使用纳米孔进行单分子检测的系统和方法

摘要

一种使用集成电路进行单分子检测的系统和方法，所述集成电路包括至少一个薄膜，所述薄膜具有一个位于第一储槽和第二储槽之间的纳米孔，还包括一个低噪声前置放大器，所述低噪声前置放大器具有一个形成于其表面上的电极。该方法包括目标分子穿过所述纳米孔，如果有电流通过该纳米孔，测量电流以检测生物分子实体的存在。

说明书

有关申请的相互参考

本申请要求2011年2月23日提交的美国专利申请序号61/445，918的优先 权益，其内容在此被全部纳入作为引用。

背景技术

本公开主题涉及单分子检测。DNA测序系统要求是单分子的、大规模并行 而且是实时的。但是，对于单分子光学技术而言，单个荧光团产生的信号可小 于2500光子/秒（大约相当于电流水平的50fA）。这可引起繁杂的光学系统尽 力收集所有的释放出来的光子，使系统平台的标度更为困难。相反，可有意减 缓相关的化学反应至1Hz（或更低），使这些微弱的含噪光学信号具有足够的成 像时间。

相比之下，电化学检测方法的信号水平（通常高出数个数量级）要高得多， 其通过对转换器、检测器和放大器进行适当的联合设计实现高带宽检测。纳米 孔技术是一种有潜力的生物电子转换机制。但是，纳米孔由于生物分子停留在 微孔的电荷敏感区内的时间相对较短而受到限制。由于受到自有电荷使用的限 制，纳米孔测量的噪声限制带宽通常低于100kHz，因此限制了有效传感和启动 机制，从而使所有测序应用都将要求的多路复用一体化难以实现。

发明内容

本发明公开了一种使用纳米孔进行单分子检测的新型改良系统和方法。

本公开主题提供了基于电晶体或生物纳米孔传感器电化学电导调制的单分 子检测和分析，所述生物纳米传感器包括一个具有集成微电极的低噪声多通道 微观尺度的前置放大器。在一个实施例中，纳米孔传感器包括一个具有集成微 电极的低噪声多通道CMOS前置放大器。

在一些实施例中，所述微电极可为压铸银/氯化银（Ag/AgCl）微电极。例 如，可采用“双芯片”解决方案，在该方案中，微孔和测量电子元件可分别设置在 相邻的管芯上，或者采用“单芯片”解决方案，在该解决方案中，微孔直接与具有 测量电子元件的基底集成。在一些实施例中，前置放大器的表面暴露于电解液 储槽中的一个。

本发明还提供了放大器芯片中电晶体纳米孔的集成。通过将氮化硅薄膜或 石墨烯薄膜中的纳米孔集成到同一芯片上作为测量电极，可减小寄生电容（例 如，小于1pF），使纳米孔具有完整的高频率电子特性。

在另一个实施例中，提供了一种使用集成电路进行单分子检测的方法，所 述集成电路包括至少一个具有位于第一储槽和第二储槽之间的纳米孔的薄膜和 一个低噪声前置放大器，所述低噪声前置放大器具有一个形成于其表面上的电 极。该方法包括以下步骤：一个目标单分子穿过所述纳米孔，如果有电流通过 纳米孔，则测量电流以检测生物分子实体的存在。

在一些实施例中，所述前置放大器包括一个低噪声多通道CMOS前置放大 器。制成电极的材料范围包括Ag/AgCl、铂金、黄金和未氯化的银。

在一些实施例中，纳米孔位于与前置放大器相邻的硅片上。或者，纳米孔 包括一个直接集成穿过前置放大器的纳米孔。在这样的实施例中，第一储槽和 第二储槽可位于前置放大器相对的两侧上。

在一些实施例中，纳米孔可包括一个电晶体纳米孔或生物纳米孔。薄膜可 以是脂质双分子层。集成电路可包括多个纳米孔。

在一些实施例中，集成电路还包括一个球栅阵列和一个印制电路板。

在另一个实施例中，提供了一种用于单分子检测的集成电路。该集成电路 包括至少一个具有一个纳米孔的薄膜和一个低噪声前置放大器，所述纳米孔位 于第一储槽和第二储槽之间，所述低噪声前置放大器用于测量目标实体通过纳 米孔时引起的孔内电流变化。所述前置放大器具有至少一个形成于其表面上的 电极。

附图并入本公开主题并且是本公开主题的组成部分，举例说明了本公开主 题的若干实施例，并解释了本公开主题的原理。

附图说明

本公开主题的更多特征、性质和许多优点将出现在下文中对主题和附图的 详细描述中，其中：

图1是根据本公开主题一些实施例的电晶体纳米孔芯片的电子阻抗示意 图；

图2是根据本公开主题一些实施例的电压钳位电流前置放大器的电学模型；

图3是根据本公开主题一些实施例的纳米孔测量噪声的典型谱线密度曲线 图；

图4是根据本公开主题一些实施例的单分子与纳米孔相互作用产生的电流 脉冲类型图解；

图5是根据本公开主题一些实施例的紧凑型纳米孔测量平台示意图；

图6a和6b是根据本公开主题一些实施例的前置放大器电路拓扑结构示意 图；

图7是根据本公开主题一些实施例的用于替代反馈电阻的低噪音电源的电 路设计；

图8a、8b、8c和8d是根据本公开主题一些实施例的片上电极制作过程图片；

图9是根据本公开主题一些实施例的双芯片叠式测量单元示意图；

图10是根据本公开主题一些实施例的通过纳米孔的DNA分子的瞬时测量 曲线图；

图11是根据本公开主题一些实施例的后制作的氮化硅薄膜的局部剖面示意 图；

图12是根据本公开主题一些实施例的显示了集成纳米孔的一系列模板图 片；

图13是根据本公开主题一些实施例的测量到的模拟的输入参考噪声曲线 图；

图14是根据本公开主题一些实施例的单芯片封装示图；

图15是根据本公开主题一些实施例的DNA通过纳米孔传感器的曲线图；

图16是根据本公开主题一些实施例的纳米孔输入参考噪声对于测量带宽的 曲线图；

图17是根据本公开主题一些实施例的噪音限制带宽曲线图；

图18是根据本公开主题一些实施例的具有多个纳米孔的单个芯片封装示 图；

图19是根据本公开主题一些实施例的具有多个纳米孔的双芯片封装示图；

图20是根据本公开主题一些实施例的在CMOS集成纳米孔平台（CNP）结 构表面上建立脂质双分子层的示意图；

图21是根据本公开主题一些实施例的电流噪声测量曲线图；

图22是根据本公开主题一些实施例的使用CNP平台对25bp双链DNA片 段在偏压为600mV下通过微孔（即微孔B）的连续追踪记录；

图23是根据本公开主题一些实施例的显示出较高测量带宽对收集的纳米孔 传感器统计数据有影响的事件的集合；

图24是根据本公开主题一些实施例的使用短低聚物和小纳米孔观测到的内 部事件结构展示。

遍览所有图纸，除另有说明外，均采用相同的附图数字和字符来表示所阐 述实施例的相似特征、原理、组成或比例。此外，虽然参照附图对现有公开主 题有详细描述，但要结合说明性实施例来实现。

具体实施方式

本发明提供了利用纳米孔传感器进行单分子检测的新型的改进技术。本发 明通过采用并行纳米孔测量极大地降低输入电容、提高噪声性能、改善纳米孔 检测电子元件的噪声限制带宽、减小物理尺寸以及提高生产能力。

纳米孔传感器为单分子电化学系统，在该系统中，两个电解液储槽（即水 盐缓冲剂）被一个具有单个纳米级微孔的薄膜分开。每个储槽中分别设置有多 个电极，通过在容器间产生一个电压梯度，使带电分子穿过微孔，分子的通过 引起微孔的电化学传导性发生瞬时变化。测量到的电流与溶解离子穿过微孔相 对应，当一个分子，如DNA，穿过微孔时，离子电流产生瞬时变化。这种电子 传感器至少有两种特性使其具有单分子敏感性。第一种特性是微孔本身的局部 (纳米等级)几何构造具有电荷敏感性。微孔的直径d可为1～10纳米，由于电解 液的电荷屏蔽性，测量到的电流对于距微孔数纳米以上的电荷源十分敏感。纳 米孔的第二特性是其高度敏感性，这是通过使用高流动性的盐离子来推断出移 动相对较慢的生物分子的存在而实现的。

对纳米孔传感系统中带宽的分析与对电压钳电生理学记录的分析相似，不 同之处在于起作用元素的数量级可以有很大差别。由于这些系统产生的瞬时信 号微弱，其有效信号带宽通常不由小信号频率响应决定，而是由信噪比（SNR） 决定。离子通道内噪声处理的详细报告常常指明信号幅度为10pA或更小的情 况，在这些情况下，相关带宽通常小于10kHz。但是，纳米孔传感器通常使用更 为浓缩的电解液和更高的保持电位，因此α－溶血素可产生100pA的电流脉冲， MspA产生300pA的电流脉冲，电晶体纳米孔产生超过4nA的电流脉冲。

如图1所示，纳米孔模型是一个离子电阻R_P与入口电阻R_A串联，同时还 有一个支撑薄膜结构上的并联电容C_M。此外，电容与电极线路（C_W）、放大器 输入级（C_I）和放大器反馈元件（C_FB）连接。这种设置的对应电路如图2所示。

如图3所示，纳米孔电流测量的噪声谱具有几个不同区域。在低频率区域 （<100Hz），出现了由纳米孔传导产生的1/f噪声和热噪声。在中等频率区域 （100Hz～10kHz），出现了在纳米孔或测量电子器件中产生的白噪声，除此之外 还有损耗的介质材料产生的热噪声（图3）。在高频率区域（>10kHz），主要的 噪声源是放大器的电压噪声间的相互作用，总电容出现在输入节点上。在这种 情况下，输入参考噪声谱密度按i_n²≈(2πfC)²*e_n变化，式中e_n为放大器的等效输 入电压噪声功率。数值C为多个不同物理电容的总和：具有纳米孔的薄膜充当 第一储槽和第二储槽之间（即顺式和反式）的电容；在电极与放大器之间的所 有线路上均可出现杂散电容；而且放大器本身在输出时还具有特征电容。薄膜 电容可能是这三种电容中最大的一个，可达到数百皮法拉。但是，通过限制流 体与芯片的接触区域或在芯片表面形成一层厚的电介质保护膜可极大减少噪 声。由于减小了薄膜电容（C_MEMBRANE），关注焦点转移至电极线路电抗和放大器 输入。通常情况下，已知的电生理放大器的输入电容（C_IN）约为15pF，而且数 皮法拉的线路电容（C_WIRING）不稳定，这就使纳米孔传感器的性能受到限制。

更详细地，输入参考功率谱密度为：

S_n²(f)≈[2πf(C_M+C_W+C_I+C_FB)v_n]²   (1)

均方根噪声通过下式计算：

$I_{\mathrm{RMS}}\left(B\right)\approx \frac{2\pi }{\sqrt{3}}{B}^{\frac{3}{2}}(C_M+C_W+C_I+C_{\mathrm{FB}})v_n---\left(2\right)$

式中，v_n是输入放大器的电压噪声密度(V/√Hz)，B是测量带宽。

为了获得信噪比（SNR）权值，预先设定信号水平为ΔI，即分子出现在微 孔内引起的电流平均变化。对应的SNR是测量带宽的函数，由ΔI/I_RMS(B)计算 可得。这是个非常有用的公式，但它没有考虑信号本身在不同测量带宽也被过 滤这个因素。当信号量超出可用带宽时，为了更准确地评估性能，SNR通过下 式进行计算：

$\mathrm{SNR}(B,\tau )=\frac{\mathrm{\Delta I}}{I_{\mathrm{RMS}}\left(B\right)}\frac{1}{\sqrt{1+\frac{1}{2\mathrm{B\tau }}}}---\left(3\right)$

式中，τ是如图4所示的信号发生变化的最短时间，附图在此仅为说明用途。 这种改变的结果是SNR不必随着测量带宽的降低而减小。如果信号中包含暂短 瞬时事件，尽管I_RMS值较高，SNR可因带宽较宽而增大。

结合这些公式，可以确定保持可行信噪比（SNR_MIN）的最大带宽（B_MAX）。 如果τ<100μs且B＞＞1/2τ，测量带宽的最大值通过下式进行计算：

$B_{\mathrm{MAX}}\approx {\left[\frac{\mathrm{\Delta I}\sqrt{3}}{{\mathrm{SNR}}_{\mathrm{MIN}}x2\pi (C_M+C_W+C_I+C_{\mathrm{FB}})v_n}\right]}^{\frac{2}{3}}---\left(4\right)$

显而易见，可用带宽B_MAX因信号水平（ΔI）较大而增大，因电容和放大器 电压噪声较大而减小。这些公式中的所有电容与纳米孔无关，因此电容增大不 会影响微孔本身的性能。

根据本公开主题的一个方面，CMOS集成纳米孔平台（CNP）主要以低噪 声电流前置放大器和高性能电晶体纳米孔或生物纳米孔（下文将做详细说明） 为基础。如图5所示，在0.13μm混合信号CMOS程序中，前置放大器电路系统 占地面积为0.2mm²，直接设置在流体室内。在一个实施例中，一个设计为高导 电率和低电容的细氮化硅纳米孔被放入放大器上方的流体室内，下文将对此做 详细说明。与依赖外部电生理学放大器（如Axopatch200B（Molecular Devices 公司生产）或EPC-10（HEKA Electronik GmbH公司生产）的传统测量方法相比， 所得平台提高了高频噪声性能。CNP的平面放大器设计也很适合于并行操作， 其增加的射流技术对纳米孔阵列的反式腔室进行了隔离，因此该平台可支持多 通道检测（下文将对此做详细说明）。

此处描述的CMOS集成电路技术只出于说明目的而非限制本发明，本公开 主题可使用所有集成电路技术，例如但不局限于COMS、双极、SiGE、任意节 点以及本领域技术人员所熟知的其他适合的集成电路技术。

在一个实施例中，芯片具有多通道前置放大器，例如具有图6a（图6b是电 路的详细说明）所示技术的8通道前置放大器，此处举例仅出于说明目的。每 个通道都由一个电荷灵敏前置放大器构成，其低噪声跨导可传递任意DC电流。 通道还包括可设计的有效负电容，其能够扩展带宽，但不会减小输入参考噪声。 跨导器接入反馈回路中并进行调谐，使整个跨阻增益具有与100MΩ增益的标准 电阻反馈级类似的一级反应。衰减器‘1/A’被设计为一个滤波器，信号频率不断 减弱，但在极低频率时具有高增益，因此它抑制了输出端的直流偏移，增大了 动态范围。通过调整增益级G的回路增益对频率响应进行调谐。与标准的高增 益跨阻放大器相似，整个响应出于稳定原因不能扩展至任意高的频率，简易滤 波级（未显示）与放大器输出端串联，以数字化前恢复其平坦的频率响应。C_F的值可设计为1pF、100pF或50pF，OTA的增益带宽积为100MHz。每个通道 的总输入电容为1pF+C_F。

除前置放大器外，芯片可具有其他任意电路系统。例如但不局限于，芯片 可包括数据转换器、数字信号处理、逻辑操作、存储器、以及/或者本领域技术 人员熟知的其他任意适宜的电路系统。

标准的0.13μm1.5V混合信号程序可使用3x3mm模板，每个前置放大器的 占地面积约为0.3mm²，消耗功率5mW。可选择地，八个跨阻放大器每个占地面 积0.2mm²，采用图2所示的电路拓扑结构。虽然本文中的一些结论中仅使用一 个通道，但是这些通道是独立的，如下文所述，在使用恰当的流控技术时可以 同时进行八个或更多设备持续测量。此外，可以使用任意适当数量的通道。标 准跨阻拓扑的几个元素使设计更适合于新型集成电路技术。特别地，必须在没 有高电阻值时获得明确规定的高跨阻增益。如果纳米孔没有明显的直流偏流， 纯粹的电容反馈将是合适的。因此，CNP取代传统的反馈电阻作为直流伺服回 路，具有有效低噪声电源，形成图7所示的跨阻增益为100MΩ的封闭回路。一 个可做数字性选择的反馈电容器C_F和增益元件G通过减小封闭回路增益30kHz 以上来保持回路的稳定性，前置放大器后设置一个滤波器以将平坦的增益响应 恢复到>1MHz。输入级在设计上对栅级漏电忽略不计并且栅电容低于1pF。当 C_F=0.15pF时，前置放大器的总输入电容为C_I=1.3pF，电压噪声为v_n=5ηV/√Hz， 1.5V电源消耗功率为5mW。

前置放大器和流体元件设置于15cm乘13cm的印刷电路板上，该印刷电路 板具有功率调节、偏压和模拟信号通路。该电路板由四节AAA电池供电，总电 流为30mA，可持续使用一整天。数字控制接口电绝缘，信号输出完全不同。第 二电路板包括一个四极点贝塞尔抗混滤波器、多个模数转换器和一个高速USB 接口。

根据本公开主题的一方面，薄膜电极（例如Ag/AgCl）设置于放大器芯片的 表面，在前置放大器和电解液之间形成一个电化学直接接口。亚毫米尺寸的集 成放大器使微观尺度的电极可对密度进行控制。因此，根据本公开主题在芯片 上设置薄膜电极减小了体积并提高了设计的可扩展性。根据一个优选实施例， 电极可为Ag/AgCl微电极，其具有优良的电压钳测量性能。但是，其他可以使 用的电极包括但不局限于：铂、黄金、未氯化的银和本领域技术员所熟知的其 他适宜的电极。

例如，在用于制造模板的典型0.13μm工艺中，顶部暴露的金属为铝，其不 适于化学环境。铝在磷酸中被化学腐蚀掉，露出下面的粘合物和扩散阻挡层。 数微米大的银从含有氰化银钾水溶液（马萨诸塞州丹佛斯市Transene公司生产） 中电化学析出。用氯化铁对表面进行处理，在电极表面形成氯化银涂层。出于 说明目的，图8给出了制作程序图片。图8a所示为来自铸造厂的电极。图8b 所示为暴露的铝被电化学腐蚀掉。图8c所示为数微米大的银电化学析出。图8d 所示为银被FeCl₃氯化，形成Ag/AgCl微电极。用该工艺生产出的电极在毫安级 的电流中可稳定运行数小时。

根据本公开主题一些实施例，提供一个双芯片叠式测量元件。这种定制测 量元件可使独立的纳米孔芯片与具有有效电化学表面电极的集成前置放大器连 接。出于说明目的，如图9所示，一个独立的纳米孔芯片可安装在使用 KWIK-CAST硅酮胶的特氟龙流体元件（弗罗里达州萨拉索市的World Precision  Instruments公司生产）内，并直接设置于放大器上。

在该元件中，反式储槽与放大器的微电极直接接触，一个单独的氯化银导 线作为顺式电极。注意，与放大器输入节点相比，由于这个反电极仅提供直流 偏压，任何线路寄生效应都不会对其产生巨大影响。

根据本公开主题的一方面，在双芯片结构中对DNA过孔事件进行测量以对 放大器和集成Ag/AgCl电极进行说明。在偏压300mV下，在氯化钾缓冲剂（例 如1M KCl，1mM EDTA，pH8.0）中进行测量。将λDNA（马萨诸塞州Ipswitch 公司的新英格兰生物实验室有售）加入顺式腔室中，如图10所示，产生的电流 轨迹显示出独特的双态瞬时反应，此附图仅出于说明目的。

根据本公开主题一些实施例，提供单芯片纳米孔和前置放大器芯片集成以 及电晶体纳米孔在前置放大器芯片的后制作程序。例如，在芯片的设计过程中， 留出数个200x200μm大的区域以供在后期制作悬浮电介质窗口。在芯片的这些 区域中，金属布线层被阻挡，因此形成约8μm厚的交替叠加的玻璃填充层和氮 化硅覆盖层。使用电感耦合CHF₃+O₂或SF₆等离子体将大部分电介质叠层的前 侧腐蚀掉，将脱水铬作为防护罩。PECVD（等离子增强化学气相沉积）Si₃N₄防护罩在模板背面上沉淀并刻蚀后，芯片安装在PDMS（等离子体解吸质谱仪） 元件内以保护前侧性能，硅基片中的局部开口在30%（重量百分比）热KOH中 各向异性地被磨蚀。在经缓冲液处理过的氢氟酸中短暂浸泡以将50nm的氮化硅 单层与原始电介质隔离形成悬浮膜。最后，在高分辨度透射电子显微镜下钻透 这些氮化物薄膜制备纳米孔。最终的窗口结构的横截面如图11所示，图12所 示为其中一个纳米孔（直径约为6nm厚）的TEM（透射电子显微镜）图像。如 图12的模板图片所示，这种设计可以使每个芯片的四个电晶体纳米孔与各微孔 周围的电子器件结合为一体。但是，通过减小微孔电子器件的覆盖面积可将四 个以上的纳米孔集成在相同尺寸的单个模板上。

由于没有外部输入，放大器显示与模拟一致的测量到的输入参考噪声，如 图13所示，此附图仅出于说明目的。低频率时噪声谱密度约为12fA/√Hz，相当 于一个110MΩ电阻。正如所预料的，频率达到10kHz以上时，噪声对于输入电 容非常敏感。

根据一些实施例，提供一种支撑芯片两侧电解液储槽的后处理集成电路封 装，如图14所示，该附图仅出于说明目的。为了将电路运行时的电势与电解液 偏压隔离，对电路实施三阱隔离。作为后处理的一部分，设置背面绝缘钝化层 以防止基片与溶液之间发生电化学相互作用。这种方案曾用于使用外部Ag/AgCl 电极进行湿式电测。出于说明目的，图15所示为100mV偏压下在1M KCl中 20ng/μL15kbp双链DNA的DNA穿孔实验结果。

根据一些单芯片实施例，“顶部”Ag/AgCl电极通过将Ag电镀到现有CMOS 芯片上的金属垫片上与模板结合为一体（如图14所示）。为了将C_MEMBRANE降至 1pF以下，电解液与芯片的接触面缩小到250μm乘250-μm，同时具有一个15μm 乘15μm的氮化物窗口。芯片中后端互连层形成一个8μm厚的电介质叠层（如 图11所示），产生的电容仅为4.4pF/mm²。微孔附近的薄膜可变薄至小于10nm， 进一步提高了信号水平。这些超薄薄膜将有助于提高纳米孔设备的空间分辨率， 并且独一无二地通过集成电子学实现高时间分辨率。如图14所示，芯片封装还 包括球栅阵列封装和印刷电路板以适应湿环境。值得注意的是，“底部”Ag/AgCl 电极使用外部电极不会降低检测的噪声限制带宽，这是因为只有微孔放大器侧 的电容产生噪声。

仅出于说明目的而非限制本发明，图16为RMS噪声总值图表，其可适用 于多种情况。容许噪声水平取决于被测量的信号，但对于适宜的电晶体纳米孔 感应情形，噪声限制带宽可界定为在此带宽时水平噪声大于100pA_rms。情形A 接近于目前最先进的技术，测得一个独立放大器的C_IN=15pF,C_WIRING=10pF, C_MEMBRANE=60pF。例如，Axopatch200B膜片钳放大器（美国加州森尼韦尔 Molecular Devices公司）为低噪声仪器，已在电生理学应用方面进行改进，具有 与纳米孔传感器相近的系统规定参数。但是，如前所述，当频率高于约10kHz 时，决定放大器噪声密度的主要因素为输入电容总值。在这种情况下，一个独 立的放大器无法达到整体解决方案的要求。此外，一个紧迫的实际问题是 Axopatch不支持高于100kHz的信号频率。情形B对于最低噪声进行评测，这 种最低噪声可能在独立放大器的C_MEMBRANE减小到1pF以下而C_IN和C_WIRING保 持不变时产生。而这表明比当今最新技术先进数倍，有效带宽通过线路分布和 放大器寄生效应仍能得以保持。情形C模拟了使用C_IN=1pF且C_WIRING=0的集成 放大器的额外优势。轨迹D标出了根据本公开主题没有微孔连接时测得的前置 放大器输入本底噪声（C_MEMBRANE=C_WIRING=0）。可以看出，根据本公开主题使用 前置放大器的整体解决方案要优于使用大家熟知的放大器的方法。

仅出于说明目的而非限制本发明，图17所示为信号水平为1nA时噪声限制 带宽，用Axopatch测量所得带宽与用根据本公开主题的集成放大器测量所得带 宽作为C_MEMBRANE的函数进行比较。对于C_MEMBRANE<1pF，超出1MHz的带宽 可由根据本公开主题的集成放大器获得。

纳米孔的信号保真度对于放大器输入端处的附加电子元件极为敏感，包括 微孔薄膜产生丝毫电容（图1）。氮化硅纳米孔形成于硅基片上薄薄的悬浮电介 质窗口内，C_M可模型化为平行板电容，其为的组成要素，式中 □为真空电容率，□_r为电介质的相对电容率，A_i为流体与薄膜基底的接触面积， d_i为电介质厚度。早期电晶体纳米孔的C_M值大于300pF。由于使用了根据本公 开主题的纳米孔（图5），一个50x50μm的悬浮25nm氮化硅窗口由5μm的SiO₂保温层支撑，这极大减小了C_M。此外，在对流体元件安装纳米孔的过程中，薄 膜芯片的表面被硅橡胶覆盖，只留下极小面积暴露于电解液。因此，根据本公 开主题的纳米孔（图5）C_M减小至低于6pF。随着制作的深入，C_M可减小至0.5pF 以下。

测量电子元件的紧密结合还减小了布线电容（C_W）。在具有外部放大器的平 台中，C_W由其他节点（通常大于2pF）的电容性耦合产生，这些节点位于连接 一个Ag/AgCl电极和放大器输入端的短导线上。使用未屏蔽导线（用于减少寄 生电容）时，要求在法拉第笼内进行测量以减少电磁干扰。在CNP设计中， Ag/AgCl表面电极与放大器输入端之间的距离可小于100μm，对于外屏蔽有最 低要求。但是，与流体室直接相邻的电子线路意味着电解液中的离子可电容耦 合到集成电路的金属线路。为最大程度地减少这种影响，放大器芯片表面的电 极所有外部区域都被200μm厚的SU-8所覆盖。这就默认在芯片表面上增加了 6μm的钝化电介质。得到的C_W小于1pF。

根据一些实施例，公开了在同一芯片上制备及封装多个微孔的方法。例如， 多个纳米孔可形成于图14所示的单芯片拓扑结构中，其中，纳米孔直接一体形 成于模板中，芯片两侧采用流控技术。仅出于说明目的而非限制本发明，图18 所示为一种整合多个微孔的方法。在这种方法中，SU-8光刻胶的阱可用于各纳 米孔相互隔离。在这种方法中，由于必须在多个顺式储槽间进行电隔离，如图 18所示，在加入试剂后，可使用一个PDMS帽封闭阱以进行测量。根据这种方 法，可将64个纳米孔完全整合到同一个5mm乘5mm的模板上。在另一个实施 例中，如图19所示，仅出于说明目的而非限制本发明，提供了一种使用相同CNP 设计的双芯片多阱的实施方法。

在一些实施例中，根据本公开主题的CNP平台还可以进行生物纳米孔的整 合。电晶体微孔在可制造方面具有明显优势，其适合于电子学处理（如上文所 述）和较高的微孔信号水平，生物纳米孔包括但不局限于α－溶血素（αHL）或 MspA，其具有多种明显优势，包括强再生性以及由于DNA与微孔之间有较强 的相互作用而具有较低的DNA过孔速度。

在一些实施例中，生物纳米孔可形成于脂质薄膜（通常为1,2-双植烷酰基胆 碱磷酸（DPhPC））中，该脂质薄膜形成于两个流体单元之间的疏水膜中的一个 孔的上方。在将薄膜蛋白添加到其中一个阱时，监测所述单元的两个腔室之间 的导电性，一旦检测到蛋白发生融合，立即进行冲洗。

上述的介质薄膜也可用作脂质双分子层的固体支架，形成比较大的孔洞， 在这些孔洞的上方形成脂质双分子层。例如，平坦的双分子层脂质薄膜（BLM） 在图案化固体支架上被加工出不同的蛋白质通道，固体支架上具有纳米图案化 孔洞（直径约100nm），通过可自组装的单分子层的组装，将BLM直接结合到 黄金表面上。

采用荧光漂白恢复（FRAP）技术来研究这些双分子层薄膜的邻接性。对荧 光素-DHPE与DOPC进行干燥，然后以2.5mg/ml的浓度在水中恢复，在干燥 后，将它们挤压通过多孔薄膜，形成直径50～100nm的单层小泡。图20所示为 FRAP的一些研究结果。研究表明邻近BLM在纳米图案化的基底上的扩散率为 4μm²/s，在SAM-黄金组件上形成的BLM的扩散率为0.8μm²/s。这两个结果都 在0.1～10μm²/s这个理想扩散范围内，这个范围代表形成良好的BLM。这些 BLM的电特性表明高阻抗薄膜的电阻为1.4GΩ-mm²，适于对形成于薄膜中的生 物纳米孔进行进一步电学分析。

仅出于说明目的而非限制本发明，图20所示为使用上述CNP平台通过在 CNP设计表面上建立脂质双分子层对生物纳米孔进行整合的示意图，所述CNP 平台具有形成于介质薄膜中的孔洞。图20a所示为在氮化物薄膜上方形成蛋白 质纳米孔的方法。在这种方法中，在氮化硅（约100～250nm）中形成比上述用 于纳米孔直接整合的孔洞稍大一些的孔洞。可使用αHL，在合并过程中监测导 电性以确保单通道形成，通道形成后立即冲洗。对于在同一芯片上制作多个通 道，可使用偏置电压来减缓合并，使得单个通道的合并完成后偏压产生动态变 化，以防止多重合并。

根据一些实施例，使用上述结合有BLM的CNP平台对生物通道蛋白质进 行整合。图20b所示为通过SAM方法形成蛋白质纳米孔。在这种方法中，电极 表面在后来用黄金涂层而不用银进行处理，用自组装单分子层（SAM）使其功 能化，使流体脂质双分子层具有另外一个表面。烷基硫醇是一种易于在黄金上 形成SAM的材料，因此可形成脂质双分子层的具有导电性的基底。平坦脂质双 分子层内的蛋白质可形成于SAM-黄金组件上。在这种方法中，芯片的背面不需 要电解液；反式储槽可为脂质双分子层与黄金表面之间的液体，而顺式储槽则 在BLM顶部。

根据一些实施例，提供“双芯片”生物纳米孔。这种实施例与上文所述的图9 所示双芯片电晶体纳米孔实施例相似，但是薄膜为自组装脂质双分子层而不是 介质材料。在一个实施例中，脂质双分子层与集成电路芯片的表面接触。

根据本公开主题的一方面，薄膜可为任意一种适当的薄膜，例如但不局限 于氮化硅或石墨烯薄膜。石墨烯薄膜是非常薄的微孔基底，并且能够以亚纳米 长度级进行探测。可使用任何已知的技术（例如通过电子束消融）制备微孔，可 稳定并重复地制备直径小至2nm的微孔。

如上所述，根据本公开主题的纳米孔传感器的前置放大器极大减小了使用 外部放大器测量时出现的电寄生。与目前仅限于低于100kHz的测量仪器相比， 这种新装置可将纳米孔传感器的有效带宽扩展到高于1MHz。这种带宽有利于获 得使用纳米孔进行DNA测序所需的时间分辨率。例如，可观测到短至1μs的单 分子测序。此外，将电晶体单片集成到一块商用CMOS模板上可应用于超敏感 单分子生物传感。

而且，与使用现有外部放大器相比，使用根据本公开主题的纳米孔传感器 的集成前置放大器极大降低了成本和体积。例如，与安装在机架上的大于10kg 的Axopatch放大器相比，集成放大器在CMOS芯片上只占用0.2mm²，并具有 优异的电性能。同时，Axopatch价值约25000美元，而本文提供的放大器若批 量生产只需要约0.1美元。

上述公开主题侧重于微孔导电性的测量，本领域技术人员应明白可使用其 他的传感方式。例如但不局限于使用横向电极监测隧道电流、通过纳米电极测 量电容以及测量与微孔极为相似的石墨烯纳米带或碳纳米管的导电性，这些也 都得益于本文所述的集成测量电子器件。其他跨膜蛋白质电子电导的测量是本 公开主题的另一个用途。本文描述的高带宽生物电子接口的其他应用包括能够 研究快速反应动力学、单分子转运现象、或高分子快速变构。单分子再俘获系 统或封闭回路静电阱同样受益于高带宽传感。

实例

CMOS集成纳米孔平台（CNP）

放大器为一种使用市售IBM0.13μm散装CMOS复合信号处理的定制集成 电路。放大器模板与一个272针球栅阵列（BGA）封装引线键合。围堰填充 （Dam-and-fill）环形环氧树脂封装（市售商品如乐泰胶水Hysol FP4451和 FP4650填充材料）将暴露的金丝键合覆盖，留下模板表面暴露在外。

环形封装后，使用SU-8使芯片表面进一步钝化。在黄色光线下，将一滴SU-8 2015（Microchem公司生产）手工涂敷到放大器模板表面，将环氧树脂封装材料 形成的300μm深的空腔填满。对干燥器施加轻真空15分钟，然后在烤箱中80℃ 预烘干一整晚。芯片暴露于MJB-3UV接触式光刻机中，该光刻机采用铬-玻璃 罩、照射剂量2000mW/cm²以及360nm长通UV滤光片（Omega Optical公司生 产）。在50℃下进行曝光后烘烤30分钟，在SU-8显影剂中显影，得到一层约 200～300μm厚的SU-8，在100x100μm的方形电极周围具有300μm的方形孔。

使用PDMS（如市售的Sylgard184，Dow Corning公司生产）将从聚丙烯管 至BGA封装顶部的1cm片段固定，形成一个水密流体室。此外，将KWIK-CAST （World Precision Instruments公司生产）涂敷到模板表面，只留一个放大器通道 暴露在外。

封装模板后，用移液管移取500μL的A型铝蚀刻剂（马萨诸塞州丹佛斯市 的Transene公司生产）注入流体室，几分钟后用去离子水冲洗。

将芯片安装在一块电路板上，施加功率，运行数字逻辑，分路放大器的反 馈元件，C_F，使电极保持恒定电压，为其提供消除数微安电流的途径。将包含 有氰化银钾（马萨诸塞州丹佛斯市的Transene公司生产）的少量（约1mL）银 电镀液加入流体室内，一条银线反电极与Keithley2400I-V表连接并置于电镀液 中。将电压调整至接收1μA反电极电流数分钟，在电极上沉淀析出约10微米的 银。电镀结束后，用去离子水冲洗腔室多次。

通过向表面涂敷一滴10μL50mM FeCl₃30秒将银微电极转化为Ag/AgCl伪 参比电极。经过数小时的实验后，通常需要重复进行氯化。在银电极用尽以前， 氯化可重复进行多次。

可按照现有技术在超薄氮化硅薄膜内制备纳米孔。简单地说，给一个具有 5um热氧化物的500μm厚的<100>硅片涂上25nm的低应力LPCVD SiN。使用 标准UV光蚀刻对硅片一侧上的方形孔加工图案，通过这种方式使用SF₆等离子 体蚀刻SiO₂/SiN。剥去光刻胶，用各向异性的KOH蚀刻，然后除去SiO₂层，在 硅片另一侧形成约50x50μm的无支撑窗口。

将一层PMMA旋转涂敷在窗口的薄膜侧，使用电子束光刻技术对一个 200x200nm的小方形孔加工图案。SF₆等离子体蚀刻在局部使SiN变薄至约 10nm。在丙酮中培养除去PMMA。用JEOL2010F HR-TEM在氮化物薄膜的变 薄部分钻出一个纳米孔。

使用现有技术在食人鱼酸溶液中（piranha acid）中清洗纳米孔芯片。在对膜 进行清洗和干燥后，立即用KWIK-CAST（World Precision Instruments公司生产） 将其安装到定制特氟龙流体单元上。而且，将KWIK-CAST小心涂抹在芯片面 对薄膜一侧的大部分面积上，在薄膜周围留下小于1mm²面积暴露在外（见图 5e）。

当用Axopatch200B进行测试时，将特氟龙元件置于含有1M KCl10mM Tris 缓冲液的pH8.0的匹配流体单元中。在法拉第笼内，两个自制的Ag/AgCl颗粒 电极分别与探头输入端连接和接地。

对于CNP放大器测试，将电路板置于小铝盒中，下（反式）储槽充满pH8.0 的500uL1M KCl。特氟龙元件内的上（顺式）腔室充满200uL电解液，将该元 件置入放大器室内。将一个Ag/AgCl颗粒电极置入所述顺式腔室。放大器的输 入电压保持不变，而反向电极的直流电势不断变化，以对纳米孔施加偏压。

前置放大器及其附属的流体室设置在一个位于15x13cm电路板上的挤压安 装的BGA插座（Emulation Technologies公司生产）中，并置于一个小铝盒中。 所述电路板包括直流电压调节、偏压线路、模拟信号缓冲和滤波器，所有这些 都是为低噪声操作精心设计的。该前置放大器板由四节AAA电池供电，其数字 接口电镀绝缘。铝盒外的第二接口板具有数字隔离器、抗混滤波器（4极点差分 贝塞尔滤波器，f_c=1MHz）、数据转换器（运行速率为2.5MS/s或4MS/s）和具 有高速USB接口的FPGA模块（例如市售的Opal Kelly XEM3010）。通过写入 Matlab的图形界面对数据采集和系统控制进行实时管理。

使用Matlab软件处理数据。通常使用128阶有限冲激响应低通滤波器对轨 迹进行数字化过滤以获得理想信号带宽，同时保持2～4MS/s的采样速率。通常 使用Matlab中的双态阈值化算法确定事件，但对于低SNR的轨迹，要使用修改 过的算法确定事件。首先，确定哪些样本的值高于5标准偏差，低于平均开孔 电流。接下来，进行局部搜索，找出电流高于开孔电流的最近取样点。最后， 对高于基线电流4标准偏差的信号范围内的第一个点和最后一个点设定事件边 沿时间。

CMOS集成纳米孔平台（CNP）中的噪声测量

图21a所示为测量到的CNP系统（C_F=0.15pF,1MHz的4-极点贝塞尔滤波 器,f_s=4MS/s）的开放探头噪声谱，与类似结构的Axopatch200B（全细胞记录模 式β=1,100kHz的4-极点贝塞尔滤波器,f_s=250kS/s）的基线噪声测量结果做比 较。在低于10kHz的带宽下进行测量时，Axopatch的噪声低于CNP，这是因为 CNP的片上电源的电流噪声为10f A/√Hz（图7），相比之下，Axopatch中500MΩ 的独立反馈电阻产生的电流噪声为5.7f A/√Hz。但是，带宽高于10kHz，CNP 产生的本底噪声极低。对于Axopatch所支持的最高带宽（B=100kHz），CNP的 本底噪声为3.2pA_RMS，相比之下，Axopatch的本底噪声为9pA_RMS。在CNP的 最高带宽（B=1MHz）下，噪声水平为24pA_RMS，相比之下，从推断Axopatch 响应超出其所支持的范围得知噪声水平为247pA_RMS。

当纳米孔与放大器输入端连接时，1/f噪声和薄膜电容的产生将噪声谱提高 到开放探头基线以上，如图21b所示（图中还显示了多项式拟合 式中f为频率（Hz），A、B、C和D为拟合参数）。由于 微孔几何形状和C_M的变化，利用CNP对大约15个电晶体进行了测量，并对微 孔与微孔之间明显的SNR变异性进行观测。在接下来的讨论中，选择分别来自 两个微孔装置（“微孔A”和“微孔B”）的数据进行分析。微孔A（400mV时 d=4.9nm,C_M=6pF,ΔI=882pA）的薄膜电容低于微孔B（400mV时d=3.5nm, C_M=25pF,ΔI=840pA）。图21c显示了作为带宽函数的均方根（RMS）电流噪声， 其与图21a图表中的信号相对应，图21d显示了与图21b中信号相对应的RMS 电流噪声，以及使用与图21a相同结构的Axopatch200B测量的相似纳米孔的 RMS电流噪声。图21e和f显示了对应于图21c和d中各点的电流轨迹。

对于测量的最低电容装置，如微孔A，在CNP中的噪声水平在带宽为100 kHz和1MHz时分别为12.9pA_RMS和155pA_RMS（图21f）。图中还显示与带宽 最高达到100kHz的Axopatch的测量结果的比照。B=100kHz时，CNP的输入 参考噪声功率低两倍以上。如果Axopatch能够在更高带宽下进行测量，在1MHz 时，噪声功率将会有六倍的差异。

在高频率时噪声总体偏低，除此之外，对噪声功率谱（图21b）进行多项式 拟合在中等频率时（>1kHz）显然不需要直线成分，早期报告中用这一点来控 制高频噪声。导致产生直线光谱分量的原因有数种，但CNP的改进可能是由于 纳米孔支持芯片的热氧化SiO₂钝化的优异介电性能。

在CMOS集成纳米平台（CNP）中最大化信号强度

SNR最大化需要最大限度地减小噪声和增大信号幅度。测量的电流信号通 过ΔI=V_BIASΔG计算，式中V_BIAS为施加的偏压，ΔG为分子出现引起的离子电 导性变化。使用细氮化硅纳米孔进行检测的最新结果给出了4nA的双链DNA在 300mV偏压时通过8nm厚薄膜中直径为4nm的微孔时产生的电流脉冲。

对于此处所述的测量，无需支撑的25nm厚的氮化硅薄膜在局部使用SF₆等 离子体变薄，形成大约10～15nm厚的小薄膜区域。利用透射电子显微镜在变薄 区域制作单个纳米孔。制出的微孔直径范围是2～6nm，但3.5～4nm的微孔可获 得最佳信号。所有实验都使用经Tris缓冲处理至pH8.0的1M KCl。

图21g和h所示为微孔A和微孔B的SNR作为测量带宽函数的图表。对于 微孔A，C_M=6pF，ΔI=814pA（(400bp DNA,300mV,N=330）。对于微孔B， C_M=25pF，ΔI=840pA（50bp DNA,400mV,N=2,974）。由于停留时间有很大差异， SNR的范围为1μs<τ<∞。对于微孔A，测量带宽超过600kHz时，SNR保持 在10以上，测量带宽超过1MHz时，SNR保持在5以上。对于微孔B，当测量 带宽达到160kHz和320kHz时，SNR值分别为10和5。图21i绘出了SNR>5 时B_MAX与信号幅度ΔI的函数关系曲线，表明在C_M非常小时，基线放大器本底 噪声与可用测量带宽相对应。

短DNA测量

作为使用CNP的可观测的小时间尺度实例，图22所示为25bp的双链DNA 通过微孔时测得的电流轨迹。对该微孔施加600mV偏压，以2.5MS/s的速率数 字化，然后数字过滤至500kHz(蓝)和100kHz(红)带宽。500kHz轨迹代表微孔 B在这些条件（ΔI=1.3nA,N=1,307）下的SNR>5时的最大带宽，图中还包括 100kHz轨迹与另一平台所支持的带宽的比照。在所示的0.5秒轨迹中，可以见 到29个脉冲，分布在1.2μs到30.2μs这个时间区间内。每隔0.4μs记录一个点， 500kHz轨迹和100kHz轨迹上升和下降时间分别约为1μs和5μs。因此，小于 10μs时，脉冲在500kHz轨迹中清晰可见，但在100kHz时振幅减弱。很明显， 此处提供的数据在室温下测得的。

DNA过孔统计

信号带宽的扩展使人们能够考虑对比以前观测持续时间更短的事件进行统 计。直径为3.5nm时，微孔B小到低聚物过孔时间由表面相互作用而不是电泳 力控制。不仅如此，还观测到过孔时间的巨大差异。图23所示为50bp DNA在 250～450mV偏压下在400kHz（蓝）和100kHz（红）信号带宽的观测到的过孔 时间和深度数据集。图23a显示了事件发生速率是所附加偏压的函数，在200mV 阈值以上时，事件发生速率大体上是线性的，建议使用可控制扩散的俘获机制。 两个带宽的事件发生速率相似，不同之处在于在100kHz时，有一些事件由于高 偏压未观测到（由于过滤），而在400kHz时，有一些事件在低偏压时未观测到 （由于噪声）。图23b显示出了作为施加电势函数的最有可能的停留时间。随着 偏压的增高，事件发生得越快，但在接近所选滤波器的时间分辨率时测得的停 留时间达到饱和。图23c所示为施加电势从250mV到450mV的事件的柱状图。 图23d所示为450mV偏压下观测到的事件散布图表。短于10μs的事件在100kHz 测量带宽时严重失真、数量减少。

在两种带宽下观测到的事件相似，在阈值200mV以上时呈现出随偏压而变 的线性趋势。但是，事件持续时间随偏压增加而缩短，短至2μs的事件在带宽 400kHz时最为突出，而在带宽100kHz时，短于10μs的事件实然减少，其停留 时间在接近滤波器的瞬时反应时达到饱和。这种失真对事件的观测统计具有显 著影响，夸大了100kHz数据集（图23b-c）中短时事件的过孔时间。偏压400mV 至450mV时，400kHz滤波器以低于2.5μs的响应速率对事件进行连续观测，这 意味着如果微孔B的薄膜电容被进一步降低，则可以观测到亚微秒事件出现。

内部事件过孔动态检测

在低带宽和低采样速率下，纳米孔－DNA的相互作用可呈现出始终如一的 障碍水平，但在有些情况下，对应于折叠聚合物、杂交探针分子或较大蛋白质 结构使用多级电流水平对事件进行观测。纳米孔事件持续时间的统计分析表明， 在这些传感器的典型运行范围内，可观测到多个不同的生物物理过程。对于较 大的纳米孔，过孔时间可以由电泳力控制，而对于直径较小的微孔，聚合物要 花费较长时间散布到正确位置以使端部穿过微孔。可通过分子与微孔表面之间 的理化相互作用进一步延长事件持续时间。

图24所示为测量50bp DNA在500mV偏压下穿过微孔B事件的数据集。 图24a是纳米孔过孔的连续过程图解。首先，一个分子散布在微孔附近，在此 处被电场俘获。该分子在微孔口被捕捉困住，直至其找到可以将其一端穿过微 孔的形态。图24b所示为50bp双链DNA片段在500mV偏压下穿过微孔B （3.5nm）时观测到的典型信号。各事件的水平明显平缓，紧接着是较深的尾事 件。图24c是50bp DNA在500mV偏压下的事件深度ΔI（N=3955）的柱状图。 整个事件的深度和每个事件最后2μs的深度的分布截然不同。图24d是整个事 件最有可能的ΔI和一个事件的首个2μs和最后2μs的ΔI图表。最后2μs的深度 与500mV以下电压保持线性关系，而事件的早期部分在高偏压时电流变化平缓。 这显示出强电场下分子动态，强电场抑制了聚合物扩散并延长了与“穿越”阶段相 关的“俘获”阶段的持续时间。

对于这种高偏压，通常情况下观测到事件的特点是阻碍水平平缓，紧接着 是结束前的较深的尾事件。这与以前观测到的具有蛋白质纳米孔的发夹DNA分 子的信号极为相似。对于这种内部事件结构的一个合理解释就是图24a所示的 多阶段过程。扩散的分子被纳米孔俘获，但是强电场和分子相对较硬（一个50bp DNA分子约15nm长，曲率半径为4nm）使分子不能快速处于合适的形态以穿 过3.5nm的纳米孔。分子在纳米孔口被捕捉产生了最初平缓阻碍。当分子最终 成功穿孔时，分子来到对面的腔室，产生更大阻碍。

在数据集中，尾事件的持续时间通常少于10μs，在低带宽测量中常常是模 糊不清的。尾事件的相对深度可与各事件最后2μs的深度做比较，并根据各整 个事件的平均深度的柱状图做统计分析。如图24c所示，这些阻碍水平呈现出 截然不同的分布，中心部分分别在0.75nA和1.1nA处。有趣的是，最后2μs的 深度与偏压之间的关系相对于整个事件的深度更接近于线性关系（图24d）。这 说明尾事件与分子过孔相符合，在低偏压下，“俘获”状态持续时间太短以至于无 法对有助于观测事件。

此处所述的公开主题描述了某些典型的实施例。所属领域技术人员应意识 到，在不偏离本应用范围的前提下，可对本应用进行改动和改进。因此意味着 在现有应用中，包括改动和变更都在附加的权利要求及同等内容的范围内。此 外，虽然这里可以讨论应用中某个实施例的个体特征或者将此特征显示在某个 实施例而非另一个实施例的图纸中，但显然某个实施例的个体特征可以包含在 其它实施例的一个或多个特征中或者大多数实施例的特征中。

除了下面权利要求中的特定实施例，本公开主题也涵盖那些可能具有下述 或上述独立特征组合的其它实施例。这样，从属权利要求和上述公开内容中出 现的具体特征可以在本应用的范围内以其他方式相互合并，以便于识别本应用 并使本应用涵盖上述具有其他可能组合的实施例。因此，为了进行说明和描述， 对本应用中的特定实施例进行了以上说明。但这并不意味着它们足够详尽或者 必须将本应用限制在本文公开的实施例中。