一种新喋呤纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

摘要

本发明公开了一种新喋呤（NPT）纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括：新喋呤校准品；偶联有链霉亲和素的纳米磁微粒悬浮液；生物素标记的新喋呤抗体；新喋呤抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；新喋呤质控品；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。另外本发明还公开了本发明试剂盒的制备方法。本发明试剂盒与现有试剂盒相比灵敏度高、可测定浓度范围宽、试剂有效期长、试剂成本低、操作简单、检测自动化程度高等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种新喋呤（NPT）纳米磁 微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

新喋呤(neopterin,NPT)是人体体液中最重要的一种喋啶类物质，化学名为2-胺基-4 羟基-6-(D-赤藓糖基1,2,3,三羟基丙基)喋呤，它是三磷酸鸟苷(GTP)代谢衍生的低分子 化合物、四氢生物喋呤生物合成过程中的一种中间代谢产物。是一种由IFN-γ刺激巨噬 细胞而产生的喋啶化合物。新喋呤是细胞介导免疫激活的敏感标志，其浓度增加见于与 细胞介导免疫激活有关的疾病，新喋呤的检测主要应用在肿瘤、创伤、免疫系统疾病、 内分泌系统疾病、消化系统疾病、循环系统疾病、感染及器官移植等临床检测上。

目前，临床领域应用的新喋呤检测方法主要是酶联免疫测定法。酶联免疫测定法具 备操作简单、价格低廉，精密度高，特异性好，准确性良好，是一种较好的微量物质检 测技术，但敏感性相对较低，板间差异大，测值重复性较差，所用标记酶与底物可定量 测定范围窄，及仪器测定范围窄等缺点。

化学发光免疫测定其研究起步于80年代初，快速发展应用于90年代，为当今最为 敏感的微量免疫测定法。

发明内容

本发明要解决的问题是提供新喋呤的化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法， 避免了测值重复性差，酶联免疫法灵敏度低，检测范围窄等缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：新喋呤（NPT）纳米磁微粒化学 发光免疫定量检测试剂盒，包括：新喋呤校准品；偶联有链霉亲和素的纳米磁微粒悬浮 液；生物素标记的新喋呤抗体；新喋呤抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣 根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；新喋呤质控品，质控品包括浓度 3nmoL/L的低值质控品和200nmoL/L的高值质控品；化学发光液A液和B液，A液为 5mmol/L，pH8.6的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度0.7g/L鲁米诺和终浓度 0.165g/L对碘酚；B液为0.675g/L过氧化脲；20倍浓缩洗液；反应管。

进一步，所述的纳米磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒 径10-50nm。

进一步，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

（1）新喋呤校准品的配制：

将新喋呤纯品用校准品稀释液稀释至工作浓度，分别为0，1，5，20，80，250nmoL/L； 所述校准品稀释液为含1%BSA的磷酸盐缓冲液；

（2）新喋呤质控品的配制：

用校准品稀释液将新喋呤纯品稀释至3nmoL/L和200nmoL/L，3nmoL/L作为低值质 控品，200nmoL/L作为高值质控品；

（3）纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

A、四氧化三铁纳米磁微粒制备

采用沉淀法制备四氧化三铁纳米磁微粒，具体制备方法如下：1）将FeCl₃·6H₂O和 FeCl₂·4H₂O以摩尔比2：1加入到蒸馏水中，剧烈搅拌溶解；2）在氮气环境下加0.5M氨 水于上述铁盐溶液中，调pH9-10，反应温度65℃，反应时间45min；3）反应结束后， 用蒸馏水洗涤至中性，弃上清，于60℃烘干，即得10-50nm的四氧化三铁纳米磁微粒；

B、纳米磁珠表面羧基的偶联

采用分散聚合法进行偶联，具体制备方法如下：取上述制备的纳米磁微粒超声分散 在10%PEG8000溶液中，得磁流体溶液，向磁流体溶液中按体积比1：10加入无水乙醇， 搅拌30min后，移入带有搅拌器，冷凝管，氮气入口的三颈瓶中，加入交联剂N,N’-亚甲 基双丙烯酰胺；在氮气的保护下，升温至60±1℃，恒温搅拌30min，之后依次加入磁流 体体积3%的过氧化苯甲酰，搅拌速度约为500rpm，磁流体溶液相同体积的苯乙烯，磁 流体溶液体积25%的丙烯酸，保持氮气气流,其余条件保持不变,反应8-10h，所得产物 静置，用蒸馏水反复洗涤，再用盐酸调节pH=1，浸泡24h，静置；再用蒸馏水反复洗涤， 除去未包覆的Fe₃O₄磁粉，把沉淀下来的产品放入真空干燥箱中50℃下干燥24h，得到 表面联有羧基的纳米磁微粒；

C、纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备，配制1L，方法如下：

取100mL0.1M MES缓冲液，加入10mg表面联有羧基的纳米磁微粒，室温搅拌 40min，之后加入3.5mg链霉亲和素，然后加入8mg/mLEDC溶液，2-8℃反应1h后，用 0.01M PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.01M PBS定溶至1L即可；

（4）生物素标记的新喋呤抗体的制备

A、新喋呤抗体的制备

新喋呤抗体按照常规免疫方法制备

B、生物素标记的新喋呤抗体的制备

取0.5mg新喋呤抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加 入60ug生物素，同时加入二甲基亚砜，使二甲基亚砜最终质量浓度大于5%，缓慢振荡， 避光反应2.5h；在上述溶液中加入250uL1M氯化铵溶液，常温避光反应60min；用0.01M PBS溶液在2～8℃下透析24h，期间换液3-4次；

（5）新喋呤抗体酶结合物的制备

采用改良高碘酸钠氧化法将新喋呤抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液 将其稀释至工作浓度1:5000，并加入10%酶稳定剂，储存于2～8℃；

（6）20倍浓缩洗液的配制

20倍浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/L  Tween-20和2%Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制

A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris-HCl，避 光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃，每种试剂各一瓶；

（9）对采用该方法制备的试剂盒进行物理检查，对准确度、剂量-反应曲线的线性、精 密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

本发明的原理是，采用双抗体夹心法测定血清或血浆中的NPT，在亲和素-纳米磁微 粒悬浮液中加入生物素-NPT抗体结合物，通过亲和素和生物素的亲和反应，形成磁微粒 -亲和素-生物素-NPT抗体复合物，加入样本和酶，通过抗原抗体反应，形成磁微粒-亲和 素-生物素-NPT抗体-NPT抗原-NPT抗体-HRP复合物，用磁场将复合物吸附在试管底部， 清洗掉游离的成分，加入底物工作液，在氧化剂作用下，HRP催化鲁米诺生成处于激发 态的氨基邻苯二甲酸离子，其恢复到基态时，释放出425nm的光子，于第5分钟测定各 加样孔的发光值RLU。样本的RLU与样本NPT浓度呈正相关。样本中的NPT浓度依据 由校准品NPT浓度和对应的RLU建立的Log（X）-Log（Y）数学模型进行定量，从而 检测人血清、血浆中的NPT含量。

本专利发明的新喋呤纳米磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒，具有以下优点：

（1）灵敏度高，本试剂盒的分析灵敏度不高于0.5nmoL/L。

（2）精密性良好，批内不精密度不高于5%，批间不精密度不高于10%。

（3）成本低，与市场上同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，具有临床应用 价值。

（4）稳定性良好，本产品在37℃可存放7天以上，在2～8℃可存放1年。

附图说明

图1是本发明的试剂盒测定新喋呤与酶免测定新喋呤的测定结果比较图，其中纵坐 标为本试剂盒测得的新喋呤值，横坐标为酶免试剂盒测定新喋呤值，两种方法相关系数 r=0.9574，直线方程y=0.9378x+0.6025。

图2是新喋呤抗体制备工艺过程。

具体实施方式

实施例1：制备新喋呤纳米磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒

（1）新喋呤校准品的配制：

将新喋呤抗纯品（购自US BIO公司）校准品稀释液稀释至工作浓度，分别为0，1， 5，20，80，250nmoL/L；

所述校准品稀释液为含1%BSA的磷酸盐缓冲液；

（2）新喋呤质控品的配制：

用校准品稀释液将新喋呤纯品稀释至3nmoL/L和200nmoL/L，3nmoL/L作为低值质 控品，200nmoL/L作为高值质控品；

（3）纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

A、四氧化三铁纳米磁微粒制备

采用沉淀法制备四氧化三铁纳米磁微粒，具体制备方法如下：1）将FeCl₃·6H₂O和 FeCl₂·4H₂O以摩尔比2：1加入到蒸馏水中，剧烈搅拌溶解；2）在氮气环境下加0.5M氨 水于上述铁盐溶液中，调pH9-10，反应温度65℃，反应时间45min；3）反应结束后， 用蒸馏水洗涤至中性，弃上清，于60℃烘干，即得10-50nm的四氧化三铁纳米磁微粒；

B、纳米磁珠表面羧基的偶联

采用分散聚合法进行偶联，具体制备方法如下：取上述制备的纳米磁微粒超声分散 在10%PEG8000溶液中，得磁流体溶液，向磁流体溶液中按体积比1：10加入无水乙醇， 搅拌30min后，移入带有搅拌器，冷凝管，氮气入口的三颈瓶中，加入交联剂N,N’-亚甲 基双丙烯酰胺；在氮气的保护下，升温至60±1℃，恒温搅拌30min，之后依次加入磁流 体体积3%的过氧化苯甲酰，搅拌速度约为500rpm，磁流体溶液相同体积的苯乙烯，磁 流体溶液体积25%的丙烯酸，保持氮气气流,其余条件保持不变,反应8-10h，所得产物 静置，用蒸馏水反复洗涤，再用盐酸调节pH=1，浸泡24h，静置；再用蒸馏水反复洗涤， 除去未包覆的Fe₃O₄磁粉，把沉淀下来的产品放入真空干燥箱中50℃下干燥24h，得到 表面联有羧基的纳米磁微粒；

C、纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备，配制1L，方法如下：

取100mL0.1M MES缓冲液，加入10mg表面联有羧基的纳米磁微粒，室温搅拌 40min，之后加入3.5mg链霉亲和素，然后加入8mg/mLEDC溶液，2-8℃反应1h后，用 0.01M PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.01M PBS定溶至1L即可；

（4）生物素标记的新喋呤抗体的制备

A、新喋呤抗体的制备

按照图2的工艺过程制备新喋呤抗体。

B、生物素标记的新喋呤抗体的制备新喋呤抗体

取0.5mg新喋呤抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加 入50ug生物素，同时加入二甲基亚砜，使二甲基亚砜最终质量浓度大于5%，缓慢振荡， 避光反应2.5h；在上述溶液中加入250uL1M氯化铵溶液，常温避光反应30-60min；用 0.01M PBS溶液在2～8℃下透析24h，期间换液2-4次；

（5）新喋呤抗体酶结合物的制备

采用改良高碘酸钠氧化法将新喋呤抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液 将其稀释至工作浓度1:5000，并加入10%酶稳定剂，储存于2～8℃；

改良过碘酸钠氧化法步骤包括：

A：HRP活化

1）配置10mg/mL HRP溶液；

2）配置12.8mg/mL过碘酸钠NaIO₄溶液；

3）将上述1和2配制溶液按体积比1：1混匀，4℃避光反应30min；

4）配置浓度为20uL/mL的乙二醇水溶液，与上述溶液3以相同体积混合，常温避 光反应20min，活化即完成，放-20℃保存（保存时间不超过3个月）。

B、NPT单克隆抗体标记

1）将待标记原料装入透析袋中，用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，透析30min；

2）将标记原料与活化的HRP按质量比1:2进行混合，之后用0.05M碳酸盐缓冲液 于4℃透析24h（期间换液2-3次）；

3）配置浓度为2mg/mL的NaBH₄水溶液，按1mgHRP加80uL配制好的NaBH₄水 溶液的比例进行混合，并于4℃避光反应2h；

4）将上述步骤3完成的标记液用0.01M PBS于4℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃ 保存。

酶稀释液中包括10mL/L2M NaOH，15g/L NaCl，10g/LBSA，5g/L Dextran T-2000 （购自Sigma公司），1.05g/L Triton X-100（购自Sigma公司），2.5mL/L硫酸庆大霉素， 1mL/L胭脂红（胭脂红为粉末固体，配制成浓度40mg/mL以后使用），2g/L Tween-20 （购自Sigma公司），1mL/L ProClin300（购自Sigma公司）；

（6）20倍浓缩洗液的配制

20倍浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/L  Tween-20和2%Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制

A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris-HCl，避 光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃，每种试剂各一瓶；

（9）对采用该方法制备的试剂盒进行物理检查，对准确度、剂量-反应曲线的线性、精 密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

实施例2：本发明试剂盒的检查

（1）物理检查：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。

（2）剂量-反应曲线的线性：用双对数数学模型拟合，剂量-反应曲线在0-2500nmoL/L 浓度范围内相关系数r绝对值不低于0.9900。

（3）分析灵敏度：试剂盒分析灵敏度不高于0.5nmoL/L。

（4）精密度：10孔平行测定高值和低值质控品，计算测定结果的平均浓度（）与标 准差（SD），批内不精密度使用3批产品进行3次试验， 计算测定结果的平均浓度（）与标准差（SD），批间不精密度结果应符合批内不精密度（CV%）应不高于5%；批间不精密度（CV%）应不高于10%。

（5）质控品的测定值：平行测定10孔高值和低值的质控品，用Log(X)-Log(Y)数学模 型拟合，质控品测值应在允许范围内，低值质控品测值在2.4-3.6nmoL/L，高值质控品测 值在1600-2400nmoL/L。

（6）稳定性：37℃放置7天，测定值应符合上述各项要求。

实施例3：本发明试剂盒的使用方法

（1）将待检试剂盒在室温（18～25℃）下平衡30分钟。

（2）配制洗液：用蒸馏水将浓缩洗液按1:20稀释（1mL洗液加19mL蒸馏水）。若浓 缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37℃，待结晶溶解后再进行稀释。

（3）配制发光液：使用前5分钟取适量发光液A与发光液B等体积混合。

（4）将反应管编号，向试管中依次加入20uL校准品或血清标本、50uL磁性颗粒-链霉 亲和素悬浮液、50uL生物素-新喋呤抗体结合物、100uL新喋呤抗体酶结合物，37℃下振 荡反应30min，将试管架置于磁分离器上分离5min，然后倒出上清液，加入500uL洗液， 充分混匀后，于磁分离器上分离，倒出洗液，重复3次，在各管中加入化学发光底物液 100uL，充分混匀，暗置5min，在管式化学发光仪上测定各管的发光值（RLU），以校准 品浓度的Log值为横坐标，以发光值的Log为纵坐标，绘制标准曲线，根据血清标本的 发光值即可计算出新喋呤的浓度。

实施例4：本试剂盒的方法学评价结果

检测范围：范围为1-2500nmoL/L，对于浓度大于2500nmoL/L的标本应先进行稀释后再 进行测定。

灵敏度：0.5nmoL/L。

精密度：小于5%。

准确性：回收率的平均值在0.90～1.10范围内。

质控品测值：低值质控品QcL和高值质控品QcH的测值均在允许范围内，低值质控品测 值在2.4-3.6nmoL/L，高值质控品测值在1600-2400nmoL/L。

稳定性：将试剂盒中各试剂组分于37℃下放置7d，稳定性良好。

实施例5：本试剂盒的临床对比实验

本专利发明的试剂盒已进行了临床考核，本次临床试验的样本总数280例，先以新 喋呤酶免检测试剂盒测试后，再用本专利发明的试剂盒（化学发光）进行测定，结果表 明，直线方程为y=0.9378x+0.6025，相关系数r=0.9574。可见本方法制备的试剂盒与 酶免测值有较好的一致性。以SPSS13.0统计分析软件对相关系数进行t检验（检验水准 α=0.05），P<0.001，两种方法测定的新喋呤值的相关密切程度是显著性的，可见两种 方法测定的新喋呤值密切相关，说明试剂盒的诊断能力较强，可推广临床应用。