用于改善重组酶及其它蛋白的蛋白表达和分泌的新的信号序列

摘要

本发明公开了人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的多肽信号序列。本发明还公开了融合蛋白，所述融合蛋白包括与异源多肽操作性连接的人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段。本发明还公开了蛋白表达载体，所述载体包括与第一DNA序列和第二DNA序列操作性连接的启动子，所述第一DNA序列编码包括人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的信号序列，所述第二DNA序列编码异源多肽，所述第二DNA序列在框架内与所述第一DNA序列融合。本发明进一步公开了一种生产多肽的方法，所述方法包括表达融合蛋白，所述融合蛋白包括人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的多肽信号序列，所述序列与异源多肽操作性连接，和回收所述异源多肽。

说明书

交叉引用美国相关专利申请

本申请要求2010年11月22日提交的美国临时专利申请号61/415,926的优先权，其 通过引用整体并入本发明。

技术领域

用于治疗和其它用途的重组酶和其它蛋白的表达和分泌。

背景技术

在真核生物中，几乎所有蛋白的蛋白合成均是在细胞质中通过称为核糖体的巨型蛋白 复合物开始的。多种蛋白在细胞质中完成其合成和折叠并留在其中发挥功能。但是，多种 其它的蛋白从细胞质中输出并进入内质网(ER)，在那里其获得所需的翻译后修饰(例如， 二硫键、糖基化等)，以便使其获得适当的蛋白结构和生物活性，然后将其输出到目的细 胞位置(例如，高尔基体、过氧化物酶体和溶酶体蛋白)或细胞表面(例如，受体、离子 通道等)或分泌出细胞(例如，抗体、凝血因子、激素等)。输出细胞质的蛋白与细胞质 内的蛋白不同，区别在于在氨基(N-)末端具有称为信号序列的特定蛋白元件。

信号序列(也称为信号肽)不具有一致的氨基酸序列或长度，但是一般在N-末端含有 起始的15-40个残基，其中7-20个连续的疏水氨基酸残基形成α-螺旋二级结构，所述二级 结构的两侧通常为带电残基。信号序列在细胞质中被称为信号识别颗粒(SRP)的特定多 亚基蛋白：RNA复合物所识别，SRP将这些新生蛋白引导至ER膜内称为转位子的特定孔， 在那里这些蛋白穿过ER膜转运至ER腔——这一过程被称为蛋白转位。

在哺乳动物中，蛋白转位与蛋白合成同时发生(即，共翻译)，但是在其它真核生物 中(例如，酵母)，这一过程可以是共翻译或在翻译后。在细菌中信号序列介导的蛋白转 位也用于引导蛋白从细胞质中输出并进入周质。在哺乳动物中，信号序列从核糖体中出来 时被SRP识别，这暂时中止了蛋白翻译以允许整个SRP-新生蛋白-核糖体复合物通过相关 的SRP受体定位至转位子。在释放SRP且核糖体-新生蛋白复合物适当地停靠在转位子后， 蛋白合成重新开始。

大多数酶和其它蛋白治疗剂是由重组技术生产的，把该技术设计成将这些重组蛋白分 泌出细胞，分泌到细胞培养基中以简化后续的纯化。因此，这些重组酶和其它蛋白必须利 用信号序列和这个相同的细胞途径用于分泌。因此，大规模生产这些蛋白需要信号序列能 够介导有效的ER定位和蛋白转位穿过ER膜。然而，在促进ER定位和转位上，信号序列 的效果不尽相同。据信，SRP迅速和有效地识别信号序列，但是随后的ER定位和转位步 骤在不同蛋白之间差异很大。由于信号序列被识别两次，第一次是由SRP识别以将新生蛋 白-核糖体复合物定位至ER，随后由转位子蛋白(即，Sec61蛋白)和其它转位子相关ER 蛋白识别以启动转位，因而这两者均为调控的潜在位点。已证明后一个步骤更加迫切并且 效率更低，因而其在这一过程中是主要瓶颈。令人惊讶的是，在促进蛋白转位方面大部分 信号序列在本质上是低效的。所以，很多ER定位的新生蛋白-核糖体复合物从ER膜上解 离，蛋白合成失败，从而降低其蛋白表达和分泌。

发明概述

本发明提供了多肽信号序列，其包括人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片 段。

本发明还提供了融合蛋白，其包括与异源多肽操作性连接的人免疫球蛋白重链结合蛋 白(Bip)的经修饰的片段。

本发明进一步提供了蛋白表达载体，其包括与第一DNA序列操作性连接的启动子， 其中所述第一DNA序列编码人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段多肽信号 序列，和第二DNA序列，所述第二DNA序列在框架内与所述第一DNA序列融合，其中 所述第二DNA序列编码异源多肽。

本发明还提供了生产多肽的方法，其包括表达融合蛋白，所述融合蛋白包括源于人免 疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的多肽信号序列，所述序列与异源多肽操作性连接，和回收 所述异源多肽。

本发明还提供了生产多肽的方法，其包括表达融合蛋白，所述融合蛋白包括人免疫球 蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段多肽信号序列，所述信号序列与异源多肽操作性 连接，和回收所述异源多肽。

本发明进一步提供了蛋白表达载体，其包括与第一DNA序列操作性连接的启动子， 其中所述第一DNA序列编码包含人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的多 肽信号序列和第二DNA序列，所述第二DNA序列在框架内与所述第一DNA序列融合， 其中所述第二DNA序列编码异源多肽。

本发明还提供了增加蛋白表达的方法，其包括表达融合蛋白，所述融合蛋白包括人免 疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段和异源蛋白，和回收所述异源蛋白。

本公开的发明还提供了增加蛋白分泌的方法，其包括表达融合蛋白，所述融合蛋白包 括人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段和异源蛋白，和回收所述异源蛋白。

附图概述

当结合附图考虑时，通过对本发明的下述详细描述，本发明的前述和其它方面是显而 易见的。出于解释本发明的目的，在附图中所示的均为优选的实施方式，但是将理解本发 明不限于所公开的特定方式。附图并不一定是按照比例尺绘制的。在附图中：

图1显示了在约72小时时间段内，信号序列对重组野生型人酸性β-葡萄糖脑苷脂酶 的表达和分泌的功能效应。

图2显示了在约63小时时间段内，在高细胞密度和营养耗竭条件下重组野生型人酸 性β-葡萄糖脑苷脂酶被优先表达和分泌。

图3显示了在约43小时时间段内，信号序列对重组野生型人酸性α-葡萄糖苷酶的表达 和分泌的功能效应。

发明详述

本发明所使用的“异源多肽”是任何多肽但不是人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的 经修饰的片段。

本发明所使用的“Bip”是免疫球蛋白重链结合蛋白的缩写。

适宜的多肽信号序列可以包括人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段。包 括人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的多肽信号序列可以包括SEQ IDNO： 20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列。

适宜的融合蛋白可以包括与异源多肽操作性连接的人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip) 的经修饰的片段。该融合蛋白的特征可以在于在细胞培养中表达增加。细胞培养也可以是 非最佳细胞培养条件。非最佳细胞培养条件可以是高细胞密度和营养耗竭。具有人免疫球 蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的其它适宜的融合蛋白可以包括SEQ ID NO：20，、 SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列。所有这些融合蛋白 的特征亦均可以在于在细胞培养中表达增加。细胞培养也可以是非最佳细胞培养条件。非 最佳细胞培养条件可以是高细胞密度和营养耗竭。异源多肽可以是一种或多种酶、一种或 多种生物反应调节剂、一种或多种毒素、一种或多种抗体、一种或多种异源多肽片段或其 任意组合。异源多肽可以是酸性β-葡萄糖脑苷脂酶。异源多肽还可以是酸性α-半乳糖苷酶。 异源多肽还可以是酸性α-葡萄糖苷酶。异源多肽还可以是胰岛素原。异源多肽还可以是胰 岛素样生长激素-2(IGF-2)。异源多肽还可以是干扰素。异源多肽还可以是治疗性抗体。 异源多肽还可以是胰岛素样生长激素-1(IGF-1)。

具有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的其它适宜的融合蛋白可以包 括SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列， 并且异源多肽可以包括β-葡萄糖脑苷脂酶。与野生型β-葡萄糖脑苷脂酶(具有天然β-葡萄 糖脑苷脂酶信号序列的β-葡萄糖脑苷脂酶)相比，那些融合蛋白的特征可以在于在细胞培 养中表达增加。在细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测β-葡萄糖脑 苷脂酶活性来测定。细胞培养也可以是非最佳细胞培养条件。非最佳细胞培养条件可以是 高细胞密度和营养耗竭。在高细胞密度和营养耗竭条件下的细胞培养中表达增加可以通过 在为期约3天的时间段内检测β-葡萄糖脑苷脂酶活性来测定。

具有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的其它适宜的融合蛋白可以包 括SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列， 并且异源多肽可以包括α-半乳糖苷酶。与野生型α-半乳糖苷酶(具有天然α-半乳糖苷酶信 号序列的α-半乳糖苷酶)相比，那些融合蛋白的特征可以在于在细胞培养中表达增加。在 细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测α-半乳糖苷酶活性来测定。细 胞培养也可以是非最佳细胞培养条件。非最佳细胞培养条件可以是高细胞密度和营养耗 竭。在高细胞密度和营养耗竭条件下的细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间 段内检测α-半乳糖苷酶活性来测定。

具有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的其它适宜的融合蛋白可以包 括SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列， 并且异源多肽可以包括酸性α-葡萄糖苷酶。与野生型酸性α-葡萄糖苷酶(具有天然酸性α- 葡萄糖苷酶信号序列的酸性α-葡萄糖苷酶)相比，那些融合蛋白的特征可以在于在细胞培 养中表达增加的特征。在细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测酸性 α-葡萄糖苷酶活性测定。细胞培养也可以是非最佳细胞培养条件。非最佳细胞培养条件可 以是高细胞密度和营养耗竭。在高细胞密度和营养耗竭条件下的细胞培养中表达增加可以 通过在为期约3天的时间段内检测酸性α-葡萄糖苷酶活性来测定。

具有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的其它适宜的融合蛋白可以包 括SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列， 并且异源多肽可以包括胰岛素原。与野生型胰岛素原(具有天然胰岛素原信号序列的胰岛 素原)相比，那些融合蛋白的特征可以在于在细胞培养中表达增加的特征。在细胞培养中 表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测胰岛素原活性测定。细胞培养也可以是非 最佳细胞培养条件。非最佳细胞培养条件可以是高细胞密度和营养耗竭。在高细胞密度和 营养耗竭条件下的细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测胰岛素原活 性来测定。

具有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的其它适宜的融合蛋白可以包 括SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列， 并且异源多肽可以包括胰岛素样生长激素-2(IGF-2)。与野生型胰岛素样生长激素-2 (IGF-2)(具有天然胰岛素样生长激素-2(IGF-2)信号序列的胰岛素样生长激素-2 (IGF-2))相比，那些融合蛋白的特征可以在于在细胞培养中表达增加。在细胞培养中表 达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测胰岛素样生长激素-2(IGF-2)活性测定。细 胞培养也可以是非最佳细胞培养条件。非最佳细胞培养条件可以是高细胞密度和营养耗 竭。在高细胞密度和营养耗竭条件下的细胞培养中表达增加可以通过在为期3天的时间段 内检测胰岛素样生长激素-2(IGF-2)活性来测定。

具有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的其它适宜的融合蛋白可以包 括SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列， 并且异源多肽可以包括干扰素。与野生型干扰素(具有天然干扰素信号序列的干扰素)相 比，那些融合蛋白的特征可以在于在细胞培养中表达增加。在细胞培养中表达增加可以通 过在为期约3天的时间段内检测干扰素活性测定。细胞培养也可以是非最佳细胞培养条件。 非最佳细胞培养条件可以是高细胞密度和营养耗竭。在高细胞密度和营养耗竭条件下的细 胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测干扰素活性来测定。

具有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的其它适宜的融合蛋白可以包 括SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列， 并且异源多肽可以包括治疗性抗体。与野生型治疗性抗体(具有天然治疗性抗体信号序列 的治疗性抗体)相比，那些融合蛋白的特征可以在于在细胞培养中表达增加。在细胞培养 中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测治疗性抗体活性测定。细胞培养也可以 是非最佳细胞培养条件。非最佳细胞培养条件可以是高细胞密度和营养耗竭。在高细胞密 度和营养耗竭条件下的细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测治疗性 抗体活性来测定。

具有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的其它适宜的融合蛋白可以包 括SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列， 并且异源多肽可以包括胰岛素样生长激素-1(IGF-1)。与野生型胰岛素样生长激素-1 (IGF-1)(具有天然胰岛素样生长激素-1(IGF-1)信号序列的胰岛素样生长激素-1 (IGF-1))相比，那些融合蛋白的特征可以在于在细胞培养中表达增加的特征。在细胞培 养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测胰岛素样生长激素-1(IGF-1)活性测 定。细胞培养也可以是非最佳细胞培养条件。非最佳细胞培养条件可以是高细胞密度和营 养耗竭。在高细胞密度和营养耗竭条件下的细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的 时间段内检测胰岛素样生长激素-1(IGF-1)活性来测定。

适宜的蛋白表达载体可以包括与第一DNA序列操作性连接的启动子和编码异源多肽 的第二DNA序列，其中所述第一DNA序列编码包含人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip) 的经修饰的片段的多肽信号序列，所述第二DNA序列在框架内与所述第一DNA序列融合。 所述多肽信号序列包括人免疫球蛋白重链连接蛋白(Bip)的经修饰的片段，所述多肽信号 序列可以包括SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的 氨基酸序列。第二DNA序列可以编码β-葡萄糖脑苷脂酶。

适宜的蛋白表达载体可以包括与第一DNA序列操作性连接的启动子和编码异源多肽 的第二DNA序列，所述第一DNA序列编码含有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经 修饰的片段的多肽信号序列，所述第二DNA序列在框架内与所述第一DNA序列融合。所 述多肽信号序列包括人免疫球蛋白重链连接蛋白(Bip)的经修饰的片段，所述多肽信号序 列可以包括SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的氨 基酸序列。第二DNA序列可以编码酸性α-葡萄糖苷酶。

适宜的蛋白表达载体可以包括与第一DNA序列操作性连接的启动子和编码异源多肽 的第二DNA序列，所述第一DNA序列编码含有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经 修饰的片段的多肽信号序列，所述第二DNA序列在框架内与所述第一DNA序列融合。所 述多肽信号序列包括人免疫球蛋白重链连接蛋白(Bip)的经修饰的片段，所述多肽信号序 列可以包括SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的氨 基酸序列。第二DNA序列可以编码其他异源蛋白，如α-半乳糖苷酶。异源多肽还可以是 胰岛素原。异源多肽还可以是胰岛素样生长激素-2(IGF-2)或胰岛素样生长激素-1(IGF-1)。 异源多肽还可以是干扰素。异源多肽还可以是治疗性抗体。异源多肽还可以是任意分泌出 细胞的其它蛋白。

生产多肽的适宜方法可以包括表达融合蛋白，所述融合蛋白具有人免疫球蛋白重链结 合蛋白(Bip)的经修饰的片段，所述片段与异源多肽操作性连接，并且回收所述异源多肽。 生产多肽的方法可以在培养的细胞中进行。培养的细胞可以是酵母细胞或哺乳动物细胞。 生产多肽的方法可以在转基因系统中进行。转基因系统可以包括牛、山羊、绵羊、兔或其 任意组合。从转基因系统中的回收可以从牛奶中。转基因系统还可以包括鸡。从转基因系 统中的回收可以从蛋中。

制备蛋白表达载体的适宜方法可以包括，将启动子与编码多肽信号序列的第一DNA 序列操作性连接，所述多肽信号序列包括人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片 段，以及在框架内将第二DNA序列与所述第一DNA序列融合，其中所述第二DNA序列 编码异源多肽。制备蛋白表达载体的方法还可以具有第一DNA序列，其编码SEQ ID NO： 20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列。制备蛋白表达 载体的方法还可以具有第二DNA序列，其编码酸性β-葡萄糖脑苷脂酶、酸性α-半乳糖苷 酶、酸性α-葡萄糖苷酶、胰岛素原、胰岛素样生长激素-2(IGF-2)、干扰素、治疗性抗体 或胰岛素样生长激素-1(IGF-1)或其它分泌出细胞的蛋白。

增加蛋白表达的适宜方法可以包括表达融合蛋白，所述融合蛋白包括人免疫球蛋白重 链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段和异源蛋白，和回收所述异源蛋白。

增加蛋白分泌的适宜方法可以包括表达融合蛋白，所述融合蛋白包括人免疫球蛋白重 链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段和异源蛋白，和回收所述异源蛋白。

实施例1

试剂

野生型人β-葡萄糖脑苷脂酶(“GlcCerase”)cDNA(NM_000157.3)、野生型酸性α- 半乳糖苷酶A(GLA)cDNA(NM_000169.2)、野生型人酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)cDNA (NM_000152.2)和野生型人胰岛素样生长因子-2(IGF-2)cDNA(NM_000612.4)均购 自Origene^TM(Rockville，MD)，而所有寡核苷酸引物和合成的微基因来自Integrated DNA  Technologies^TM(IDT^TM；Coralville，IA)。pEF6/V5-HisA哺乳动物表达载体、Dulbecco改 良的Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和其它组织培养试剂均来自Invitrogen^TM(Carlsbad，CA)。限制性核酸内切酶、Phusion-HF DNA聚合酶^TM、T4DNA连接酶、Antarctic 磷酸酶、化学感受态大肠杆菌(DH5α细胞)均购自New England Biolabs^TM(Ipswich，MA)。 不同糖苷酶的荧光底物购自Research Products International^TM(Mt.Prospect，IL)，DNA凝 胶提取和微量制备DNA试剂盒来自QIAGEN^TM(Valencia，CA)，PureYield Maxiprep DNA^TM试剂盒来自Promega^TM(Madison，WI)。除非另有说明，否则化学试剂来自Sigma^TM(St.Louis， MO)，Fugene-HD^TM转染试剂来自Roche^TM(Indianapolis，IN)，经T-抗原转化的人胚肾 细胞(HEK293T)来自ATCC^TM。

质粒构建

构建编码不同模型蛋白的DNA质粒，所述模型蛋白含有天然信号序列或被经修饰的 人Bip信号序列所替代，以评估这些信号序列对待测蛋白表达和分泌的作用。

为了评估人酸性β-葡萄糖脑苷脂酶(GlcCerase，EC3.2.1.45)，构建若干不同的DNA 质粒以编码具有其天然信号序列或人Bip信号序列或经修饰的Bip信号序列的野生型 GlcCerase。为产生具有其天然信号序列的野生型人GlcCerase，通过Phusion-HF DNA聚合 酶^TM使用引物1&2(表I)和GlcCerase cDNA克隆(NM_000157.3，Origene)利用PCR 扩增整个人GlcCerase cDNA。构建引物1，其含有5’Bgl II和内在的EcoRI限制性酶切位 点，其后紧邻天然GlcCerase Kozak序列，而引物2，其含有3’NheI和NotI限制性酶切位 点，其紧随终止密码子，以使得PCR产物能够克隆至哺乳动物表达载体。从1％(w/v) 的琼脂糖制备凝胶上分离和切取～1.6千碱基(kb)的PCR产物(A)，并使用QIAGEN^TM凝胶提取试剂盒^TM分离。随后使用限制性核酸内切酶Bgl II和NotI在37℃下将PCR产物 A消化过夜，再次纯化并使用T4DNA连接酶使其与pEF6/V5-HisA哺乳动物表达载体 (Invitrogen^TM)连接，所述表达载体预先已使用BamHI和Not I消化且使用Antarctic磷酸 酶去磷酸化。在引物1中引入Bgl II限制性酶切位点，以使得Bgl II-消化的GlcCerase PCR 产物连接到pEF6/V5-HisA载体的相容BamHI位点处，并除去在多克隆位点内的BamHI 限制性酶切位点，此后将这个经修饰的表达载体称为pEF6’。称为pHD101的该DNA构建 体用于转化化学感受态大肠杆菌细胞，扩增各氨苄西林抗性细菌菌落，并分别使用EcoRI& NheI和用BamHI通过消化反应进行筛选。通过DNA测序对来自克隆4的正确质粒DNA (称为pHD101.4)进行进一步确证，并选用于野生型GlcCerase的表达。使用pHD101.4 来构建其它编码野生型GlcCerase的质粒，所述野生型GlcCerase具有人Bip信号序列或具 有该Bip信号序列的经修饰的版本而非天然GlcCerase信号序列。简言之，构建(并由 Integrated DNA Technologies^TM，IDT^TM合成)双链DNA微基因(在表II中称为微基因1)， 其含有来自酵母醇氧化酶1(AOX1)基因的天然Kozak序列、整个的18-残基天然人Bip 信号序列(包括其成熟信号肽识别序列：Ser-Ala-Ala-Arg-Ala；SAARA(SEQ ID NO：24)) 基因和成熟野生型人GlcCerase(核苷酸118-490)的N-末端123个氨基酸残基。微基因1 还含有在AOX1Kozak序列之前的5’EcoRI限制性酶切位点，和在3’末端的GlcCerase基 因中的天然NcoI位点，从而使其能够克隆至pHD101.4中，将天然GlcCerase信号序列替 换成人Bip信号序列。而且，这一策略能够构建用于在哺乳动物或酵母系统中表达野生型 GlcCerase(具有Bip信号序列)的DNA质粒(在诱导型AOX1启动子的控制下)。在这 种和其它融合蛋白的设计中，利用SignalP4.0^TM分析程序来预测Bip信号序列是否将从待 测蛋白上裂解。

根据需要在构建体中添加额外的氨基酸残基以便于信号序列的裂解，仅选择预计具有 适宜信号序列裂解作用的序列产生这些融合的待测蛋白。对于在哺乳动物系统中的表达， 使用引物3&4和微基因1DNA模板，通过PCR合成含有天然人Bip Kozak序列的 Bip-GlcCerase DNA片段。从1％(w/v)的琼脂糖制备凝胶上分离和切取～440bp的PCR 产物(B)，并使用QIAGEN凝胶提取试剂盒分离。如上文所述，使用限制性核酸内切酶 EcoRI和Nco I将PCR产物B消化过夜，再次纯化，并与NcoI→Not I DNA片段和～5.8kb EcoRI→Not I pEF6’载体的DNA片段连接，所述NcoI→Not I DNA片段来自pHD101.4，且 编码成熟野生型GlcCerase(缺乏天然GlcCerase信号序列)的氨基酸残基124-497。该DNA 构建体被称为pHD201，使用EcoRI-Xba I通过限制性消化对其进行验证，通过DNA测序 确定正确的克隆(pHD201.2)，随后使用其评估人Bip信号序列对野生型GlcCerase表达 和分泌的作用。类似地，通过IDT^TM构建和合成Bip信号序列的经修饰的版本(微基因2)， 其含有来自AOX1酵母基因的天然Kozak序列、天然人Bip信号序列的前13个残基，然 后接氨基酸残基4-13的重复、天然Bip信号肽酶识别序列(残基14-18)和成熟野生型人 GlcCerase(核苷酸118-490)的N-末端的123个残基。对Bip信号序列进行的该修饰(称 为经修饰的Bip信号序列-1)扩大了疏水性结构域，使得其跨过整个ER膜并将信号序列 由18延长至28个残基。对于在哺乳动物系统中的表达，使用引物3&4和微基因2DNA 模板，通过PCR合成含天然人Bip Kozak序列片段的经修饰的Bip信号序列-1-GlcCerase DNA。如上文所述，从1％(w/v)的琼脂糖制备凝胶上分离～470bp的PCR产物(C)， 使用EcoRI和Nco I消化，再次纯化并与Nco I→Not I DNA片段和～5.8kb EcoRI→Not I pEF6’载体DNA片段连接，所述Nco I→Not I DNA片段来自pHD101.4，并编码成熟野生 型GlcCerase(缺乏天然GlcCerase信号序列)的氨基酸残基124-497。该DNA构建体被称 为pHD204，使用EcoRI和Xba I通过限制性消化对其进行验证，通过DNA测序确定正确 的克隆(pHD204.1)，随后使用其评估该经修饰的Bip信号序列对野生型GlcCerase表达 和分泌的作用。

本发明中使用的用于制备DNA构建体的引物汇总于表1。

表1

^a在天然GlcCerase Kozak保守序列(加下划线的)中的ATG起始密码子以粗体表示。限制性核酸 内切酶识别序列以斜体表示。

^b终止密码子以粗斜体表示。

^c在天然人Bip Kozak保守序列(加下划线的)中的ATG起始密码子以粗体表示。限制性核酸内 切酶识别序列以斜体表示。

^d使用5’“P”符号表示磷酸化的引物。

随后将经修饰的Bip信号-1连接到其它蛋白，以评估对它们的表达和分泌的作用。简 言之，构建微基因3(表II)，其含有天然人Bip信号序列的前13个残基，后接氨基酸残 基4-13的重复和天然Bip信号肽酶识别序列的残基14-17。微基因3含有来自人Bip的天 然Kozak序列，以及5’EcoRI和3’Stu I和Not I限制性酶切位点。之所以将Stu I引入微 基因3，是因为该限制性酶在AGG(精氨酸密码子，Arg；R)后产生平头3’末端，所述 AGG可以作为天然Bip信号肽酶裂解序列的残基17处的天然Arg。因此，可以将任何蛋 白连接至该经修饰的Bip信号序列片段，只要将额外的丙氨酸添加到该蛋白的N末端，以 完成天然SAARA(SEQ ID NO：24)信号肽酶识别序列。

Bip和经修饰的Bip信号序列的微基因的DNA核苷酸序列汇总于表2。

表2

^＊微基因1(天然人Bip-GlcCerase)SEQ ID NO：13：

acaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctcagcgcggcgcgggccgcccgcccctgcatccctaaaagct tcggctacagctcggtggtgtgtgtctgcaatgccacatactgtgactcctttgaccccccgacctttcctgcccttggtaccttcagccgctatgagag tacacgcagtgggcgacggatggagctgagtatggggcccatccaggctaatcacacgggcacaggcctgctactgaccctgcagccagaaca gaagttccagaaagtgaagggatttggaggggccatgacagatgctgctgctctcaacatccttgccctgtcaccccctgcccaaaatttgctactta aatcgtacttctctgaagaaggaatcggatataacatcatccgggtac

微基因2(经修饰的Bip信号序列-1-GlcCerase)SEQ ID NO：14：

acaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctcagcctggtggccgcgatgctgctgctgctcagcgcggcgcgg gccgcccgcccctgcatccctaaaagcttcggctacagctcggtggtgtgtgtctgcaatgccacatactgtgactcctttgaccccccgacctttcct gcccttggtaccttcagccgctatgagagtacacgcagtgggcgacggatggagctgagtatggggcccatccaggctaatcacacgggcacag gcctgctactgaccctgcagccagaacagaagttccagaaagtgaagggatttggaggggccatgacagatgctgctgctctcaacatccttgccc tgtcaccccctgcccaaaatttgctacttaaatcgtacttctctgaagaaggaatcggatataacatcatccgggtac

微基因3(经修饰的Bip信号序列-1)SEQ ID NO：15：

acaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctcagcctggtggccgcgatgctgctgctgctcagcgcggcg

微基因4(经修饰的Bip信号序列-2)SEQ ID NO：16：

gctggaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctctgggtggcactgctgctgctcagcgcggcg

微基因5(经修饰的Bip信号序列-3)SEQ ID NO17：

gctggaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctctccctggtggccctgctgctgctcagcgcggcg

微基因6(经修饰的Bip信号序列-4)SEQ ID NO18：

gctggaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctcgcactggtggccctgctgctgctcagcgcggcg

^*ATG起始密码子以粗体表示，而Kozak保守序列用下划线表示。限制性核酸内切酶识别序 列以斜体表示。

为评估酸性α-半乳糖苷酶A(GLA，EC3.2.1.22)，使用引物5&6和GLA cDNA克隆 (NM_000169.2，Origene^TM)模板DNA，通过PCR扩增具有天然信号序列的野生型酶。 从琼脂糖制备凝胶上分离该～1.3kb的PCR产物，使用EcoRI和Nco I消化，并连接至 EcoRI-Not I消化、去磷酸化的pEF6’。将该DNA构建体称为pHD214，并用于评估GLA 的表达。为构建具有经修饰的Bip信号序列-1的GLA，使用引物6&7和GLA cDNA克 隆模板DNA，通过PCR合成成熟的GLA酶。如前文所述，使用Not I消化该～1.2kb PCR 产物(D)，将其从琼脂糖制备凝胶中分离并连接至EcoRI→Stu I微基因3DNA片段和 EcoRI→Not I-消化pEF6’载体。该DNA构建体被称为pHD215，用于评估该经修饰的Bip 信号序列对野生型GLA表达和分泌的作用。

为评估酸性α-葡萄糖苷酶(GAA，EC3.2.1.0)，使用引物8&9和GAA cDNA克隆 (NM_000152.2，Origene)模板DNA通过PCR扩增完整的野生型GAA酶(具有其天然信 号序列)。从琼脂糖制备凝胶上分离该～3kb的PCR产物(E)，使用EcoRI和Nco I消化， 并连接至EcoRI-Not I消化、去磷酸化的pEF6’。将该DNA构建体称为pHD217并用于评 估具有其天然信号序列的GAA的表达。由于使用多个成熟酶之前的前-序列表达GAA (Moreland et al.，2005)，因而合成出具有不同长度的GAA蛋白并连接至经修饰的Bip信 号序列-1以供检测。使用引物9&10，通过PCR合成缺乏其天然信号序列但含有残基24-952 的GAADNA片段。从琼脂糖制备凝胶上分离该～3kb的PCR产物(F)，使用Nco I消化， 并连接至EcoRI→Stu I微基因3DNA片段和EcoRI→Not I-消化的pEF6’载体。该DNA构 建体含有经修饰的Bip信号序列-1和GAA(24-952)，将其称为pHD218。类似地，使用 引物9&11，通过PCR合成缺乏其天然信号序列但含有残基57-952的GAA DNA片段。 如前文所述，从琼脂糖制备凝胶上分离该～2.9kb的PCR产物(G)，使用Not I消化，并 连接至EcoRI→Stu I微基因3DNA片段和EcoRI-Not I-消化的pEF6’载体。该DNA构建体 含有经修饰的Bip信号序列-1和GAA(57-952)，将其称为pHD219。使用引物9&12， 通过PCR合成缺乏其天然信号序列但含有残基78-952的GAA DNA片段。从琼脂糖制备 凝胶上分离该～2.8kb的PCR产物(H)，使用Not I消化，并连接至EcoRI→Stu I微基因 3DNA片段和EcoRI→Not I-消化的pEF6’载体。该DNA构建体含有经修饰的Bip信号序 列-1和GAA(78-952)，将其称为pHD220。因此，可以使用DNA构建体pHD217-220 详细检测该经修饰的Bip信号序列-1及其前-序列对GAA表达和分泌的作用。

设计衍生自经修饰的Bip信号序列-1的其它经修饰的Bip信号序列(表III)，并评估 这些额外的修饰能否进一步改善蛋白的表达和分泌。这些修饰包括使用单一的色氨酸残基 替代位置14&15的丝氨酸和亮氨酸残基并且删除在疏水性结构域内的位置18&19的丙 氨酸和甲硫氨酸残基(称为经修饰的Bip信号序列-2)，删除疏水性结构域内的位置18& 19的丙氨酸和甲硫氨酸残基(称为经修饰的Bip信号序列-3)，以及使用丙氨酸替代位置 14的丝氨酸残基和删除在疏水性结构域内的位置18&19的丙氨酸和甲硫氨酸残基(称为 经修饰的Bip信号序列-4)。这些修饰旨在增加疏水性结构域的疏水性，其可以进一步增 强这些信号序列与关键核糖体和ER转位子蛋白之间的相互作用，并形成更有效的信号肽 酶裂解位点，以改善重组蛋白的蛋白转位和分泌。

还将对其它待测蛋白包括人胰岛素、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、抗体、干扰素、 载脂蛋白等进行评估，以确定这些经修饰的Bip信号序列是否将改善其表达和分泌。

经修饰的Bip信号序列的氨基酸序列汇总于表3。

表3

^d天然Bip信号肽酶裂解序列(SAARA)(SEQ ID NO：24)以下划线表示。

^e在各经修饰的Bip信号序列中，对Bip信号序列的特定修饰以粗体表示。

实施例3

待测蛋白的瞬时表达

对于瞬时转染实验，使用添加了10％FBS的1ml DMEM培养基将HEK293T细胞接 种于12-孔组织培养板，在37℃和5％CO₂的气体环境下培养。当HEK293T细胞达到 70-100％汇合时，将已消耗的培养基更换为1ml新鲜的DMEM/10％FBS培养基，并按照 生产厂商提供的方案，使用1μg各待测蛋白的质粒DNA或PBS(假-转染阴性对照)和3 μl Fugene^TM-HD转染试剂对各孔进行转染。将转染细胞孵育24-72小时，每日通过酶活性 检测和/或Western印迹和ELISA对各重组酶的表达(分泌至培养基)进行检测。

实施例4

酶活性检测

使用来自瞬时转染实验24、48或约72小时后的条件培养基和4-甲基伞形酮-β-D-吡喃 葡萄糖苷(4-MU-β-Glc)荧光底物，通过酶活性实验对表达和分泌至细胞培养基中的重组 人酸性β-葡萄糖脑苷脂酶(GlcCerase)进行评估。简言之，在指定的时间点从各样品中收 集20μl条件培养基，在0.5ml微量离心管中使用80μl McIlvane缓冲液(MI缓冲液：50mM 柠檬酸钠/磷酸钠(pH5.2)/0.25％(v/v)Triton X-100/0.25％(w/v)牛黄胆酸钠)对其进 行稀释。将25μl各稀释样品加入96孔黑色透明底板的各孔中(三复管)，并使用多道移 液器加入50μl6mM的4-MU-β-Glc底物(在MI缓冲液中制备)。然后使用封带将板密 封并在37℃孵育1小时。通过加入125μl0.1M的NaOH终止酶反应，在荧光板酶标仪 上分别使用355nm激发和460nm发射波长读取释放的4-MU荧光。将假-转染样品的4-MU 荧光作为“背景”对照并从所有GlcCerase样品中扣除。

使用来自瞬时转染实验24、48或72小时后的条件培养基和4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡 萄糖苷(4-MU-α-Glc)荧光底物，通过酶活性实验对表达和分泌的重组人酸性α-葡萄糖苷 酶(GAA)进行评估。具体地，在指定的时间点从各样品中收集20μl条件培养基，在0.5 ml微量离心管中使用80μl50mM的醋酸盐缓冲液(pH4.0)对其进行稀释。将25μl各稀 释样品加入96孔黑色透明底板的各孔中(三复管)，并使用多道移液器加入50μl6mM 的4-MU-α-Glc底物(在50mM醋酸盐缓冲液中制备，pH4.0)。然后使用封带将板密封 并在37℃孵育1小时。通过加入125μl0.1M的NaOH终止酶反应，在荧光板酶标仪上分 别使用355nm激发和460nm发射波长读取释放的4-MU荧光。将假-转染样品的4-MU荧 光作为“背景”对照并从所有GAA样品中扣除。

使用来自瞬时转染实验24、48或72小时后的条件培养基和4-甲基伞形酮-α-D-半乳糖 苷(4-MU-α-Gal)荧光底物，通过酶活性实验对表达和分泌的重组人酸性α-半乳糖苷酶 (GLA)进行评估。具体地，在指定的时间点从各样品中收集20μl条件培养基，在0.5ml 微量离心管中使用80μl50mM的柠檬酸钠/磷酸钠缓冲液(pH4.6)对其进行稀释。将25 μl各稀释样品加入96孔黑色透明底板的各孔中(三复管)，并使用多道移液器加入50μl8 mM的4-MU-α-Gal底物(在50mM柠檬酸钠/磷酸钠缓冲液中制备，pH4.6)。使用封带 将板密封并在37℃孵育1小时。通过加入125μl0.1M的NaOH终止酶反应，在荧光板 酶标仪上分别使用355nm激发和460nm发射波长读取释放的4-MU荧光。将假-转染样品 的4-MU荧光作为“背景”对照并从所有GLA样品中扣除。

实施例5

已知某些蛋白天然表达水平就非常高，而另一些则表达较低。尽管mRNA的丰度和稳 定性是转录水平的重要因素，而转录水平又影响蛋白表达，但是越来越明确地认识到信号 序列也对蛋白水平起着关键作用并且有助于这种不同蛋白的表达。人免疫球蛋白重链结合 蛋白(Bip)具有特定特性，其特别有利于开发优越的信号序列以改善重组蛋白的表达和分 泌。制备一种经修饰的Bip信号序列并将其与模型蛋白连接，以确定这种非天然的信号序 列是否能够改善模型蛋白的蛋白表达和分泌。特别地，延长疏水性的核以形成更长的α-螺 旋结构。预计在经修饰的Bip信号序列-1中疏水性结构域的延长具有若干优势。首先，经 修饰的(更长的)疏水性结构域将形成更长的α-螺旋并跨越整个核糖体出口通道，这样核 糖体蛋白Rpl17可以容易地对其进行识别，以促进其与其它关键ER蛋白如Sec61亚基， 和RAMP4更好地发生相互作用。其次，更长的α-螺旋疏水性结构域可以使该经修饰的Bip 信号序列能够与关键转位子蛋白如TRAM和Sec61亚基发生相互作用，以辅助新生成的多 肽在转位子孔处的有效定位，以促进必要的蛋白转位-感受态循环定位。第三，更长的α- 螺旋疏水性结构域可以使该经修饰的Bip信号序列能够更有效地移出水溶性转位子孔，并 进入脂质双分子层，这样使其能够以更快的速率被信号肽酶裂解。第四，经修饰的Bip信 号序列可以以更快速率离开转位子，以使得重组蛋白在其合成期间能够与其它重要蛋白如 寡糖转移酶、ER伴侣蛋白如Bip、蛋白二硫键异构酶和钙联蛋白更早发生相互作用，以改 善蛋白的折叠。任何或所有这些潜在的益处会改善蛋白的表达、折叠和输出细胞的速率。

可以进行其它修饰，包括在延长的疏水性结构域的两侧区域添加带电的残基，以进一 步增强其疏水性和辅助信号序列在转位子的正确定位。这些修饰旨在增强信号序列与某些 核糖体蛋白特别是Rpl17之间的相互作用，其将依次增强与转位子蛋白Sec61β、RAMP4 和TRAM的相互作用，以改善蛋白转位、蛋白表达和分泌。

生产编码野生型人GlcCerase的若干不同的DNA构建体，所述构建体含有天然 GlcCerase信号序列(WT GlcCerase)或人Bip信号序列(CBP201GlcCerase)或新型经修 饰的Bip信号序列-1(CBP204GlcCerase)。通过在～80％汇合的人细胞系(HEK293T)中 的瞬时表达实验，对这些构建体(1μg)进行检测。在72-小时时间段内每日一次收集条件 细胞培养基(20μl)，并使用4-MU-β-葡萄糖荧光底物检测GlcCerase酶活性以评估信号 序列对GlcCerase表达和分泌的作用。如图1所示，这两个信号序列均能够促进GlcCerase 表达和分泌至细胞培养基。但是，在转染后72小时，观察到设计的经修饰的Bip信号序 列-1(在CBP204GlcCerase中)产生的GlcCerase活性比WTGlcCerase高2倍。在假-转 染(空载体)阴性对照中可见基础活性，且已确证是重组GlcCerase的表达引起了酶活性 的增加。多次转染实验(n＞3)确证了新型信号序列增加GlcCerase的表达和分泌。

实施例6

蛋白合成受到可获得的营养成分(即，ATP、氨基酸、碳水化合物等)以及其它必需 细胞成分(例如，启动和延伸因子、tRNA、蛋白伴侣等)的较大影响。前者能够在再补给 过程中通过细胞培养基来增加或补充，后者的成分被限制在细胞内并且不能在蛋白生产 过程中补充。这些关键成分的耗竭导致显著的细胞应激，对于大多数蛋白而言，这导致新 的蛋白合成减少甚至暂停。有趣的是，在该应激期间，作为自适应细胞应答的一部分，某 些蛋白的表达维持且实际上增加，以帮助细胞返回稳态。尚不完全清楚细胞蛋白合成机制 是如何区分这些选定的蛋白以使其能够优先表达，但是据信信号序列在这一过程中发挥了 重要作用。由于Bip是一种重要的ER伴侣蛋白，其在应激期间保持表达以辅助重新建立 细胞稳态，因而我们预计这种经修饰的Bip信号序列将能够在其它蛋白的表达减少或抑制 的条件下维持异源重组蛋白的优先表达。为验证这一假设，我们使用WT GlcCerase和 CBP204GlcCerase在高细胞密度(～100％融合)的条件下转染HEK293T细胞培养物，并 且在63小时时间段内监测其表达和分泌。而且，在实验期间不更换细胞培养基以耗竭营 养成分(在实验的末期，以模拟在批处理期间再补给之前的低营养成分期)，以确定WT GlcCerase和CBP204GlcCerase的表达是否随营养成分的耗竭而改变。

我们的结果如图2所示：在这些实验条件下经过63小时时间段以后，含有经修饰的 Bip信号序列-1的CBP204GlcCerase的表达要好于含有其天然信号序列的WT GlcCerase。 在经过24小时、48小时和63小时后，CBP204GlcCerase的水平分别比WT GlcCerase 高1.9倍、2.1倍和2.5倍。当外推至72小时时，CBP204GlcCerase将比WTGlcCerase高 3.3倍。重要的是，之后的每天CBP204GlcCerase的表达维持在接近恒定的比率，而其分 泌的蛋白加倍。而与之相反的是，在稍后的时间点WTGlcCerase的表达率显著放缓。当比 较这两种酶的表达曲线的形状时这种差异是最明显的——CBP204GlcCerase是接近线性 的曲线和WTGlcCerase是非线性曲线，因为在稍后的时间点其表达率趋于平缓。这些数据 显示CBP204GlcCerase和WTGlcCerase的表达存在差异，其可能与对营养成分耗竭的应 答相关，并且随着孵育时间的延长这种差异将进一步增加。由于CBP204GlcCerase和WT GlcCerase之间仅有的差异在于信号序列，因而这些数据支持在非最佳细胞培养条件下经 修饰的Bip信号序列-1能够优先表达的假设。

实施例7

为检测经修饰的信号序列-1对不同模型蛋白表达和分泌的作用，构建编码野生型人酸 性α-葡萄糖苷酶(GAA)的DNA质粒，其含有其天然GAA信号序列(WTGAA)或者经 设计的Bip信号序列-1和GAA的氨基酸残基24-952(称为CBP218GAA)。在～2天的时 间段内通过在HEK293T中的瞬时表达，对这些DNA构建体进行检测以直接比较这些信号 序列对野生型GAA表达和分泌的作用。如图3所示，在转染43小时后，CBP218GAA在 培养基中分泌的GAA活性比WTGAA高2.5倍。在假-转染(空载体)阴性对照中可见基 础活性，且已确证在培养基中所观察到的酶活性是重组GAA表达的结果。由于CBP218 GAA和WTGAA之间的差异仅在于信号序列不同，所以这些结果显示在相同的实验条件下 经修饰的Bip信号序列-1(在CBP218GAA中)显著增加GAA的表达和分泌。

实施例8

Western印迹和ELISA检测

将通过Western印迹分析对待测蛋白的表达和分泌进行评估。简言之，收集瞬时转染 实验24、48或72小时后的条件细胞培养基，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)并在随后转移至硝酸纤维素膜。使用含4％(w/v)脱脂奶粉的TRIS-缓冲 盐/0.1％(v/v)吐温-20(TBST)在室温下振荡封闭膜1小时。然后使用经4％(w/v)脱 脂奶粉TBST适当稀释(例如，1∶5000)的一抗(例如，兔抗-人IGF-2)在室温下振荡孵 育膜1小时或4℃过夜。然后在室温下使用TBST振荡洗涤印迹超过1小时，期间需多 次更换缓冲液。然后使用经4％(w/v)脱脂奶粉TBST适当稀释(例如，1∶20,000)的酶 联二抗(例如，辣根过氧化物酶偶联的山羊抗-兔抗体)在室温下振荡孵育印迹1小时。然 后在室温下使用TBST振荡洗涤印迹超过1小时，期间需多次更换缓冲液。然后使用化学 发光底物在室温下孵育印迹5min，并通过成像系统或通过胶片成像以评估待测蛋白的表 达水平。

类似地，可以通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对待测蛋白的表达进行评估。简言之， 使用50μl在TRIS-缓冲盐(TBS)中的蛋白浓度为5μg/ml的一抗(例如，兔抗-人IGF-2) 包被96-孔免疫吸附板。然后使用200μl含4％(w/v)脱脂奶粉的TBST在室温下将这些 板封闭1小时。收集瞬时转染实验后24、48或72小时的条件细胞培养基，并于室温下在 这些板中孵育1小时。然后在室温下使用200μl TBST将这些板振荡洗涤超过1小时，期 间需多次更换缓冲液。然后使用经TBST适当稀释(例如，1∶20,000)的酶联二抗(例如， 辣根过氧化物酶偶联的山羊抗-兔抗体)在室温下孵育这些板1小时。然后在室温下使用 TBST洗涤这些板超过1小时，期间需多次更换缓冲液。然后使用显色底物(例如，3，3′，5，5′- 四甲基联苯胺，TMB)在室温下孵育这些板5-15min，并使用0.1M硫酸终止反应，在酶 标仪上于适当波长下(例如，450nm)读数，以评估待测蛋白的表达。