时。将内容物以8000rpm离心15min，反复洗涤以除去培养基成分。3-5g湿菌丝体在液氮中研磨，然后添加8-10ml含有0.2%β-巯基乙醇的CTAB提取缓冲液，pH8，然后添加20μl蛋白酶K(20mg/ml)并在65°C温育1h。这之后添加20μl RNase A(10mg/ml)，并进一步在65°C温育15min。向离心(8000rpm，10min)之后收集的上清液中，添加10ml氯仿:异戊醇(24:1)。将所述混合物振摇5min，并在4°C以10,000rpm离心15min。向所述上清液添加两体积的CTAB沉淀缓冲液，并在室温下放置1h。离心之后收集的沉淀团溶解在5ml 1.2M NaCl中，并添加5ml氯仿:异戊醇(24:1)。向水相添加两体积的无水酒精以沉淀DNA。将DNA绕取出来，并用70%乙醇洗涤，溶解在5ml pH 8.0的0.1M Tris EDTA缓冲液中，储存。通过在分光光度计上测量所述样品在260nm时的吸光度来实行DNA的定量，并在0.8%琼脂糖凝胶电泳上检查纯度。 

实施例2B 

本实施例说明了用于18S rDNA基因的基因组DNA聚合酶链反应(PCR)扩增。用于鉴定真菌物种的引物是通用的真菌18S核糖体DNA(rDNA)引物NS1-F(GTA GTC ATA TGC TTG TCT C)、NS8-R(TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA)。聚合酶链式反应(25μl)被用来利用基因组DNA扩增所述18S rDNA基因。反应混合物典型地含有基因组DNA-0.70μl、10X PCR缓冲液-2.50μl、0.2mM dNTPs-2.5μl、正向和反向引物各10-20pmol-1.25μl、蒸馏水-16.60μl和1单位的Taq DNA聚合酶-0.20μl。用于18S rDNA基因增殖的PCR条件是：-95°C初始变性3min，接着是94°C 1min、57°C 30sec、72°C 2min的35个循环，和72°C的最后延伸10min。5μl的上述PCR扩增产物用来在1.0%琼脂糖凝胶上检查扩增。 

实施例2C 

本实施例说明了PCR扩增产物的纯化。向20μl PCR扩增产物中添加12μl 20%PEG-NaCl(聚乙二醇-NaCl)溶液，并在37°C温育30min。然后在12,000rpm下离心20min。丢弃上清液，并将沉淀团用70%乙醇洗涤两次和通过以12,000rpm离心20min分离。将沉淀团干燥并溶解在10μl重蒸馏水中，储存在-20°C。 

实施例2D 

本实施例说明了纯化的PCR产物的测序。使用‘ABI PRISM BigDye终止剂循环测序即用反应试剂盒（ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit）’(Perkin Elmer Applied Biosystems Division,Foster City,CA)，按照制造商的方案，使用Taq DNA聚合酶执行测序反应。这种试剂盒含有四种具有不同荧光标记的ddNTP，被称为BigDye终止剂。2μl PCR产物和3pmol测序引物被用于20μl测序反应中。测序引物是用于测序的NS 1(GTA GTC ATA TGC TTG TCT C)、NS2(GGC TGC TGG CAC CAG ACT TGC)、NS3(GCA AGT CTG GTG CCA GCA GCC)、NS4(CTT CCG TCA ATT CCT TTA AG)、NS5(AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G)、NS6(GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC)、NS7(GAG GCA ATA ACA GGT CTG TGA TGC)和NS8(TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA)(White等1990)。测序反应混合物在Perkin Elmer热循环仪9700中经历25个循环。每个循环由95°C10min、50°C 5min和60°C 4min构成。DNA测序在ABI 1500自动测序仪上执行。 

实施例2E 

本实施例说明了根据在上面的实施例中得到的18S rDNA序列，新的耳霉属菌株MTCC 5185的鉴定和种系发生关系。得到的序列是小片段，因此通过重叠所述序列进行适当比对。利用得到的18S rDNA序列，在NCBI数据库中进行耳霉属新菌株种类的同源性百分比和种系发生关系。利用基本局部比对调查工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)程序(www.ncbi.ncm.gov/blast)，分析核苷酸序列。序列表1中的结果显示了在NCBI数据库中18S rDNA序列的前10个BLAST命中。18SrDNA显示与一种布尔弗雷德耳霉菌株AF 368506.1的序列同源性最大(99%)。新的布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185的18S rDNA基因序列已经保藏在NCBI基因库中，登录号为FJ895304。图2显示了18S rDNA与其他生物体的序列同源性。能够看出，布尔弗雷德耳霉MTCC 5185菌株不属于冠状耳霉组。 

表1:18S rDNA序列的前10个BLAST命中 

实施例3 

本实施例说明了利用布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185通过浸没发酵来制备蛋白酶。发酵在摇瓶中在含有(克/升)葡萄糖-20、酵母提取物-3、大豆粕-30的培养基中进行。来自3日龄MGYP斜面的孢子用于制备种子培养物，其组成是(克/升)葡萄糖-10、酵母提取物-3。其在28°C 下在旋转振荡器上温育24小时，并用来启动摇瓶实验。摇瓶实验在旋转振荡器上(200rpm)在28°C运行72h。蛋白酶活性根据Laxman等(2005),《过程生物化学》（Process Biochemistry）,Volume 40,3152-3158(2005)估算。一个单位的活性被定义为在释放一微摩尔Tyr/min所需要的酶量。3天之后，在无细胞肉汤中的蛋白酶活性是36-38IU/ml。 

实施例4 

本实施例说明了利用布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185通过浸没发酵来制备蛋白酶。发酵在摇瓶中在含有(克/升)葡萄糖-20、磷酸氢二铵–1.6、大豆粕-30的培养基中进行。来自3日龄MGYP斜面的孢子用于制备种子培养物，其组成是(克/升)葡萄糖-10、酵母提取物-3；蛋白胨-5。其在28°C下在旋转振荡器上温育24小时，并用来启动摇瓶实验。摇瓶实验在旋转振荡器上(200rpm)在28°C运行72h。3天之后在无细胞肉汤中的活性是34-40IU/ml。 

实施例5 

本实施例说明了利用布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185，通过在搅拌和通气的受控条件下在仪表化的发酵罐中浸没发酵来制备蛋白酶。发酵在工作容积为5L的7.5L New Bruinswick发酵罐中进行。来自3日龄MGYP板/斜面的孢子用来在含有250ml培养基的1L烧瓶中产生接种体，所述培养基的组成为(克/升)酵母提取物-3、蛋白胨-5和葡萄糖-10(GYEP)，并在28°C、220rpm下温育24h。发酵罐用500ml(10%v/v)的24h时有生长力的接种体接种。7.5L发酵罐中的生产培养基(4.5L)含有2%商品级葡萄糖、0.3%酵母提取物作为基础培养基。3%浓度的大豆粕用作诱导剂。通气和搅拌器速度分别保持在3-4rpm和350-400rpm，温度保持在26-28°C。2-3天之后在无细胞肉汤中的活性是36-40IU/ml。 

实施例6 

本实施例说明了利用布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185，通过在搅拌和通气的受控条件下在仪表化的发酵罐中浸没发酵来制备蛋白酶。发酵在具有50L工作容积的75L发酵罐中进行。遵循下列发酵参数进行生产：3日龄MGYP斜面作为原料；在培养基中生长的15h龄预接种体，所述培养基的组成是(克/升)酵母提取物-3、蛋白胨-5和葡萄糖-10(GYEP)；在培养基中生长的15h龄接种体，所述培养基的组成是(克/升)酵母提取物-3和葡萄糖-10(GYE)；生产培养基含有2%商业葡萄糖、0.16%肥料级磷酸氢二铵(DAP)和3%大豆粕(SBM)。开始，将SBM与消泡剂一起在121°C灭菌30min。冷却后，添加葡萄糖和DAP，并再灭菌20min，在正压力下放置到接种。整个发酵期间，温度保持在28-30°C。搅拌初始保持在80rpm，并缓慢增加到在发酵结束时最大120rpm。通气开始保持在0.8vvm，在36h后增加到1.2-1.4vvm。2-3天之后在无细胞肉汤中的活性是36-40IU/ml。 

实施例7 

本实施例说明利用平板分析检测布尔弗雷德耳霉MTCC 5185分泌的脂肪酶活性。酶平板分析在含有25ml Mikami培养基的一次性陪替氏平皿中进行，所述培养基由(克/升)葡萄糖-1.5、酵母提取物-1.5、蛋白胨-5、牛肉浸膏-5、琼脂-20和1%乳化三丁酸甘油酯组成。来自2日龄斜面的孢子悬液用于制备GYE接种体，所述接种体的组成是(克/升)：酵母提取物-3和葡萄糖-10。生长24小时后，将一环生长物斑点接种到所述陪替氏平皿上并在28°C温育72h。生长中的真菌菌落周围观察到由于三丁酸甘油酯降解产生的透明区，表明所述生物体分泌脂肪酶(图3)。 

实施例8 

本实施例说明了利用平板分析检测布尔弗雷德耳霉菌株MTCC5185的壳多糖酶活性。平板分析在一次性陪替氏平皿中25ml含有0.01%酸胀壳多糖的2%琼脂中进行。来自3日龄斜面的孢子接种在生产培养基中，所述培养基的组成是(克/升)：酵母提取物-3；葡萄糖-10 和酸胀壳多糖-0.1，并在28°C下以180-200rpm振荡培养。在24、48和72h后取样，并在所述皿上制成的孔中添加50μl无细胞上清液，在37°C温育1h。为了检测壳多糖酶活性，将所述皿充满0.1%ranipal15min，然后用蒸馏水洗涤两次，每次30min。在紫外线灯下观察所述皿。样品斑点周围观察到由于壳多糖降解产生的浅蓝透明区，表明所述真菌菌株分泌壳多糖酶(图4)。添加无菌水的地方(孔1)没有透明区，而且透明区随着发酵时间增加，在72h样品(孔4)中观察到最大透明区。 

实施例9 

本实施例说明利用平板分析检测布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185分泌的硫酸软骨素酶活性。酶平板分析在一次性陪替氏平皿中进行，其中含有补充了牛血清清蛋白(BSA)和硫酸软骨素A的MGYP琼脂培养基。麦芽浸膏-0.15g、酵母提取物-0.15g、蛋白胨-0.25g、葡萄糖-0.5g溶解在40ml蒸馏水中，添加1g琼脂并压热灭菌。BSA(500mg)和硫酸软骨素A(20mg)溶解在10ml蒸馏水中并过滤灭菌，添加到所述培养基中和倒入无菌陪替氏平皿中。来自2日龄斜面的孢子悬液用于接种GYE培养基，所述培养基的组成是(克/升)：酵母提取物-3和葡萄糖-10。生长24小时后，10%(v/v)营养生长的生长物被转移到含有(克/升)葡萄糖-20、磷酸氢二胺-1.6、大豆粕-30的培养基中，并在28°C、180rpm下温育。48h后，一满环生长物被斑点接种到所述平皿上并在28°C温育。四天后，将所述平皿充满2N乙酸并让它在室温下静置15分钟。与BSA结合的未降解硫酸软骨素A产生不透明的外观，而菌落周围可见透明区，表明硫酸软骨素酶的分泌导致硫酸软骨素A的水解(图5)。 

实施例10 

本实施例说明了利用布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185通过浸没发酵来制备脂肪酶。来自2日龄斜面的孢子悬液用于制备葡萄糖酵母提取物种子培养物，所述培养物的组成是(克/升)：酵母提取物-3和葡萄糖-10。其在28°C下在旋转振荡器上温育24小时，并用来启动摇瓶实验。发酵在摇瓶中在含有(克/升)蛋白胨-5、牛肉浸膏-5、酵母提取 物-1.5、葡萄糖-1.5.的Mikami培养基中进行。2%浓度的橄榄油用作脂肪酶生产的诱导剂。培养基被调整到pH 7。利用对硝基苯基丁酸酯作为底物，用分光光度法测定3天后无细胞肉汤中的脂肪酶活性，活性在0.5-0.6IU/ml范围之内。 

实施例11 

本实施例说明各种油和脂肪对布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185通过浸没发酵的脂肪酶生产的诱导效应。来自2日龄斜面的孢子悬液用于制备葡萄糖酵母提取物种子培养物，所述培养物的组成是(克/升)：酵母提取物-3和葡萄糖-10。其在28°C下在旋转振荡器上温育24小时，并用来启动摇瓶实验。发酵在摇瓶中在含有(克/升)蛋白胨–5、牛肉浸膏–5、酵母提取物-1.5、葡萄糖-1.5.的Mikami培养基中进行。2%浓度的下列油用作脂肪酶生产的诱导剂：豆油、橄榄油、葵花籽油和三丁酸甘油酯。培养基被调整到pH7。通过滴定法测定4天后无细胞肉汤中的脂肪酶活性。大豆、橄榄和葵花籽油时脂肪酶活性范围在0.41-0.43U/ml之间，而三丁酸甘油酯给出更高的活性，0.63U/ml。 

实施例12 

本实施例说明了利用布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185，通过浸没发酵来制备蛋白酶和脂肪酶。来自2日龄斜面的孢子悬液用于接种发酵培养基，所述发酵培养基的组成是(克/升)：麦芽糖提取物-3，蛋白胨-5，葡萄糖-10，酵母提取物-3。培养基被调整到pH7。大豆粕(2%)和大豆油（1%）被分别用作蛋白酶和脂肪酶生产的诱导剂。3天后无细胞肉汤中蛋白酶和脂肪酶活性分别通过酪蛋白水解法和滴定法测定。蛋白酶和脂肪酶活性分别在12-15IU/ml和1-1.2IU/ml范围内。 

实施例13 

本实施例说明了利用布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185通过浸没发酵来制备壳多糖酶。来自3日龄斜面的孢子悬液用于制备葡萄糖酵母提取物种子培养物，所述培养物的组成是(克/升)：酵母提取物-3和 葡萄糖-10。其在28°C下在旋转振荡器上温育24小时，并用来启动摇瓶实验。发酵在摇瓶中在含有(克/升)蛋白胨–5、牛肉浸膏–5、酵母提取物-1.5、葡萄糖-1.5.的Mikami培养基中进行。1%浓度的壳多糖用作壳多糖酶产生的诱导剂。培养基被调整到pH7。2和3天后无细胞肉汤中的壳多糖酶活性分别为0.011IU/ml和0.016IU/ml。 

实施例14 

本实施例说明了利用布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185通过浸没发酵来制备蛋白酶和壳多糖酶。来自3日龄斜面的孢子悬液用于制备葡萄糖酵母提取物种子培养物，所述培养物的组成是(克/升)：酵母提取物-3和葡萄糖-10。其在28°C下在旋转振荡器上温育24小时，并用来启动摇瓶实验。发酵在摇瓶中在含有(克/升)葡萄糖-20、壳多糖-0.1、磷酸氢二铵-1.6的培养基中进行。培养基被调整到pH7，并添加3%浓度的大豆粕作为诱导剂。2天后无细胞肉汤中的蛋白酶和壳多糖酶活性分别为25-29IU/ml和0.014-0.016IU/ml。 

实施例15 

本实施例说明了利用布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185通过浸没发酵来制备蛋白酶和昆布多糖酶。来自3日龄斜面的孢子悬液用于制备葡萄糖酵母提取物种子培养物，所述培养物的组成是(克/升)：酵母提取物-3和葡萄糖-10。其在28°C下在旋转振荡器上温育24小时，并用来启动摇瓶实验。发酵在摇瓶中在含有(克/升)葡萄糖-20、壳多糖-0.1、磷酸氢二铵-1.6的培养基中进行。培养基被调整到pH7，并添加3%浓度的大豆粕作为诱导剂。2天后无细胞肉汤中的蛋白酶和昆布多糖酶活性分别为26-28IU/ml和0.95-1.21IU/ml。 

实施例16 

本实施例说明了利用布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185通过浸没发酵来制备蛋白酶和角蛋白酶。来自2日龄斜面的孢子悬液用于制备葡萄糖酵母提取物种子培养物，所述培养物的组成是(克/升)：酵母提 取物-3，葡萄糖-10。其在28°C下在旋转振荡器上温育24小时，并用来启动摇瓶实验。发酵在摇瓶中在含有(克/升)蛋白胨–5、牛肉浸膏–5、酵母提取物-1.5、葡萄糖-1.5的Mikami培养基中进行。培养基被调整到pH7，并将鸡羽毛(1%)分别添加到每个烧瓶中作为角蛋白酶的诱导剂。摇瓶在旋转振荡器(200rpm)上在28°C下温育48h。角蛋白酶活性根据Bressollier等(Applied Environmental Microbiology,Vol.65(6),2570-2576,1999测定。一单位的酶活性被定义为引起在595nm的吸光度每分钟增加0.01所需要的酶量。24和48h后无细胞肉汤中的蛋白酶活性分别是3.34IU/ml和7.90IU/ml。24和48h的角蛋白酶活性分别是150.02和252.45U/ml。 

实施例17 

本实施例说明了利用布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185，通过浸没发酵来制备蛋白酶和硫酸软骨素酶。如实施例28所述的Amicon浓缩的酶样品显示出蛋白酶和硫酸软骨素酶活性分别为222.12U/ml和0.1-0.16U/ml。 

实施例18 

本实施例说明了利用布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185，使用各种碳源通过浸没发酵来制备蛋白酶。来自2日龄MGYP斜面的孢子用于制备种子培养物，所述培养物的组成是(克/升)葡萄糖-10、酵母提取物-3。其在28°C下在旋转振荡器上温育24小时，并用来启动摇瓶实验。发酵在摇瓶中在含有(克/升)碳源-10、酵母提取物-3、大豆粕-30的培养基中进行。1%浓度的果糖、葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖醇和淀粉用作碳源。摇瓶在旋转振荡器(200rpm)上在28°C下温育72h。48h样品的活性在附表2中提供，并形成本说明书的部分。发现葡萄糖是最好的碳源。 

表2：碳源对布尔弗雷德耳霉MTCC 5185产生蛋白酶的影响 

  碳源   相对活性(%)   葡萄糖   100.00   甘油   27.54   淀粉   19.35   甘露糖醇   33.42   乳糖   44.47   果糖   54.10

实施例19 

本实施例说明诱导剂对利用布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185通过沉浸发酵制备蛋白酶的影响。来自3日龄MGYP斜面的孢子用于制备种子培养物，所述种子培养物的组成是(克/升)葡萄糖-10、酵母提取物-3。其在28°C下在旋转振荡器上温育24小时，并用来启动摇瓶实验。发酵在摇瓶中在含有(克/升)葡萄糖-10、酵母提取物-3、诱导剂-20的培养基中进行。使用下列诱导剂：大豆粕、棉籽饼、芥菜籽饼、花生饼、鹰嘴豆粉、绿豆（mung dal）粉、大豆蛋白、脱脂乳、胰蛋白胨、酪蛋白和酪蛋白氨基酸。摇瓶在旋转振荡器(200rpm)上在28°C下温育72h。48h样品的活性在附表3提供，并形成本说明书的部分。所有试验诱导剂都引起蛋白酶生产。 

表3：诱导剂对布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的蛋白酶生产的影响 

  诱导剂   相对活性(%)   大豆粕(2%)   100.00   棉籽饼(2%)   69.50   芥菜籽饼(2%)   43.41   花生饼(2%)   74.64   鹰嘴豆粉(2%)   46.76   绿豆粉(2%)s   54.07   大豆蛋白(2%)   69.97   脱脂乳(1%)   69.75   胰蛋白胨(1%)   149.77   酪蛋白(1%)   57.98   酪蛋白氨基酸(1%)   143.50

实施例20 

本实施例说明了利用布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185，使用不同浓度的大豆粕作为诱导剂，通过浸没发酵来制备蛋白酶。来自2日龄MGYP斜面的孢子用于制备种子培养物，所述培养物的组成是(克/升)葡萄糖-10、酵母提取物-3。其在28°C下在旋转振荡器上温育24小时，并用来启动摇瓶实验。发酵在摇瓶中在含有(克/升)葡萄糖-10、酵母提取物-3、大豆粕-0、10、20、30、40、50的培养基中进行。摇瓶在旋转振荡器(200rpm)上在28°C下温育72h。48h样品的活性在附表4提供，并形成本说明书的部分。 

表4：大豆浓度对布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的蛋白酶生产的影响 

  大豆粕（%）   相对活性(%)   0   5.58   1   46.53   2   66.72   3   80.98   4   100.00   5   28.16

实施例21 

本实施例说明了利用布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185，在20至45°C温度范围内通过沉浸发酵的蛋白酶生产。来自3日龄斜面的孢子悬液用于制备MGYP种子培养物，所述培养物的组成是(克/升)：麦芽浸膏-3，酵母提取物-3，蛋白胨-5和葡萄糖-10。其在28°C下在旋转振荡器上温育24小时，并用来启动摇瓶实验。生产在摇瓶中的含有(克/升)麦芽浸膏-3、酵母提取物-3、蛋白胨-5和葡萄糖-10、大豆粕-20的MGYP液体培养基中进行，并调整到pH6.5-7。所述烧瓶在旋转振荡器(200rpm)，在20到45°C范围的温度下温育48h。在20到37°C的温度范围中观察到蛋白酶生产，在28°C时活性最高(表5)。 

表5：温度对布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的蛋白酶生产的影响 

  温度(°C)   相对活性(%)   20   82.42   28   100   37   20.31   45   0.87

实施例22 

本实施例说明了利用布尔弗雷德耳霉菌株MTCC 5185，在5到10 的pH范围内通过浸没发酵来制备蛋白酶。来自3日龄斜面的孢子悬液用于制备GYE种子培养物，所述培养物的组成是(克/升)：酵母提取物-3和葡萄糖-10。其在28°C下在旋转振荡器上温育24小时，并用来启动摇瓶实验。发酵在摇瓶中在含有(克/升)葡萄糖-20、酵母提取物-3、大豆粕-20的培养基中进行。通过添加无菌NaOH或HCl，培养基pH在pH5到10之间变动。摇瓶在旋转振荡器(200rpm)上在28C下温育48h。在5到10的pH范围中观察到蛋白酶生产(表6)。 

表6：pH对布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的蛋白酶生产的影响 

  pH   相对活性(%)   5.00   98.91   5.45   100.00   6.12   96.75   7.59   90.26   8.40   87.39   9.00   74.17   9.50   45.50   10.05   29.00

实施例23 

本实施例说明了所述菌株分泌活性蛋白酶的pH范围。为了确定蛋白酶的最适pH，所述酶在从5到12的不同pH的缓冲液中稀释和分析。使用0.1M浓度的下列缓冲液：乙酸盐(pH5)，磷酸钠缓冲液(pH6，7)，Tris HCl缓冲液(pH8)和碳酸盐碳酸氢盐(pH9和10)，磷酸钠-NaOH(pH11，12)和KCl-NaOH(pH12.0)。结果在附表7中提供，并形成本说明书的一部分。观察到酶在pH6和11之间是有活性的。 

表7：蛋白酶的最适pH 

  pH   相对活性(%)   5.10   3.04   5.94   15.88   7.03   55.83   8.11   63.95   9.01   100.00   10.11   61.66   11.00   30.37   11.97   3.52   12.15   1.09

实施例24 

本实施例说明了所述菌株分泌活性蛋白酶的温度范围。为了确定最适温度，用温度从30到70°C的碳酸盐碳酸氢盐缓冲液(0.1M，pH9)测定了蛋白酶活性实验结果在附表8中示出并形成本说明书的一部分。观察到酶在30到60°C之间是有活性的。 

表8：蛋白酶的最适温度 

  温度(°C)   残余活性(%)   30   17.26   40   66.71   50   100.00   60   13.39   70   4.81

实施例25 

通过40°C时在pH7.0的磷酸盐缓冲液中将粗制蛋白酶温育直至2h，测定所述蛋白酶在40°C在时间方面的稳定性。所述粗制蛋白酶如实施例4中所述产生。以15min的规律间隔取等份试样，并在50°C、 pH9下估算残余活性。结果在表9中示出，其中所述蛋白酶在40°C下直至2h都是稳定的，并保留大约60%的活性。 

表9：蛋白酶在40°C下的温度稳定性 

  时间(min)   残余活性(%)   0   100.00   15   99.24   30   97.96   45   94.54   60   88.91   75   81.53   90   76.14   105   67.27   120   59.54

实施例26 

本实施例说明了通过冷冻干燥浓缩蛋白酶。将如实施例4所述并具有36.33U/ml活性的蛋白酶(100ml)冻干6小时(-55°C)，直至液体完全蒸发，留下干燥的吸湿性粉末。所述冻干粉末溶解在去离子水中，并估算蛋白酶活性。冻干样品显示出活性为191.88U/ml。发现蛋白酶的回收率超过95%。这表明所述蛋白酶对冷冻干燥稳定。 

实施例27 

本实施例说明了通过超滤浓缩蛋白酶。如实施例4所述产生的蛋白酶以10,000rpm离心。活性为25.84IU/ml的澄清上清液(1200ml)在Amicon膜滤装置中在分子量截止值为3,000道尔顿的YM-3膜上浓缩。浓缩后体积是150ml，蛋白酶活性为206.72IU/ml。过滤后回收率是95-98%。在另一种装置中，1000ml上清液也在PM-10膜(10,000道尔顿截止值)上浓缩到100ml，回收率为85%。 

实施例28 

本实施例说明了通过90%饱和的硫酸铵沉淀来浓缩蛋白酶。如实施例6所述产生的蛋白酶以10,000rpm离心。活性为31.29IU/ml的澄清上清液(1000ml)用于浓缩。在4°C，通过在缓慢的连续混合下添加600g硫酸铵，进行沉淀。再继续搅拌2h以完全沉淀并使之在冷却中沉降。倾析出澄清的上清液，并将悬液体积缩小到250ml，产生4倍浓缩的蛋白酶。将以10,000rpm离心后得到的沉淀物溶解在pH8的10mMTris HCl缓冲液中之后，评估悬液中的蛋白酶活性。蛋白酶的回收率为90%以上，并且悬液中的活性118.12IU/ml。 

实施例29 

本实施例说明来自布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的蛋白酶在清洁剂存在下的稳定性。如实施例4所述产生的粗制蛋白酶与0.7mg/ml清洁剂(终浓度)一起在40°C温育直至1h。每隔15min取样，测量残余活性，将与相应的清洁剂在一起时的初始活性作为100%，表示为初始活性的百分比。所述蛋白酶在所有清洁剂存在下都是稳定的，并在15分钟后取决于清洁剂保留了75-94%活性(表10)。甚至在1h后，仍保留35-50%左右的活性。 

表10：蛋白酶在清洁剂存在下的稳定性 

实施例30 

本实施例说明了布尔弗雷德耳霉MTCC 5185分泌的蛋白酶在各 种金属存在下是有活性的。使用如实施例4所述产生的粗制蛋白酶。在金属存在下估算蛋白酶活性。制备金属的储液(100mM)，并以5mM的终浓度添加到所述分析混合物中。实验结果在附表11中示出并形成本说明书的一部分。蛋白酶在Ca、Cd、Co、K、Mg和Mn存在下是有活性的，而Ni和Zn产生35-40%抑制。Cu和Hg完全抑制所述蛋白酶活性。 

表11：金属对蛋白酶活性的影响 

  金属(5mM)   相对活性(%)   Nil   100   AgNo₃  -   CaCl₂  118.25   CdCl₂  114.30   CoCl₂  118.71   CuCl₂  12.78   CuSO₄  -   HgCl₂  3.27   KCl   158.50   MgCl₂  132.24   MgSO₄  135.87   MnCl₂  104.49   MnSO₄  108.39   NiCl₂  65.60   ZnCl₂  60.27   ZnSO₄  58.03

实施例31 

本实施例说明了所述菌株分泌的蛋白酶活性能稳定1h的温度范围。为了确定温度稳定性，将如实施例27所述超滤的粗制蛋白酶在4到70°C的温度下温育1h，并在50°C、pH9中测量残余活性。结果在表12中示出，其中可以看出所述酶直至50°C都是稳定的。 

表12：蛋白酶的温度稳定性 

  温度(°C)   残余活性(%)   4   100.00   30   96.54   40   89.55   50   43.81   60   0.84   70   0.45

实施例32 

本实施例说明了蛋白酶在50°C的稳定性。所述蛋白酶的三个不同样品通过在50°C温育所述蛋白酶直至2h，来确定在50°C时相对于时间的稳定性。如实施例4、27和28所述的粗培养物滤液、硫酸铵沉淀物和超滤(膜)蛋白酶用于稳定性研究。以30min的规律间隔取等份试样，并在50°C、pH9下估算残余活性。结果在表13中示出，其中所有蛋白酶样品在50°C下30min之后，保留了60%以上的活性。发现硫酸铵沉淀样品更稳定，其在2h之后保留了40%左右的活性，而培养物滤液和PM-10截留物在2h后保留了25-27%左右的活性。 

表13：蛋白酶在50°C的温度稳定性 

 时间(min)   粗培养物滤液   硫酸铵沉淀物   PM-10截留物   0   100.00   100.00   100.00   30   62.33   67.80   60.30   60   44.84   55.54   44.01   90   33.30   51.17   32.51   120   25.56   40.86   27.23

[0179] 实施例33 

本实施例说明了蛋白酶在糖醇存在下的稳定性。如实施例27所述的超滤蛋白酶在20%浓度的甘油、甘露糖醇、山梨糖醇和木糖醇存在下，在50°C温育直至3h。以30min的规律间隔取等份试样，并在50°C、pH9下估算残余活性。结果在表14中示出。所有糖醇都增加酶的稳定性，并且在3h之后保留了30%以上的活性。它们当中，山梨糖醇对蛋白酶提供了更高的热稳定性，使蛋白酶具有47%残余活性。 

表14：蛋白酶在糖醇存在下在50°C时的温度稳定性 

实施例34 

本实施例说明了蛋白酶在山梨糖醇和海藻糖存在下的稳定性。如实施例27所述的超滤蛋白酶在20、40和50%山梨糖醇和海藻糖存在下，在50°C温育直至4h。以600min的规律间隔取等份试样，并在50°C、pH9下估算残余活性。结果在表15中示出。稳定性随着海藻糖和山梨糖醇的浓度增加而增加。用50%山梨糖醇和海藻糖，热稳定性增加了接近5至6倍，即便在4h之后，仍保留了接近80%的活性，而没有添加剂的对照显示出12.67%的残余活性。 

表15：在海藻糖和山梨糖醇存在下，蛋白酶在50°C时的温度稳定性 

实施例35 

本实施例说明了蛋白酶在盐存在下的稳定性。如实施例27所述的超滤蛋白酶在10mM CaCl₂、0.5M NaCl、0.5M甘氨酸和15%硫酸铵存在下在50°C温育直至3h。以30min的规律间隔取等份试样，并在50°C、pH9下估算残余活性。结果在表16中示出。在所有盐的存在下，稳定性增加。氯化钙和硫酸铵对热变性提供了更高的保护，其中残余活性在3h之后是55%左右，而对照显示出残余活性在20%左右。 

表16：蛋白酶在盐的存在下在50°C的温度稳定性 

实施例36 

本实施例说明了与水混溶的以及与水不混溶的有机溶剂在28°C对粗制蛋白酶稳定性的影响。使用下列有机溶剂：丙酮，乙腈，1-丁醇，二甲基亚砜、异丙醇和甲醇。如实施例4所述产生的粗制蛋白酶在28°C与20%(v/v)有机溶剂(有效浓度)一起温育。以不同的时间间隔取样，并估算残余活性。没有有机溶剂的样品用作对照。与相应溶剂一起时的初始活性作为100%(表17)。蛋白酶在除丁醇之外的有机溶剂存在下是稳定的，直至5h时，在丁醇中显示出75.26%残余活性，而在所有其他溶剂中均保留了95%以上的活性。在28C温育12h之后，除丁醇之外的蛋白酶保留了50%以上的活性，而丁醇中的残余活性为40%左右(表17)。 

表17：28°C时蛋白酶在有机溶剂存在下的稳定性 

实施例37 

本实施例说明了与水混溶的以及与水不混溶的有机溶剂在37°C对粗制蛋白酶稳定性的影响。使用下列有机溶剂：丙酮，乙腈，1-丁醇，二甲基亚砜、异丙醇和甲醇。如实施例4所述产生的粗制蛋白酶在37°C、pH7下与20%(v/v)有机溶剂(有效浓度)一起温育。以不同的时间间隔取样，并估算残余活性。没有有机溶剂的样品用作对照。与相应溶剂一起时的初始活性作为100%(表18)。蛋白酶在除乙腈、丁醇和异丙醇之外的有机溶剂存在下是稳定的，2h之后，在乙腈、丁醇和异丙醇中显 示出少于35%残余活性，而在丙酮、甲醇和二甲基亚砜中保留了50%以上的活性(表18)。 

表18：37°C时蛋白酶在有机溶剂存在下的稳定性 

实施例38 

本实施例利用NMITLI-1和胶原酶-1底物，通过荧光研究说明了来自布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的蛋白酶的非胶原酶性质。初始的荧光实验用针对NMITLI-1底物的粗制和纯化的蛋白酶进行。荧光实验在室温下在pH 8的三乙醇胺缓冲液(TEA)中执行。典型地，所述分析包含290μl pH8的100mM TEA缓冲液，所述缓冲液具有1.8μM的NMITLI-1底物浓度(112μM储液10μl)。所述反应通过添加5μl酶样品来引发。激发波长为340nm，而发射以不同的时间间隔从425-625nm进行扫描。AEDANS发色团的荧光增加了三倍(+++)，表明所述酶样品的蛋白水解性质。 

NMITLI底物-I

Dabcyl-Gaba-Arg-Pro-Leu-Gly-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-Gaba-Cys-Lys-NH₂

│ 

AEDANS 

因为粗制和纯化的蛋白酶样品显示出针对NMITLI-1底物的活性，还用胶原酶底物-I筛查了它们的胶原酶活性。荧光实验在室温下在pH8的三乙醇胺缓冲液(TEA)中进行。典型地，所述分析包含290μl pH8的100mM TEA缓冲液，所述缓冲液具有1.6μM浓度的底物(胶原酶底物-I)(80μM储液5μl)。所述反应通过添加5μl酶样品来引发。激发波长为340nm，而发射以不同的时间间隔从425-625nm进行扫描。AEDANS发色团的荧光没有增加(-)，表明没有胶原酶活性。 

胶原酶底物–I

Dabcyl-Gaba-Lys-Gly-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gly-Gly-Cys-Lys-NH₂

│ 

AEDANS 

这些结果表明，来自布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的粗制和纯化蛋白酶针对胶原酶底物-1是无活性的，说明了所述蛋白酶的非胶原酶性质。 

实施例39 

本实施例说明来自布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的蛋白酶对于弹性蛋白-苔黑素的活性测定。反应混合物在pH8.0的50mM Tris HCl缓冲液中含有适当稀释的蛋白酶等份和20mg弹性蛋白-苔黑素，总体积为3ml。热失活的酶(煮沸15min)作为空白。在50C温育30min之后，在Whatman 1号滤纸上过滤内容物，并测量578nm处的吸光度。一单位的酶活性被定义为引起在578nm处的吸光度在一分钟内增加一个单位所需要的酶量。如实施例28所述的硫酸铵沉淀悬液具有酪蛋白水解活性118.12IU/ml，其显示出针对弹性蛋白-苔黑素的活性为3.84U/ml。 

实施例40 

本实施例说明来自布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的蛋白酶的偶氮骨胶原活性测定。反应混合物在pH8.0的0.05M Tris HCl缓冲液中含有适当稀释的蛋白酶等份和10mg偶氮骨胶原，总体积为2.5ml。热失活的酶(煮沸15min)作为空白。在37°C温育10min之后，通过Whatman 1号滤纸过滤，终止反应。测量滤液在580nm处的吸光度。一单位的酶活性被定义为引起在578nm处的吸光度每分钟增加一个单位所需要的酶量。如实施例3所述生长的粗制培养物滤液具有16-18U/ml的偶氮骨胶原活性。 

实施例41 

本实施例说明来自布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的蛋白酶的偶氮酪蛋白活性测定。反应混合物在pH9.0的0.05M碳酸钠缓冲液中含有适当稀释的蛋白酶等份和1mg偶氮酪蛋白，总体积为500μl。热失活的酶(煮沸15min)作为空白。在50°C温育30min之后，通过添加500μl的10%TCA终止反应。在冰上冷却15min之后，将内容物以8000rpm离心10min。向800μl上清液中添加200μl的1.8M NaOH，并测量420nm处的吸光度。一单位的酶活性被定义为引起在420nm处的吸光度每分钟增加一个单位所需要的酶量。如实施例3所述生长的粗制培养物滤液显示出40-45U/ml的活性。 

实施例42 

本实施例说明来自布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的粗制蛋白酶对于N-α-苯甲酰基-DL-精氨酸-对硝基苯胺(BAPNA)的活性。分析混合物由0.16ml的3mM N-α-苯甲酰基-DL-精氨酸-对硝基苯胺(BAPNA)的DMSO溶液、0.5ml pH7.2的50mM磷酸盐缓冲液和0.1ml适当稀释的酶样品组成，将所述混合物在37°C温育1h。通过添加0.5ml 1M Na₂CO₃终止反应。测量420nm处的吸光度。一个单位的活性被定义为在一分钟内引起410nm处的吸光度增加一个单位所需要的酶量。如实施例3所述的酪蛋白水解活性为20.7U/ml的粗酶，显示出1.41U/ml的活性。 

实施例43 

本实施例说明以酪蛋白、血红蛋白和牛血清清蛋白作为底物，来自布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的蛋白酶的活性测定。如实施例3所述生长的粗制培养物滤液在PM-10膜上通过超滤浓缩，并用于本研究。反应混合物在pH9.0的0.1M碳酸钠缓冲液中含有适当稀释的蛋白酶等份和10mg底物，总体积为2ml。在50°C温育10min之后，通过添加3ml 5%三氯乙酸(用浓盐酸酸化)来终止反应。在室温下静置30min之后，通过Whatman 1号滤纸过滤所形成的沉淀物。在280nm测量三氯乙酸可溶性级分的吸光度。所述蛋白酶能够以不同程度降解上述底物(表19)。 

表19：对底物的活性 

  底物   相对活性(%)   酪蛋白   100.0   血红蛋白   82.31   牛血清白蛋白   53.71

实施例44 

本实施例说明抑制剂对布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的蛋白酶活性的影响。研究了下列抑制剂：苯甲基磺酰氟(PMSF)，乙二胺四乙酸(EDTA)，碘乙酸和二甲基亚砜(DMSO)。如实施例3所述生长的粗制培养物滤液如实施例27所述在PM-10膜和YM-3膜上通过超滤浓缩，并用于抑制研究。两种蛋白酶制剂与各种抑制剂在100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中预先温育1h，并在50°C、pH9.0下测量残留的蛋白酶活性。没有抑制剂的蛋白酶作为对照。蛋白酶被1mM PMSF完全抑制，表明它是丝氨酸蛋白酶(表20)。 

表20：抑制剂的影响 

实施例45 

本实施例说明抑制剂对布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的蛋白酶活性的影响。研究了下列抑制剂：N-甲苯磺酰基-L-苯基丙氨酸氯甲基酮(TPCK)，N-甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮(TLCK)，和苄脒。粗制蛋白酶在100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中与各种抑制剂预温育，并在50°C、pH9.0下测量残留的蛋白酶活性。没有抑制剂的蛋白酶作为对照。TPCK和TLCK分别抑制了9和29%，而苄脒没有抑制，表明所述蛋白酶不具有胰蛋白酶样活性(表21)。 

表21：抑制剂的影响 

  抑制剂   浓度   抑制(%)   对照   -   0   TPCK   5mM   9.02   TLCK   5mM   29.22   苄脒   5mM   0

实施例46 

本实施例说明了所述菌株分泌活性脂肪酶的pH范围。为了测定脂肪酶的最适pH，在50°C和pH4至9下通过滴定法检定所述酶。使用下列缓冲液：乙酸盐(pH4和5)，磷酸盐(pH6，7)，Tris HCl(pH8)和 碳酸盐碳酸氢盐(pH9)。结果在附表22中提供，并形成本说明书的一部分。观察到所述酶在pH4到9之间是有活性的。 

表22：来自布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的脂肪酶的最适pH 

  pH   相对活性(%)   4   11.08   5   15.27   6   60.00   7   100.00   8   43.08   9   29.17

实施例47 

本实施例说明了所述菌株分泌活性蛋白酶的温度范围。为了确定最适温度，在pH 7和温度30至60°C下通过滴定法测定脂肪酶活性。试验结果在附表23中示出并形成本说明书的一部分。观察到所述酶在30至60°C之间是有活性的。 

表23：来自布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的脂肪酶的最适温度 

  温度(°C)   相对活性(%)   30   18.70   40   58.54   50   100.00   60   56.91

实施例48 

本实施例说明了布尔弗雷德耳霉MTCC 5185向均质性的纯化。真菌如实施例4所述生长，以10,000rpm离心10min之后得到的澄清上清液用作酶源。在4°C执行肉汤的分级硫酸铵沉淀，将析出的硫酸铵沉淀物(50-80%饱和)加载到用pH7.0的50mM磷酸盐缓冲液平衡的二 乙基氨乙基纤维素(DEAE-纤维素)柱(2.5cmx25cm)上。未吸附的酶用pH7.0的50mM磷酸盐缓冲液以20ml/h的流速洗脱。合并显示出蛋白酶活性的级分，通过真空离心浓缩并负载在用pH7的50mM磷酸盐缓冲液平衡的Sephadex-G-100柱(1.2cmX150cm)上。柱用pH7.0的50mM磷酸盐缓冲液以12ml/h的流速洗脱。合并显示出蛋白酶活性的级分，并储存在-20°C。 

实施例49 

本实施例说明通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALD-TOF)来确定纯化蛋白酶的纯度和分子量。SDS-PAGE的分子质量标记试剂盒来自M/sBioRad(目录号161-0305)，由碳酸酐酶(35.88kDa)、大豆胰蛋白酶抑制剂(27.86kDa)、溶菌酶(18.81kDa)、牛血清清蛋白(87.55kDa)、磷酸化酶b(101.47kDa)和卵清蛋白(52.74kDa)构成。通过SDS-PAGE发现所述酶的分子质量在29kDa左右，稍低于碳酸酐酶的分子量(图6)。 

纯化的蛋白酶的分子质量还通过使用配备有37-nm氮激光器的Voyager DE-STR(Applied Biosystems)，利用MALDI–TOF质谱来测定。纯化的酶与等体积的乙腈中的芥子酸混合，将20μl制备的样品放在MALDI平板上用于分析。所述纯化的酶在MALDI-TOF中显示出分子量27.8kDa(图7)，几乎与通过SDS-PAGE得到的29kDa分子量相似。 

实施例50 

如实施例6所述产生的粗制蛋白酶用10%和15%麦芽糖糊精作为添加剂，采取入口温度150-160°C，出口温度分别为60-65°C和70-80°C，进行喷雾干燥，回收率为70-80。在4°C至37°C的温度下研究喷雾干燥的蛋白酶的稳定性。样品分配在小瓶中，储存在4°C、28°C和37°C。以有规律的间隔取出在各温度下温育的一个小瓶，并检查残余活性。喷雾干燥的蛋白酶在所有试验温度下直到25个月(760天)都是稳定的，并保留了85-90%活性(图8a和8b)。 

实施例51 

本实施例说明利用布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的粗制蛋白酶、生物质滤液和生物质，从废X-射线胶片除去银。将5g黑色X-射线胶片切入成1cmx1cm碎片，用蒸馏水洗涤。这些碎片在250ml锥形烧瓶中，与20U蛋白酶在总体积50ml、pH9的10mM碳酸盐碳酸氢盐缓冲液中以37°C和180rpm温育。没有蛋白酶的对照也在相同条件下温育。在几分钟内明胶层开始从胶片剥除，并在1h内完成。由于银带黑色，溶液看起来发黑，并且胶片是白色透明的(图9a)。对于利用生物质滤液清除，将生物体在组成为(克/升)麦芽浸膏-3、酵母提取物-3、蛋白胨-5和葡萄糖-10的MGYP液体培养基上，在200rpm振荡和28°C下生长24h。通过10,000rpm离心，收集到4克生物质(湿重)，用50ml重蒸馏水洗涤两次并悬浮在50ml蒸馏水中，在28°C、180rpm下温育。2h后，通过在Whatman 1号滤纸上过滤，收集滤液。两克洗涤过的X-射线胶片(切成2cmx2cm碎片)与50ml生物质滤液在37°C以及200rpm振荡下进行温育。没有生物质滤液的对照在相同条件下温育。在几分钟内明胶层开始从胶片剥除，并在1h内完成。由于银带黑色，溶液看起来发黑，并且胶片是白色透明的(图9b)。对于利用生物质清除，真菌在如上所述的MGYP液体培养基中在28°C、200rpm下有氧生长24h。通过离心收获生物质并用重蒸馏水洗涤两次。湿的生物质(0.1g)作为糊施涂在洗过的X-射线胶片(3cmx2cm)上并在37°C温育。1h后观察到明胶层完全脱除和透明的胶片外观(图9c)。 

实施例52 

本实施例说明来自布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的蛋白酶对于丝脱胶的用途。丝股在烘箱中110°C干燥3h(或直至达到恒重)。1g干燥的丝与如实施例3所述制备的粗制蛋白酶在50°C和间断的手动振荡下温育1h。四种不同的蛋白酶浓度(50至200U/g丝)用于脱胶。固体与液体比率保持1:30。脱胶之后，用自来水洗涤丝纤维(冷洗)，接着是热洗(65°C 20min)。洗涤之后，丝被风干过夜，然后在烘箱(110-120°C)中干 燥2到3h(或直至达到恒重)，并记录脱胶丝的重量。由初始和最终重量之差计算脱胶后的重量损失。脱胶后的重量损失随着酶浓度增加而增加，范围从13到22%(表24)。常规脱胶的纤维的重量损失是24.4%左右。得到的纤维感觉光滑并且光泽(图10a&b)。扫描电子显微照片显示丝胶被除去，但没有影响纤维的强度特性(图11a&b)。脱胶液中的不溶性残渣(由丝胶除去产生)随着蛋白酶浓度增加而增加(图12)。 

表24：脱胶后的重量损失 

  蛋白酶(U/g)   重量损失(%)   50   13.49   100   17.485   150   18.275   200   22.619

实施例53 

本实施例说明来自布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的蛋白酶对于丝脱胶和从脱胶液分离丝胶蛋白质/肽的用途。4g丝股在烘箱中110°C干燥3h(或直至达到恒重)并与如实施例3所述制备的800U蛋白酶在50°C和间断的手动振荡下温育1h。固体与液体比率保持1:30。脱胶之后，用自来水洗涤丝纤维(冷洗)，接着是热洗(65°C 20min)。洗涤之后，丝被风干过夜，然后在烘箱(110-120°C)中干燥2到3h(或直至达到恒重)，并记录脱胶丝的重量。脱胶后的重量损失是20%左右。通过6000rpm离心5min，从脱胶液(DGL)分离不溶性丝胶(发白的残渣)。将这种不溶性残渣悬浮在重蒸馏水中，并进行十二烷基硫酸盐钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。将通过常规方法(在121压热处理60min)得到的丝胶包括在内用于比较。在酶脱胶的情况下，银染色后显现三条蛋白带，而通过常规方法得到的丝胶的凝胶上有一条条纹，表明它被完全降解(图13)。 

实施例54 

本实施例说明利用来自布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的粗制蛋白酶，通过糊贴法对山羊皮脱毛的方法。如实施例6所述产生的蛋白酶进行硫酸铵沉淀(90%饱和)并用于脱毛研究。取盐湿山羊皮并浸泡6小时。浸泡后，记录皮的重量。将以浸泡重量为基准0.5至1.5%蛋白酶和10%水的糊剂施加在皮的肉面并堆放6小时。还使用10%石灰、3%硫化物和15%水，执行相应的基于化学的对照方法。对照皮也堆放6小时。对照和试验皮均被去毛，试验皮的脱毛功效在85至100%的范围，发现类似于基于化学的脱毛方法的脱毛功效。生皮清洁，没有皮垢。脱毛的生皮被鞣制并进一步加工成坯革，还评定了坯革的质量。皮革在抗张强度、撕裂强度和粒面崩裂强度方面的质量可与通过石灰和硫化物基脱毛得到的皮革相比。还通过分析对照和试验方法的废液，评价污染负荷的降低。结果表明COD和硫化物明显减少。发现试验方法的废液的BOD/COD比率是0.72，表明废水的可降解性和可处理性比化学方法体系的废水好得多，后者的BOD/COD比率是0.4。 

实施例55 

本实施例说明利用来自布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的粗制蛋白酶对牛皮脱毛的方法。如实施例6所述产生的蛋白酶进行硫酸铵沉淀(90%饱和)并用于脱毛研究。盐湿牛皮被洗涤和浸泡8小时。浸泡之后，记录皮的重量。所述皮在筒中使用15%水和3-4%酶处理。还使用150%水、10%石灰和3%硫化钠，执行相应的基于化学的对照方法。在试验方法的情况中，所述筒每小时间歇运转10分钟。运转六个小时之后，洗涤生皮。脱毛是100%。在对照的情况下，所述筒以每小时5分钟，间歇运转一天。第二天，生皮被去毛并且脱毛功效是100%。试验生皮清洁，没有皮垢。脱毛的生皮被鞣制并进一步加工成坯革，还评定了坯革的质量。皮革在抗张强度、撕裂强度和粒面崩裂强度方面的质量可与通过石灰和硫化物脱毛方法得到的皮革相比。还通过分析对照和试验方法的废液，评价污染负荷的降低。结果表明，在试验情况下，COD和硫化物明显减少，BOD/COD比率为0.69，表明废水的可降解性和可处理性增强。 

实施例56 

本实施例说明利用来自布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的粗制蛋白酶，通过糊贴法对绵羊皮脱毛的方法。所述蛋白酶如实施例6所述产生。将其进行硫酸铵沉淀(90%饱和)并用于绵羊皮的脱毛研究。洗涤湿盐绵羊皮并浸泡5小时。浸泡后，记录皮的重量。制备以浸泡重量为基准0.5至1.5%蛋白酶和10%至15%水的糊剂，并施加在皮的肉面上。将皮堆放6小时。还使用10%石灰、3%硫化物和15%水，执行相应的基于化学的对照方法。对照皮也堆放6小时。对照和试验皮均被去毛，试验皮的脱毛功效在85至100%的范围，发现类似于基于化学的脱毛方法的脱毛功效。生皮清洁，没有皮垢。脱毛的生皮被鞣制并进一步加工成坯革，还评定了坯革的质量。皮革在抗张强度、撕裂强度和粒面崩裂强度方面的质量可与通过石灰和硫化物基脱毛得到的皮革相比。还通过分析对照和试验方法的废液，评价污染负荷的降低。结果表明COD和硫化物明显减少。发现试验废液的BOD/COD比率是0.70。这表明来自试验的废水的可降解性和可处理性提高。 

实施例57 

本实施例说明利用来自布尔弗雷德耳霉MTCC 5185的粗制蛋白酶对水牛皮脱毛的方法。如实施例6B所述产生的蛋白酶进行硫酸铵沉淀(90%饱和)并用于脱毛研究。取盐湿水牛皮，洗涤并浸泡8小时。浸泡之后，记录皮的重量。所述皮在筒中使用15%水和3-4%酶处理。还使用150%水、10%石灰和3%硫化钠，执行相应的基于化学的对照方法。在试验情况中，所述筒每小时间歇运转10分钟。运转六个小时之后，洗涤生皮。脱毛是100%。在对照的情况下，所述筒以每小时5分钟，间歇运转一天。第二天，生皮被去毛并且脱毛功效是100%。试验生皮清洁，没有皮垢。脱毛的生皮被鞣制并进一步加工成坯革，还评定了坯革的质量。皮革在抗张强度、撕裂强度和粒面崩裂强度方面的质量可与通过石灰和硫化物脱毛方法得到的皮革相比。还通过分析对照和试验方法的废液，评价污染负荷的降低。结果表明，在试验情况 下，COD和硫化物明显减少，BOD/COD比率为0.74，表明废水的可降解性和可处理性增强。 

实施例58 

本实施例描述在清洁剂制剂中应用蛋白酶。将一块白布浸在血中并晾干。有血迹的布被切成四等份，每份0.5g，并在4个不同的陪替氏平皿中浸在2%甲醛中2min，并用水漂洗以除去过量甲醛。将布块浸在30ml反应混合物中并在不同的条件下在28-30C温育30min：(a)对照(只有水)；(b)只有清洁剂；(c)只有粗制蛋白酶(10U)；和(d)清洁剂+粗制蛋白酶(10U)。布块用自来水漂洗4次。在清洁剂和蛋白酶一起使用时，洗涤性能最好。只有清洁剂不能除去血凝块，而蛋白酶能够单独除去血迹以及血凝块(图14)。 

本发明的主要优点如下： 

1.所述真菌菌株是新分离的。 

2.本发明描述的真菌菌株能够产生单个的和连同壳多糖酶、脂肪酶、硫酸软骨素酶和角蛋白酶的蛋白酶。 

3.这些酶混合物具有许多工业应用，例如皮革、纺织、清洁剂和食品工业。 

4.已经评价了所述蛋白酶在皮革工业的预鞣制操作中的应用。 

5.粗制蛋白酶可以对动物皮/生皮脱毛而不需要添加任何化学品如石灰和硫化物。 

6.粗制蛋白酶制品具有广泛的底物特异性，并可以根据皮革和清洁剂工业应用中的需要降解各种蛋白质，例如白蛋白、血红蛋白、明胶、角蛋白。 

7.所述粗制蛋白酶可以用于丝脱胶。 

8.在用所述蛋白酶进行酶脱胶之后，可以从废液分离附加价值的产物如丝胶肽。